Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

Le dépistage des bibliothèques mutantes et les études transcriptomiques des pathogènes intracellulaires peuvent aider à répondre à des questions clés sur les adaptations génomiques et réglementaires des agents pathogènes d’intérêt qui sont utilisés pour survivre à l’intérieur de l’hôte. Les principaux avantages de ces techniques sont qu’il s’agit de techniques d’investigation à grande échelle et qu’elles fournissent un aperçu objectif de l’adaptation à la vie intracellulaire. Les implications de ces techniques s’étendent vers la thérapie de Mycobacterium abcès qui s’associent à cette maladie en donnant un aperçu des cibles potentielles pour la thérapie vaccinale.

Commencez par la culture de l’amibe Acanthamoeba castellani, ou Ac, en 30 millilitres de Peptone Yeast Glucose medium dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés à température ambiante. Après une heure, utilisez une pipette de 25 millilitres pour enlever le supernatant et lavez les cellules trois fois avec 10 millilitres de tampon Ac sans carbone ni azote par lavage. Après le dernier lavage, détachez l’amibe du fond du flacon avec une seule secousse vigoureuse, et ajustez les cellules dans un tube falcon, à cinq fois 10 à la concentration de cinq amibe par mil dans le tampon ac frais.

Graine cinq fois 10 à l’amibe quatre par puits dans une assiette de 96 puits. Placez la plaque à 32 degrés Celsius pendant une heure sans trembler, pour permettre aux tropho-zoites flottants d’amoeba d’adhérer aux puits. Pendant ce temps, réchauffer les bactéries sur la glace, et ajouter cinq microlitres de la bactérie décongelée à chaque puits à la fin de l’incubation.

Après 1,5 heure à 32 degrés Celsius, jeter le supernatant en inversant la plaque sur une pile de gaze stérile dans un plateau métallique stérilisé sous un capot de fumée. Lavez chaque puits trois fois avec 200 microlitres d’Ac moyen frais par puits. Après le dernier lavage, incuber la co-culture avec 20 microlitres de milieu frais complétés avec de l’amikacine par puits, pour éliminer les mycobactéries extracellulaires restantes pendant deux heures.

Suivi de trois lavages en ac frais moyen, comme vient de le démontrer. Ensuite, ajouter 200 microlitres de milieu, complétées par de l’amikacine fraîche à chaque puits, suivie de l’ajout de cinq fois 10 à la bactérie Escherichia coli inactivée par la chaleur. Après 48 heures, lyse les cellules avec 10 microlitres de 10% de sulfate de dodecyl de sodium par puits, pendant 30 minutes à 32 degrés Celsius, et répandent cinq microlitres du lysate sur les plaques de Columbia Agar contenant 5% de sang de mouton.

Diluer davantage les lysates en ajoutant 25 microlitres d’eau stérile à chaque goutte. Lorsque tous les lysates ont été plaqués, sceller les plaques avec du film de paraffine en plastique, et incuber les cultures pendant trois à quatre jours à 37 degrés Celsius. Lorsque des colonies apparaissent sur les plaques, photographiez les cultures et identifiez les mutants altérés pour la croissance intracellulaire par les dépôts ayant le plus faible nombre de colonies bactériennes.

Pour l’extraction intracellulaire d’ARN de mycobactéries, cultivez d’abord M.abscessus dans le milieu de 7H9 complété avec le glycérol et le glucose à la phase mi-exponentielle dans les tubes de millilitres à 120 RPM. À la fin de la culture, laver les bactéries deux fois avec 10 millilitres de tampon Ac par lavage, et mesurer l’O.D.600 pour estimer la concentration de bactéries. Ensuite, ajoutez 8,5 fois 10 aux huit mycobactéries à 8,5 fois 10 aux six amibettes dans 10 millilitres de milieu ac frais pour une incubation d’une heure à 30 degrés Celsius et 80 RPM.

À la fin de l’incubation, récolte les cellules par centrifugation, et laver la pastille trois fois dans 10 millilitres de tampon ac frais par lavage dans les mêmes conditions centrifugeuses. Puis re-suspendre les cellules en 10 millilitres de tampon ac frais complété avec de l’amikacine pour éliminer toutes les bactéries extracellulaires, et incuber les cellules pendant quatre heures à 30 degrés Celsius et 80 RPM, suivie de deux lavages dans tampon Ac frais. Après le dernier lavage, suspendre à nouveau l’amibe infectée en quatre millilitres de solution froide trois, complétée par 280 microlitres de bêta mercaptoéthanol pour perturber l’amibe sur la glace pendant 10 minutes.

À la fin de l’incubation, centrifugeuse de la cellule lysate pour pelleter les bactéries intracellulaires libérées, et de suspendre à nouveau la pastille bactérienne dans un millilitre de solution froide trois. Il est important d’enlever tout le supernatant pour éviter la contamination par l’ARN amibe ou les protéases qui auraient pu faire les échantillons. Récoltez les bactéries libérées avec une deuxième centrifugation et suspendez la pastille en un millilitre de tampon d’extraction.

Puis incuber pendant 24 heures à 80 degrés Celsius négatifs. Transférer la solution mycobactérienne dans deux tubes à vis millilimétriques contenant des perles de zirconium jusqu’à la marque de gradation de 500 microlitres, et stocker les tubes pendant encore 24 heures à 80 degrés Celsius négatifs pour faciliter l’activation syn ARN et la dissolution cellulaire. Le jour de l’analyse, décongeler les échantillons sur la glace et lyser les cellules avec deux cycles d’homogénéisation à 6000 RPM pendant 25 secondes, suivi d’une homogénéisation ronde à 6000 RPM pendant 20 secondes.

Entre chaque cycle d’homogénéisation, refroidir les échantillons sur la glace pendant une minute pour éviter la dégradation de l’ARN. Après la troisième ronde d’homogénéisation, refroidir les échantillons sur la glace pendant 20 minutes et ajouter 200 microlitres de chloroforme dilués dans de l’alcool isoamyle à chaque tube. Vortex pendant une minute, puis centrifuger les échantillons, et ajouter 0,8 millilitres d’isopropanol froid à la phase aqueuse pour une incubation de deux à trois heures à 20 degrés Celsius négatifs.

À la fin de l’incubation, centrifugez à nouveau les échantillons et lavez les granulés dans 500 microlitres d’éthanol froid à 70 % sans mélange. Retirez immédiatement l’éthanol par centrifugation. Aspirez le supernatant pour sécher les granulés dans un concentrateur centrifuge, et suspendez les granulés dans 100 microlitres d’eau exempte d’ADN/ARN.

L’extraction mycobactérienne de MRNA telle que démontrée, permet l’évaluation des familles de gènes induites et réprimées en ressaisissant les gènes en fonction de leur rôle dans la réponse à un environnement limité dans sa source de nutriments et de minéraux, ou dans un environnement hypoxique ou acide. Dans la résistance au stress oxydatif et nitrosatif, ou dans l’expression de facteurs de virulence en réponse à l’amibe environnementale. Tout en essayant ces procédures, il est important de se rappeler d’effectuer la culture et l’isolement de l’ARN des échantillons contrôlés et infectés en même temps pour éviter les effets de lot.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage à double ARN peuvent être préformées pour répondre à d’autres questions sur les interactions avec les pathogènes de l’hôte. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie vers la virulence des mycobactéries dans le modèle hôte de l’amibe. N’oubliez pas que le travail avec l’amibe pourrait être extrêmement dangereux, car l’amibe pourrait se transformer en kystes si vous ne suivez pas les étapes décrites dans la procédure.