Imagerie de cellules vivantes de fluorescence de Cell Cycle végétatif complet de la lente croissance sociale bactérie Myxococcus xanthus

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire bactérienne, telles que comment les cellules répliquent-elles leur ADN, comment se développent-elles et comment se divisent-elles. Le principal avantage de cette technique est que les cellules bactériennes vivantes peuvent être surveillées pendant au moins 24 heures au microscope et que la technique ne nécessite pas d’équipement spécial. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la croissance et de la division de Myxococcus xanthus, elle peut également être facilement appliquée à d’autres bactéries à croissance lente.

Pour commencer, réappliquez une seule colonie de M. xanthus dans 500 microlitres de 1 % de CTT, complétée par des antibiotiques, dans un tube stérile et transférez toute la suspension dans un erlenmeyer de 50 millilitres contenant cinq millilitres de 1 % de CTT. Préparez une solution de microscopie d’agarose à 1 % contenant 0,2 % de CTT en mélangeant un gramme d’agarose avec 80 millilitres de tampon TPM et 20 millilitres de milieu à 1 % CTT. Passez la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit fondue.

Remplissez une boîte de Pétri avec environ 60 millilitres d’agarose fondu et laissez-la refroidir à température ambiante. Préchauffez le tampon d’agarose à 32 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes avant de l’utiliser. Ensuite, placez une lamelle en verre stérile sur un cadre en plastique ou en métal qui a un trou au milieu, puis utilisez du ruban adhésif pour fixer la lamelle au cadre.

Ajoutez 10 à 20 microlitres de cellules de M. xanthus à croissance exponentielle sur la lamelle. Pour ajouter des microsphères fluorescentes comme marqueurs repères des cellules, utilisez un tampon TPM pour diluer les microsphères à 1:100. Secouez soigneusement la suspension de la bille et ajoutez cinq à 10 microlitres dans les cellules.

Dans le grand tampon d’agarose à 1 % préchauffé, découpez un petit tampon d’environ la taille de la lamelle et placez-le sur les cellules. Placez ensuite une lamelle sur le dessus du tampon pour éviter l’évaporation et maintenir les cellules dans un environnement humide. Incuber l’échantillon de microscopie à 32 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes pour laisser les cellules se fixer au fond du tampon d’agarose avant les enregistrements de microscopie en accéléré.

Pour effectuer une microscopie time-lapse, allumez le microscope et démarrez le logiciel de contrôle du microscope. Sélectionnez le bon objectif, les bons miroirs et le bon filtre pour acquérir des images en contraste de phase ainsi que des images de protéines fluorescentes vertes, rouges fluorescentes ou jaunes. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion de haute qualité sur la lentille de l’objectif et au fond de l’échantillon pré-incubé à 32 degrés Celsius.

Avec le côté du trou vers l’objectif, placez le cadre métallique avec l’échantillon sur la platine du microscope, puis fixez solidement l’échantillon dans le support de platine. Concentrez-vous sur les cellules en rapprochant la platine dans la direction Z de l’objectif. Lorsque l’huile de l’objectif et l’échantillon entrent en contact, déplacez l’étage dans la direction X/Y.

Passez au logiciel Metamorph et ouvrez l’outil Acquérir. Sélectionnez Contraste de phase dans la liste déroulante Paramètres et réglez le temps d’exposition sur 100 millisecondes. Cliquez sur Afficher en direct, Amener la cellule dans le plan focal et déplacez la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce que plusieurs cellules uniques soient visibles dans le champ de vision.

Assurez-vous qu’au moins une microsphère fluorescente se trouve dans la zone de vision pour aligner ultérieurement les images acquises. Ensuite, ouvrez l’assistant d’acquisition multidimensionnelle du logiciel de contrôle du microscope pour configurer une expérience en accéléré qui permet au microscope d’acquérir des images à plusieurs longueurs d’onde et positions de platine si nécessaire. Dans l’onglet principal, activez time-lapse et Multiple Wavelengths.

Des onglets supplémentaires apparaîtront sur le côté gauche de la fenêtre. Cliquez sur l’onglet Enregistrement et sélectionnez Répertoire pour sélectionner un dossier vide sur le disque dur de l’ordinateur afin d’enregistrer les images acquises, puis activez l’option Incrémenter le nom de base si le fichier existe pour vous assurer que les jeux de données consécutifs n’écrasent pas les précédents. Donnez à l’expérience un nom avec la date et le nom de la souche ou le titre de l’expérience.

Cliquez sur l’onglet time-lapse pour ajuster les paramètres de time-lapse, puis réglez l’intervalle de temps sur 20 minutes et réglez la durée sur 24 heures. Le nombre de points de temps changera automatiquement. Maintenant, cliquez sur l’onglet Longueurs d’onde.

Sélectionnez le nombre de longueurs d’onde à acquérir pour chaque image à chaque point temporel en modifiant le nombre. Sélectionnez Autoriser la position AF mémorisée par le matériel distincte pour chaque longueur d’onde. Cliquez sur l’onglet Première longueur d’onde en haut.

Dans la liste déroulante Éclairage, sélectionnez Contraste de phase. Sélectionnez 100 millisecondes pour l’exposition et, dans la liste déroulante Acquérir, sélectionnez Chaque point temporel. Désactivez l’exposition automatique dans la liste déroulante en sélectionnant Jamais, puis sélectionnez Chaque acquisition dans la liste déroulante pour Mise au point automatique.

Réglez l’exposition pour chaque longueur d’onde comme nous venons de le démontrer à l’aide des paramètres suivants. Ensuite, pour acquérir des images à partir de plusieurs positions de scène, dans l’onglet Principal, activez plusieurs positions de scène. Cliquez sur l’onglet Scène et cliquez sur le bouton En direct pour regarder le champ de vision.

Déplacez la platine dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’une zone d’intérêt se trouve dans le champ de vision. Enregistrez les coordonnées X et Y dans l’onglet Étape en cliquant sur le signe plus. Déplacez à nouveau la scène dans la direction X/Y jusqu’à ce qu’un nouveau retour sur investissement soit trouvé et enregistrez à nouveau les coordonnées en cliquant sur le signe plus.

Continuez jusqu’à ce que le nombre souhaité de régions soit enregistré. Vérifiez une fois de plus que les cellules sont nettes en cliquant sur les différentes positions X et Y enregistrées, et démarrez l’autofocus matériel en cliquant sur AFC pour maintenir la position Z enregistrée constante tout au long de l’expérience. Démarrez l’enregistrement en accéléré dans l’assistant d’acquisition multidimensionnelle du logiciel de contrôle du microscope en cliquant sur Acquérir.

Vérifiez que les cellules sont toujours nettes après les premiers points temporels des enregistrements en accéléré afin de maximiser la qualité des images et de refaire la mise au point si nécessaire. Pour générer des vidéos time-lapse et effectuer l’alignement de l’image, démarrez le logiciel d’analyse et de traitement d’image. Ouvrez les images en tant que pile en cliquant sur Examiner les données multidimensionnelles, Sélectionner le fichier de base, Sélectionner le répertoire, puis ouvrir le dossier contenant les données multidimensionnelles.

Vérifiez le jeu de données et cliquez sur Afficher. L’ensemble de données sera affiché sous forme d’images uniques à partir du point temporel un jusqu’à la fin. Activez la longueur d’onde pour la création d’une pile, puis sélectionnez toutes les images qui doivent se trouver dans la pile et cliquez sur Charger les images.

Répétez cette étape pour toutes les longueurs d’onde et enregistrez les piles terminées. Activez la pile d’images qui doit être corrigée pour la dérive. Ouvrez l’outil d’alignement à l’aide des applications, Alignement automatique.

Cochez Pile comme source pour les images et Premier plan/point temporel comme plan de référence, puis sélectionnez la pile avec le bouton Pile source et cliquez sur Appliquer. Une fois l’alignement automatique terminé, enregistrez la pile alignée. Pour générer un film aux formats MOV ou AVI, ouvrez la fonction Réaliser un film via Stack, Make Movie.

Sélectionnez les enregistrements time-lapse à l’aide du bouton Pile source, puis sélectionnez le format de sortie, la fréquence d’images, le nombre d’images, puis cliquez sur Enregistrer. Dans cette expérience time-lapse avec des cellules mobiles de type sauvage DK1622, des images en contraste de phase ont été acquises toutes les cinq minutes pendant 24 heures. Comme prévu, les cellules étaient mobiles et se déplaçaient principalement en groupes.

Dans l’imagerie de cellules vivantes en contraste de phase avec des cellules Delta-mgIA non mobiles, la croissance et la division des cellules individuelles ont été suivies pendant la formation de la microcolonie. Lorsque les images ont été acquises toutes les cinq minutes pendant 24 heures, il a été possible de quantifier le temps interdivision de 235 plus ou moins 50 minutes à une résolution de cellule unique. Pour déterminer si les cellules se développent normalement tout en suivant les protéines marquées par yfp sur de longues périodes, les cellules de M. xanthus exprimant ParB-YFP ont été suivies.

ParB-YFP a d’abord formé un seul cluster dans la région cellulaire subpolaire. Peu de temps avant ou après la division cellulaire, l’amas s’est dupliqué, un amas restant à l’ancien pôle cellulaire et le second se déplaçant vers le nouveau pôle cellulaire. Dans cette expérience, les cellules non mobiles exprimant FtsZ-gfp ont montré une forte accumulation de FtsZ-gfp au niveau de la cellule médiane, ce qui dicte la position de la division cellulaire.

FtsZ-gfp a formé un cluster au milieu de la cellule, principalement dans les cellules plus longues. Deux heures après la division cellulaire, FtsZ-gfp s’est accumulé au milieu de la cellule dans les cellules filles. Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée en routine sur Myxococcus xanthus ainsi que sur toute autre bactérie à croissance lente.

Lors de la mise en place de cette procédure pour une bactérie, il est important d’ajuster la composition du milieu de croissance dans la plaque de gélose pour répondre aux besoins de croissance spécifiques de cette bactérie. Pour toute bactérie, il est important de déterminer les conditions d’imagerie optimales telles que le temps d’exposition, l’intensité lumineuse et la fréquence d’imagerie pour éviter la phototoxicité. De plus, pour toute protéine marquée par fluorescence, les conditions d’imagerie doivent être ajustées pour éviter la phototoxicité et le photoblanchiment.