Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’autophagie, telles que la façon dont la formation d’autophagosomes est régulée et comment divers traitements et conditions cellulaires affectent l’autophogie en vrac. Le principal avantage de cette technique est qu’elle mesure la séquestration endogène des marchandises. Par conséquent, la méthode est largement applicable et indépendante de la surexpression artificielle ou de l’introduction de sondes de cargaison.

Paula Szalai et Morten Luhr, doctorants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez des cellules adhérentes dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent une couche cellulaire presque confluente.

Après cela, lavez les cellules avec trois millilitres de PBS à 37 degrés Celsius à pH 7,4. Retirez le PBS et remplacez-le par trois millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA. Incuber dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans sept millilitres de milieu de culture contenant 10 % de FBS, puis transférez-les dans un tube stérile de 50 millilitres. À l’aide d’une pointe de pipette de 0,5 à 20 microlitres, transférez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation contenant 10 microlitres de bleu de trypan. Utilisez la même pointe de pipette pour remplir immédiatement une lame de chambre de comptage et compter les cellules dans un compteur de cellules automatisé.

Utilisez ensuite un milieu de culture contenant 10 % de FBS pour préparer une dilution appropriée de la suspension cellulaire. À l’aide de techniques aseptiques, ensemencez un millilitre de suspension cellulaire diluée dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 12 puits. Incuber dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité cellulaire souhaitée soit atteinte.

Aux traitements expérimentaux souhaités, en laissant un ensemble de puits non traités, afin de définir les niveaux de fond de LDH sédimentable. Trois à quatre heures avant la récolte, ajoutez une quantité saturante de bafilomycine A1, inhibiteur de post-séquestration, dans chaque puits. Incuber dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

A la fin de la période de traitement, vous aspirez pour aspirer le fluide. Ajoutez 200 microlitres de solution de détachement cellulaire préchauffée à 37 degrés Celsius dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Ajoutez 500 microlitres de PBS à température ambiante à pH 7,4 contenant 2 % de BSA dans chaque puits. À l’aide d’une pipette, remettre chaque puits en suspension jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’amas de cellules visibles. Après cela, transférez immédiatement la suspension cellulaire dans chaque puits dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 millilitre sur de la glace.

Centrifugez les tubes à 400 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour sédimenter les cellules. Utilisez l’aspiration pour aspirer complètement le surnageant, en laissant les granules de cellules aussi sèches que possible. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de solution contenant 10 % de saccharose dans de l’eau ultra pure dans chaque tube.

À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille cellulaire pour obtenir une suspension presque unicellulaire. Transférez cette suspension sur une cuvette d’électroporation de quatre millimètres. Placez la cuvette dans un électroporateur à ondes de décroissance exponentielle et déchargez une seule impulsion électrique à 800 volts, 25 microfarads et 400 ohms.

À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, transférez la cellule dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 400 microlitres de solution de saccharose tamponnée au phosphate glacée et mélangez brièvement par pipetage. Répétez ce processus de resuspension, d’électro-perturbation et de mélange pour chaque échantillon. Si vous effectuez la procédure pour la première fois, assurez-vous de vérifier l’efficacité et la sélection de l’électro-perturbation de la membrane plasmique, comme décrit dans le texte.

Pour obtenir des fractions de LDH sédimentées, prélevez 550 microlitres de chaque solution de débridage cellulaire dilué et transférez-la dans son propre tube de microcentrifugation de deux millilitres contenant 900 microlitres de tampon de remise en suspension glacé avec 0,5 % BSA et 0,01 % Tween 20. Pipeter brièvement pour mélanger. Centrifuger à 18 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 45 minutes pour produire des granulés contenant de la LDH sédimentée.

À l’aide de l’aspiration, aspirez soigneusement le surnageant pour laisser les granulés aussi secs que possible. Conservez les échantillons de LDH sédimentés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. Pour les fractions totales de LDH, transférez 150 microlitres de chacune des solutions de perturbation cellulaire diluée dans son propre nouveau tube.

Conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de les analyser. Décongeler les échantillons de LDH sédimentés et les échantillons de LDH totale sur de la glace. Une fois décongelé, ajoutez 300 microlitres de tampon de remise en suspension glacé contenant 1,5 % de Triton X-405 au total des échantillons de LDH.

Faites tourner les échantillons sur un rouleau dans une chambre froide pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 750 microlitres de tampon de remise en suspension glacé contenant 1 % de Triton X-405 aux échantillons sédimentés de LDH. À l’aide d’une pipette, les granulés sont remis en suspension jusqu’à ce que la solution soit homogène.

Centrifugez tous les échantillons à 18 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour sédimenter les débris cellulaires non dissous. Une fois la centrifugation terminée, placez les échantillons sur de la glace. Déterminer les niveaux de LDH dans les surnageants à l’aide d’un test enzymatique classique tel que décrit dans le texte ou de l’un des nombreux kits disponibles dans le commerce.

Dans cette étude, l’activité de séquestration autophagique en vrac est surveillée dans un certain nombre de lignées cellulaires de mammifères différentes. Comme le montre ici, la séquestration basale et induite par la famine de LDH et les cellules LNCaP sont complètement abolies par l’inhibiteur de la pan-PI3-kinase, 3MA. L’inhibiteur sélectif de la PI3-kinase de classe trois, le SAR-405 et l’inhibiteur de la pompe calcique du RE, la thapsigargin.

Dans les cellules HEK293, la séquestration de la LDH dans des conditions de famine est fortement réduite à la fois par la thapsigargine et par l’inhibiteur d’ULK, MRT 67307. De plus, la séquestration de LDH induite par la famine s’avère constamment inhibée par la 3MA dans les autres lignées cellulaires observées. Ensuite, divers MEF d’inactivation du gène ATG sont utilisés pour tester si les gènes liés à l’autophagie déclarés essentiels à la formation des autophagosomes sont nécessaires pour la séquestration de la LDH.

Comme on peut le voir, la séquestration de la LDH induite par la famine est abolie dans les MEFS knock-out ATG5. De plus, il est également émoussé dans les MEF knockout ATG7 et ATG9A. Enfin, les effets de l’inactivation médiée par l’ARNi des transcrits clés du gène ATG sont déterminés.

constate que la transfection avec un ATG9A ciblant un siRNA ou avec un ciblage combiné d’ULK1 et d’ULK2 réduit fortement la séquestration de la LDH dans les cellules LNCaP. Lors de cette procédure, il est important d’être précis dans toutes les étapes de pipetage. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que le test de dégradation des protéines à longue durée de vie, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que : y a-t-il eu des modifications observées de l’activité de séquestration entraînant des changements comparables dans l’activité de dégradation autophagique.

Après avoir établi cette méthode dans des lignées cellulaires de mammifères, nous l’avons utilisée pour démontrer que l’autophagie en vrac est indépendante de la famille des protéines LC3 et nécessite plutôt des GABARAP. Cela souligne l’importance d’utiliser des méthodes indépendantes de LC3 pour surveiller l’activité de l’autophagie.