Name: Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez un protocole fiable pour mesurer l'activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Cette méthode quantifie la LDH endogène sans sondes artificielles.

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Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil norvégien de la recherche, l’Université d’Oslo, le Anders Jahre Foundation, la Fondation de Nansen et l’héritage dans la mémoire de Henrik Homan. Nous remercions m. Noboru Mizushima pour le ATG5 + / + MEFs et ATG5-/-MEFs, Dr Masaaki Komatsu pour le ATG7 + / + MEFs et ATG7-/-MEFs et Dr Shizuo Akira pour le ATG9A + / + MEFs et ATG9A-/-MEFs. Nous remercions Frank Sætre pour assistance technique et Dr par O. Seglen pour des débats constructifs méthodologiques.

1. cellule ensemencement et traitement
<ol><li>
Cellules adhérentes de la culture dans des flacons de culture de tissu de2 cm 75 dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C, en utilisant le milieu de culture privilégié pour le type de cellule en question. Laissez les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent une couche de cellules de proximité-anastomosé. Remarque : Utiliser un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) pour LNCaP, HEK293, fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs), BJ, MCF-7 et cellules pre-1.<ol>
<li>Laver les cellules avec 3 mL 37 ° C tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4. Remplacez les PBS avec 3 mL de 0,25 % (p/v), la trypsine-éthylènediaminetétraacétate (EDTA) et incuber la fiole dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (2 à 5 min).</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules individuelles avec 7 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS. Mélanger une quantité de suspension de cellules de 10 µL à 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan dans un tube de microcentrifuge, à l’aide d’une pointe de pipette 0,5 – 20 µL. Utiliser la même pipette pour pourvoir immédiatement une diapositive comptage de la chambre et compter les cellules dans un compteur de cellules automatisées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer une dilution (voir note ci-dessous) de la suspension cellulaire en faisant étape 1.1.2 culture moyenne contenant 10 % FBS et semences 1 mL de la suspension cellulaire dilué dans chaque puits d’une plaque (superficie ~3.8 cm2) en culture de tissu de 12 puits utilisant aseptique technique. Permettre la croissance dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que la densité de la cellule souhaitée est atteinte, par exemple, de 60 à 90 % confluence à la récolte. Remarque : La dilution appropriée de la suspension cellulaire qui donnera à la confluence de la cellule souhaitée à la récolte varie de type cellulaire de type cellulaire, ainsi que selon la durée et le type de traitements expérimentaux. Par conséquent, cela doit être évaluée empiriquement dans chaque cas.<ol>
<li>Pour des expériences qui doivent être tous deux traitement et récolté 2 jours après le semis, semences 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, ou MCF-7 cellules, MEFs4 5 x 10, 4 x 105 BJ ou 1,5 x 105 pre-1 éléments dans chaque puits de la plaque de 12 puits.</li>
		<li>Pour les cellules qui adhèrent librement, enduire les plaques avec le type de revêtement recommandé pour le type de cellule en question. Pour les cellules LNCaP (et HEK293) utiliser plaques recouvertes de poly-D-lysine (PDL).</li>
		<li>À cette fin, ajouter 500 µL PDL à 2,5 µg/mL stérile H2O dans chaque puits et incuber les boîtes dans un environnement stérile pendant 30 min à température ambiante (20 à 25 ° C). Retirer le PDL avec aspiration et laver chaque bien brièvement avec 1 mL stérile H2O. Remarque : En général, l’étape 1.2.1 est faite sans traitement expérimental. Toutefois, si vous effectuez l’ARNi, il peut être pratique démarrer une transfection inverse avec le semis9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer des traitements expérimentaux dans les puits en doubles ou en triple par État.
	<ol>
<li>Par exemple, traiter les cellules avec 50 nM de la Torin1 inhibiteur de mTOR, qui généralement est un inducteur efficace de séquestration autophagique, ou sous réserve des cellules à la famine aiguë de sérum et d’acides aminés par laver les cellules avec 1 mL d’Earle exempte d’acides aminés est équilibré Support de la Solution (EBSS) de sel et ensuite Incuber les cellules dans 1 mL de EBSS dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
		<li>Laisser un jeu de puits non traitée afin de définir des niveaux de fond des sédimentables LDH.</li>
		<li>Ajouter une quantité saturante de l’inhibiteur de la fixation du post bafilomycines A1 (Baf)3,13,16,18 en l’absence ou la présence des traitements expérimentaux, 3 – 4 h avant cellule la récolte. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C.<ol>
<li>Utilisez les 100 nM Baf pour LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 et cellules pre-1 et 10 nM Baf pour MEFs.</li>
			<li>Pour les traitements expérimentaux qui ont une durée de seulement 3 à 4 h (comme ces étape illustré en 1.3.1 ont généralement), ajouter Baf simultanément avec les traitements. Pour plus de traitements expérimentaux, attendre 3-4 h avant la récolte et ajouter 2 µL d’une 500 x concentré Baf stock directement dans le milieu.</li>
			<li>Mélanger en agitant la plaque immédiatement après l’ajout de la Baf. À ce stade, il est également recommandé d’ajouter macroautophagic inhibiteurs de la séquestration des contrôles, par exemple, 10 mM de la pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibiteur de la 3-méthyl adénine (3MA)19ou 10 µM de la classe sélective du PI3K III inhibiteur de la SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. récolte et préparation pour Electrodisruption des cellules
<ol><li>À la fin de la période de traitement, aspirer d’aspiration au milieu et ajouter 200 µL de solution détachement de cellules (préchauffé à 37 ° C) dans chaque puits. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (généralement autour de 5 min). NOTE : Considérant que 0,25 % (p/v), la trypsine-EDTA peuvent servir au lieu de la solution de détachement cellulaire, ce dernier contient DNase, qui permet de réduire la viscosité des cellules individuelles. Aussi longtemps que le milieu est complètement aspiré, il n’est pas nécessaire de laver les cellules avant l’addition de trypsine-EDTA ou cellule solution de détachement.</li>
	<li>Ajouter 500 µL température ambiante (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, contenant 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits et remettre en suspension à l’aide de la pipette jusqu'à ce qu’aucun amas de cellules ne sont visibles. Transférer immédiatement la suspension cellulaire aux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL sur la glace. Remarque : Sauf indication contraire, effectuez toutes les étapes subséquentes sur la glace.</li>
	<li>Sédiments les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Bien aspirer le surnageant (par aspiration) pour laisser les granules cellulaires aussi sèches que possible.</li>
	<li>Ajouter 400 µL 10 % (p/v) de sucrose (dans ultrapure H2O) dans chaque tube.</li>
</ol>3. Membrane plasmique Electrodisruption et séparation des Fractions de cellules sédimentables et Total
<ol><li>Resuspendre le culot cellulaire avec une pipette pour obtenir une suspension de cellules individuelles proche et de le transférer à une cuvette d’électroporation de 4 mm. NOTE : Pipetage va-et-vient ~ 10 à 15 fois, à l’aide d’une pointe de pipette 100 – 1 000 µL, est généralement suffisant.</li>
	<li>Placez la cuve dans une électroporateur vague de décroissance exponentielle et acquitter une seule impulsion électrique à 800 V, 25 µF et 400 Ω ; ces paramètres de produisent une impulsion de durée ~ 8 ms.</li>
	<li>
Un nouvel embout de la pipette permet de transférer le disruptate de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 400 µL de solution de saccharose glacée de tampon phosphate (monophosphate de sodium 100 mM, 2 mM le dithiothréitol (DTT), EDTA de 2 mM et 1,75 % de sucrose, pH 7,5) et mélanger brièvement en pipetage.
	<ol>
<li>Facultatif : Pour vérifier la membrane plasmique efficace electrodisruption17, mélanger 10 µL de la disruptate cellulaire dilués à l’étape 3.3 avec 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Transférer vers une chambre de comptage et de vérifier que le pourcentage de cellules positives le bleu Trypan est &gt; 99 %.<ol>
<li>Laisser l’échantillon dans la chambre de comptage pendant 30 min à température ambiante (20 à 25 ° C) et vérifiez que le pourcentage de cellules positives le bleu Trypan est resté &gt; 99 %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Facultatif : Pour vérifier que l’electrodisruption n’a pas été trop sévère, autrement dit, il n’a pas perturbé organites intracellulaires, effectuez les étapes 1.1 – 3.3 comme décrit ci-dessus, mais utilisez un plus grand produit de départ (un puits d’une plaque de 6 puits avec une couche de cellules confluentes de ~ 80 %), et utiliser 150 µL 10 % de saccharose en étape 2.5 et 150 µL tampon phosphate une solution de saccharose sans TNT à l’étape 3.3.<ol>
<li>Utiliser une pipette à soigneusement couche 200 µL de la solution de disruptate cellule dilué sur un coussin de densité 1,2 mL de milieu dégradé densité de 8 % (p/v) tamponnée au phosphate (par exemple, 8 % Nycodenz, phosphate de sodium de 50 mM, 2,2 % de sucrose, EDTA 1 mM) dans une centrifugeuse de 2 mL tube. Centrifuger à 20 000 x g pendant 45 min à 4 ° C dans une micro-centrifugeuse avec fonction soft-mode (pour légère accélération et de décélération) et rangez soigneusement les tubes sur la glace.</li>
			<li>Retirez soigneusement les 60 µL de la fraction supérieure ~ 200 µL, en veillant pas à ramasser toute solution moyenne gradient de densité et transférer dans un tube de microcentrifuge fraîches. Remarque : Cela devrait contenir cytosol d’une pureté exceptionnelle, appelée « suc cellulaire »21.</li>
			<li>Test de la pureté de la fraction obtenue dans l’étape précédente, en effectuant des analyses par transfert western des protéines contenus organite, utilisant des techniques standards et de gels dégradé de 4 à 20 %16.</li>
			<li>Exécuter par exemple immunoblotting pour cathepsine B21, le cytochrome c et isomérase de bisulfure de protéine, pour vérifier que l’électrocution à l’étape 3.2 n'a pas perturbé les lysosomes, mitochondries ou réticulum endoplasmique, respectivement et immunoblot pour LDH pour vérifier la présence d’une protéine cytosolique dans le suc cellulaire.</li>
			<li>En parallèle, effectuer l’immunotransfert sur extraits protéiques issus de la cellule total disruptate solution16 pour confirmer que les anticorps utilisés peuvent détecter les protéines organelle autonomes qui sont évaluées.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez les étapes 3.1 – 3.3 pour chaque échantillon.</li>
	<li>Séparer la 550 µL de chaque solution de disruptate cellule dilué (obtenue à l’étape 3.3) tubes de microcentrifuge de 2 mL contenant 900 µL glacee tampon de resuspension (monophosphate de sodium de 50 mM, 1 mM DTT, EDTA 1 mM et 5,9 % de sucrose, pH 7,5) additionné de 0,5 % de BSA et 0,01 % Tween-20 et mélanger brièvement par pipetage.</li>
	<li>Centrifuger à 18 000 x g pendant 45 min à 4 ° C pour produire des granulés contenant « sédimentée LDH ». Bien aspirer le surnageant (par aspiration) pour laisser les granules aussi sèches que possible. Placer les échantillons dans un congélateur à-80 ° C.</li>
	<li>Transférer 150 µL de chaque solution de disruptate cellule dilué (obtenue à l’étape 3.3) dans de nouveaux tubes et placer les échantillons dans un congélateur à-80 ° C. Utiliser ces échantillons pour déterminer les niveaux de « total des LDH » dans les cellules. Remarque : À ce stade, l’expérience peut être suspendue pour aussi longtemps que vous le souhaitez.</li>
</ol>4. LDH Extraction et mesure de l’activité enzymatique de la LDH
<ol><li>Décongeler la LDH « sédimentée » (de l’étape 3.6) et échantillons « total LDH » (de l’étape 3,7) sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 300 µL de tampon de resuspension glacée contenant 1,5 % X-405 Triton à la LDH « totale » des échantillons (ce qui donnerait une concentration finale de Triton X-405 de 1 %). Faire pivoter les échantillons sur un rouleau dans une chambre froide (4 – 8 ° C) pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 750 µL de tampon de resuspension glacée avec 1 % X-405 Triton à la LDH « sédimentée » échantillons et remettre en suspension les boulettes avec une pipette jusqu'à obtenir une solution homogène.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à l’étape 4.2 et 4.3 à 18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour les sédiments non dissous les débris cellulaires.</li>
	<li>Mix 4 pièces de l’imidazole froid 65 mM (pH 7.5)/0.75 mM pyruvate avec une part de l’imidazole froid 65 mM (pH 7.5) / 1,8 mM NADH pour obtenir une solution de travail qui est stable pendant au moins trois semaines à 4 ° C.</li>
	<li>Mélanger 3 – 30 µL de surnageants de l’étape 4.4 avec 200 µL de la solution de travail étape 4.5.</li>
	<li>Déterminer le montant de la LDH en mesurant l’activité enzymatique LDH comme la baisse de la nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) absorbance (NADH) à 340 nm à 37 ° C par rapport à un étalon avec une concentration connue de la LDH. Effectuer des mesures d’absorbance jusqu'à ce que la réaction a approché l’achèvement, c'est-à-dire jusqu'à l’absorbance à 340 nm ne change avec le temps. NOTE : Ceci est la méthode biochimique classique pour mesurer l’activité de la LDH. Bien que le protocole actuel effectue la réaction à 37 ° C, elle peut également être réalisée à température ambiante (20 à 25 ° C), qui est conseillé si spectrophotométrie manuelle à faire. Le protocole actuel utilise un instrument robotique multianalyzer, qui, de manière automatisée, mélange d’échantillons avec la solution de travail dans une plaque à 96 puits et mesure l’absorbance à 340 nm à 37 ° C toutes les 20 s pendant 3 min. Par la suite, le logiciel de l’instrument calcule la concentration de la LDH, exprimée en unités (U) / L, en comparant la pente de la mesure d’absorbance dans le temps par rapport à une courbe d’étalonnage obtenue par étalonnage avec une norme de LDH connu concentration. La gamme linéaire de détection de cette approche est 30 – 1 500 U/L. Comme alternative, il existe une grande variété de kits disponibles dans le commerce pour mesurer la LDH. Certains d'entre eux sont basés sur la réaction enzymatique à la génération de produits colorimétriques ou fluorescentes, permettant la détection par d’autres moyens que la spectrophotométrie UV et avec les autres cuisinières linéaires de détection de couplage.</li>
</ol>5. calcul de la séquestration du LDH
<ol><li>Calculer le pourcentage de LDH sédimenté de LDH totale pour chaque échantillon, prenant les dilutions et d’échantillonnage en compte : LDH sédimentée (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Remarque : Au cours des étapes 3.1 – 3.3 environ 50 µL est perdue en raison du transfert dans et hors de la cuvette d’électroporation. Ainsi, calculer d’avoir un total de 750 µL (au lieu de 800 µL) de disruptate cellule dilués à l’étape 3.3.</li>
	<li>Soustraire le pourcentage de LDH sédimenté acquis dans les échantillons de cellules non traitées (étape 1.3.2) du pourcentage de LDH sédimenté acquis dans des échantillons de cellules traitées expérimentalement et diviser par la durée du traitement avec la Baf pour obtenir le pourcentage de LDH séquestré par heure pendant la période d’échantillonnage : Séquestré LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

En résumé, le protocole décrit ici représente une méthode fiable et largement applicable pour surveiller l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Par rapport à la méthode originale12,16, nous avons supprimé un certain nombre d’étapes inutiles, simplifié plusieurs des étapes restantes et introduit une substantielle réduction d’échelle. Par conséquent, le protocole est grandement amélioré par rapport aux coût et temps-effica...

Autophagie (du grec « se manger ») est un processus évolutif et conservé pour dégradation lysosomale/vacuolaire du matériel intracellulaire. Lors de la découverte des gènes liés autophagie (« ATG »), qui sont importants pour l’autophagie chez les levures et les humains, et la réalisation que l’autophagie joue un rôle important dans la santé humaine et de la maladie (reconnu par le prix Nobel de médecine ou de physiologie à 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagie est rapidement devenu un des procédés plus intensément étudiés en cellule biologie1,2.
Macroautophagy (ci-après dénommé « autophagie ») est caractérisée par l’expansion et pliage de saccules membranaires intracellulaire (« phagophores ») dans des structures scellées, double - ou multi - membrane (« autophagosomes ») séquestrent efficacement le enveloppé de matériel du reste du cytoplasme. Lors de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, la membrane intérieure autophagosomal et la cargaison séquestrée est dégradée et recyclés. Autophagosomes peut piéger le matériel cytoplasmique en aléatoire (autophagie non sélectif) et manières sélectives (autophagie sélective). En vrac autophagie probablement représente un mélange de l’autophagie non-sélective et sélective.
Dans les années 60 et 70 (« l’ère morphologique » de la recherche de l’autophagie), séquestration autophagique a été principalement évaluée au moyen d’analyses ultrastructurales. Dans les années 1980 et au début des années 1990 (« l’ère biochimique ») par Seglen et collègues de travail — qui a étudié l’autophagie dans les hépatocytes primaires de rat — mis au point les premières méthodes pour mesurer quantitativement la séquestration autophagique activité3. À l’aide de ces tests, Seglen défini et caractérise les différentes étapes de la voie autophagique lysosomal4,5, découvert et a inventé l’amphisome6 (le produit de la fusion de l’endosome-autophagosome) et fut le premier à décrire le rôle de la phosphorylation des protéines l’autophagie règlement7. Cependant, après la découverte des ATGs dans les années 1990 (« l’ère moléculaire ») et la première caractérisation d’une protéine ATG8 chez les mammifères, les protéines associées aux microtubules 1 a/1 b-light chain 3 (LC3) 20008, l’utilisation de protéines ATG comme marqueurs pour la processus autophagique rapidement gagné en popularité, et les plus âgés et plus laborieux des méthodes biochimiques ont été laissés. En fait, sur les 18 dernières années, les tache occidentale et les analyses de microscopie de fluorescence de LC3 sont devenues de loin la plus populaire (et dans bien des cas la seule) moyens d’étudier l’autophagie des cellules de mammifères. L’avantage est la facilité par laquelle ces méthodes peuvent être effectuées. L’inconvénient est que l'on étudie un composant du panier (LC3) plutôt que de réel autophagique fret. Il s’agit d’un inconvénient plutôt sérieux, parce que la relation entre les Etats et/ou les flux de LC3 par la voie contre la séquestration et de la cargaison n’est pas très claire. En fait, nous avons montré que le flux de cargaison en vrac peut être maintenue à des niveaux élevés dans des conditions où il n’y a aucun flux LC3, malgré la présence de LC3 conjugués dans les cellules9. En outre, nous avons démontré que l’autophagie en vrac n’est pas affectée par l’appauvrissement LC3 efficace et donc probablement est indépendant du LC39. Cette constatation est confirmée plus tard par LC3 études knock out10,11, qui indiquent également que mitophagy Parkin-dépendante (l’autophagie sélective des mitochondries) est indépendant de LC310,11 .
En résumé, il n’y a absolument besoin pour analyses fret surveiller l’activité de l’autophagie. Façon optimale ces tests devraient être largement applicable, bien définie et facile à exécuter. Au cours de ces dernières années, nous avons pris un intérêt particulier pour le test de fixation du LDH, qui a été développé par Seglen dans les années 198012et repose sur la mesure de la cession de LDH cytosolique à sédimentables, cellule de contenant des vacuoles autophagique fractions. LDH est une protéine cytosolique stable, soluble qui est séquestrée facilement conjointement au moment où phagophores enwrap fret cytoplasmique. Séquestration de LDH est donc une mesure générale de séquestration de l’autophagie. LDH est exclusivement dégradée par la voie autophagique lysosomal12. Ainsi, en présence d’inhibiteurs de dégradation lysosomale, par exemple, bafilomycine A1 (Baf)13, directement les effets du traitement expérimental reflètent altérations dans l’activité de séquestration autophagie. En l’absence d’inhibiteurs de la dégradation, l’effet net des altérations dans la séquestration de la LDH et de la dégradation peut être mesurée.
Le test de fixation du LDH est largement applicable, puisque la LDH s’exprime fortement et de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules, et des niveaux LDH peuvent être quantifiées avec précision par un dosage enzymatique14,15. Toutefois, l’original du protocole12 — établi dans les hépatocytes primaires de rat — est plutôt fastidieux et requiert une grande quantité d’à partir de matériel comme un condensateur de décharge électrique sur mesure. De manière progressive, nous avons progressivement transformé l’essai dans une méthode simple et versatile. Tout d’abord, le protocole original a été adapté pour une utilisation dans des cellules de mammifères lignes16. Deuxièmement, la méthode a été substantiellement à échelle réduite de3,9. Troisièmement, plusieurs étapes dans le protocole ont été éliminés, y compris un coussin de densité laborieuse étape17. En même temps, cela a permis une réduction encore plus loin de la méthode, dans le point de départ original d’utiliser une plaque de 10 cm par exemple16 pour utiliser un seul puits d’une plaque de 12 puits par échantillon (soitenviron 15 fois moins à partir le matériel)17. Quatrièmement, nous avons identifié un appareil commercial électroporation qui pourrait remplacer le condensateur de décharge électrique sur mesure17.
Notre protocole à jour de l’essai de fixation du LDH, qui comprend quelques simplifications supplémentaires de la méthode par rapport à la publiées antérieurement17 est présenté ici. En outre, un ensemble de résultats typiques obtenus dans un certain nombre de différents types de cellules s’affiche, et important, plusieurs lignes de validations expérimentales de la méthode à l’aide de knockdown pharmacologique mais aussi génétique et approches knockout sont fournis. Pour un projet global de flux du protocole entier, voir la Figure 1.

<table><tbody><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 et 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 12 puits&nbsp ;</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax ; solution de détachement de cellules</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>A7089</td><td>Maintenir les aliquotes à -20 &deg ; C depuis des années, et au réfrigérateur pendant quelques mois</td></tr><tr><td>Bafilomycine A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>Dissoudre dans les cellules DMSO</td></tr><tr><td>BJ</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>utilisation au passage < 30</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Burker</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Countess</td><td>Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess II</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture pour la chambre</td> <td>de comptage BurkerFisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Gel Criterion Tris-HCl, 4&ndash ; 20 %, 26 puits, 15 et micro ; L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x L)&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée d’Earle (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>contient 0,1 % de glucose</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’électroporation (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur à ondes de décroissance exponentielle</td><td>BTX Harvard Appareillage</td><td>&nbsp ; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Concentration finale de 10 % dans le milieu RPMI 1640</td></tr><tr><td>Cellules HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>Autoclave une solution de 65 mM et conserver au réfrigérateur pendant des mois</td></tr><tr><td>Incubateur ; Incubateur de CO2 Autoflow IR Direct Heat</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>cellules LNCaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>utilisation au passage < 30</td></tr><tr><td>3-méthyladénine (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>Stock 100 mM en RPMI en -20 &deg ;C.&nbsp ; Chauffer le bouillon à 65 &deg ; C pendant 10 min, et utilisation à une concentration finale de 10 mM</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée avec fonction de mode doux</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td>Eppendorf 5417R&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate MRT67307 (ULKi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>Inhibe l’activité de la kinase ULK. Dissoudre dans le DMSO.</td></tr><tr><td>MaxMat Multianalyzer instrument</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 cellules</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Sérum réduit Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette 3 (0,5-20 & micro ; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART Pointes barrières</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1-200 &micro ; L)</td><td>VWR</td><td>732-2207&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer ART Pointes de barrière</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (100-1 000 & micro ; L)</td><td>VWR</td><td>732-2355&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer ART Pointes de barrière</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 Kit GLP</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>Préparez une solution mère à 1 mg/mL dans du H2O stérile. Cette solution est stable à -20 &deg ; C depuis au moins 1 an.</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>cellules RPE-1 (hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp ;</td><td>A8883</td><td>Inhibe la phosphoinositide 3-kinase de classe III (PIK3C3). Dissoudre dans le DMSO.</td></tr><tr><td>Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silencieux Select siRNA ciblant ULK2 (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silencieux Select siRNA ciblant GABARAP (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silencieux Select GABARAPL1-ciblant siRNA (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silencieux Select GABARAPL2-ciblant siRNA (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monobasique de sodium dihydraté (NaH2PO4 &bull ; 2H2O)&nbsp ;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium dihydraté (Na2HPO4 &bull ; 2H2O )&nbsp ;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10 % concentration finale dans l’eau ; filtre à travers 0,45 & micro ; m filtrer et conserver au réfrigérateur pendant des mois</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Inhibe la pompe SERCA ER Ca2+. Dissoudre dans le DMSO.</td></tr><tr><td>Triton X-405°</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1 % final</td></tr><tr><td>Trypan Blue stain 0,4</td> % <td>Sondes moléculaires</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 % p/v trypsine)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0,01 % final</td></tr></tbody></table>

le test de fixation du lactate déshydrogénase — une méthode simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

En vrac autophagie est caractérisée par la séquestration de larges portions du cytoplasme en double/multi-membrane structures appelées autophagosomes. Un protocole simple de contrôler ce processus est décrit ici. En outre, les résultats typiques et validation expérimentale de la méthode dans des conditions inductrices d’autophagie dans divers types de cellules mammifères cultivées sont fournis. Au cours de l’autophagie en vrac, autophagosomes séquestrer le cytosol et aussi des protéines cytosoliques solubles, aux côtés d’autres cargaisons autophagie. LDH est stable et très abondant, soluble enzyme cytosolique qui est non sélective séquestré dans autophagosomes. Le montant de la séquestration du LDH reflète donc la quantité de séquestration autophagique en vrac. Pour efficacement et précisément déterminer la séquestration de LDH dans les cellules, nous utilisons un protocole basé sur electrodisruption de fractionnement qui sépare efficacement sédimentables LDH cytosolique, suivie de la mesure de l’activité enzymatique dans sédimentables fractions par rapport à des échantillons de cellules entières. Séquestration de l’autophagie est déterminée en soustrayant la proportion de sédimentables LDH dans les cellules non traitées que dans les cellules traitées. L’avantage de l’essai de séquestration de LDH est qu’il donne une mesure quantitative de la séquestration autophagique du fret endogène, par opposition à d’autres méthodes que soit impliquent l’expression ectopique de sondes de séquestration ou semi-quantitatifs protéase analyses de la protection des récepteurs ou des marqueurs de l’autophagie.

En utilisant le protocole décrit ici, activité autophagique séquestration en vrac dans un certain nombre de lignées cellulaires chez les mammifères, y compris LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, (MEFs) les fibroblastes embryonnaires de souris, pre-1, On a mesuré les cellules HEK293, BJ et LNCaP. Sequestration a été évaluée dans les conditions basales (dans un milieu complet, riche en nutriments), ou dans les cellules aiguë affamée de sérum et...

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’autophagie, telles que la façon dont la formation d’autophagosomes est régulée et comment divers traitements et conditions cellulaires affectent l’autophogie en vrac. Le principal avantage de cette technique est qu’elle mesure la séquestration endogène des marchandises. Par conséquent, la méthode est largement applicable et indépendante de la surexpression artificielle ou de l’introduction de sondes de cargaison.Paula Szalai et Morten Luhr, doctorants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez des cellules adhérentes dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Laissez les cellules se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent une couche cellulaire presque confluente.Après cela, lavez les cellules avec trois millilitres de PBS à 37 degrés Celsius à pH 7,4. Retirez le PBS et remplacez-le par trois millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA. Incuber dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius, jusqu’à ce que les cellules se détachent.En

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Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour la mesure du lactate dans les lysats cellulaires à l’aide de l’enzyme lactate déshydrogénase. Cette enzyme convertit le lactate en pyruvate, ainsi que la conversion du NAD en NADH qui réagit avec les colorants au tétrazolium et donne un produit coloré qui peut être mesuré spectrophotométriquement pour quantifier le lactate.

Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

La vidéo montre un test permettant d’évaluer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Il utilise l’électroporation pour libérer des protéines cytosoliques, y compris la lactate déshydrogénase (LDH). Les fractions de LDH séquestrée et de LDH cellulaire totale sont déterminées pour évaluer la séquestration de la LDH, ce qui donne un aperçu de l’activité globale de séquestration en vrac.

Quantification de l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

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Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Découvrez un protocole fiable pour mesurer l'activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Cette méthode quantifie la LDH endogène sans sondes artificielles.

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