Seringue-injectable maillage électronique pour l’électrophysiologie rongeur chronique Stable

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les processus de vieillissement se manifestent dans le cerveau, comment le cerveau se développe et comment les maladies cérébrales naissent et progressent. Le principal avantage de cette technique est que l’électronique maillée ne provoque pas de réponse immunitaire chronique dans la gliose une fois implantée dans le cerveau et permet une intégration transparente avec le tissu neural environnant. Tao Zhou, étudiant diplômé du Groupe Lieber, et Jung Min Lee, post-doctorant du Groupe Lieber, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer la procédure, chargez une plaquette de silicium propre dans un évaporateur thermique et évaporez 100 nanomètres de nickel. Ensuite, appliquez une couche de résine photosensible négative SU-8 2000.5 sur la plaquette à 400 tours par minute pour une épaisseur SU-8 approximative de 400 à 500 nanomètres. Chargez la plaquette dans un aligneur de masque pour exposer le SU-8 avec le masque de photolithographie correspondant à la couche inférieure du SU-8.

Exposer à une dose de 100 millijoules par centimètre carré. Eux, immergez la plaquette dans un plateau de révélateur SU-8. Agitez doucement la solution pendant deux minutes, jusqu’à ce que le motif de maille du SU-8 soit complètement développé.

Ensuite, rincez la gaufrette dans un plateau d’alcool isopropylique pendant une minute et séchez-la. Faites cuire la gaufrette sur une plaque chauffante à 180 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, appliquez une couche de centrifugation LOR 3A sur la plaquette à 4 000 tours par minute pour une épaisseur approximative de 300 nanomètres.

Photorésine positive Spin coat S1805 à 4 000 tours par minute pour une épaisseur approximative de 500 nanomètres. Ensuite, chargez la plaquette dans un aligneur de masque pour exposer le S1805 avec le masque de photolithographie deux correspondant aux interconnexions métalliques et aux tampons d’entrée et de sortie. Exposé à une dose de ligne H de 40 millijoules par centimètre carré, puis plongez la plaquette dans un plateau de révélateur photosensible CD-26.

Agitez doucement la solution pendant une minute jusqu’à ce que le motif d’interconnexion métallique soit complètement développé. Rincez la gaufrette dans un bac d’eau déminéralisée pendant une minute et séchez-la au sèche-cheveux. Ensuite, évaporez thermiquement trois nanomètres de chrome suivis de 80 nanomètres d’or.

Plongez la plaquette dans un bécher plat de dissolvant PG pendant environ trois heures, jusqu’à ce que le métal soit complètement sous-dépouillé, ne laissant le métal que dans les régions d’interconnexion et d’entrée, de sortie souhaitées de l’électronique maillée. Répétez le revêtement de spin, la lithographie, l’évaporation et le décollage pour laisser trois nanomètres de chrome et 50 nanomètres de platine dans les régions des électrodes. Par la suite, répétez le revêtement de centrifugation et la photolithographie du SU-8 pour définir la couche supérieure de maille du SU-8.

Traitez la plaquette avec un plasma d’oxygène à 50 watts pendant une minute. Ensuite, plongez la plaquette dans la gravure au nickel en solution pendant environ trois heures, jusqu’à ce que l’électronique du maillage soit complètement libérée de la plaquette de silicium. À l’aide d’une pipette pasteur, les sondes électroniques à maille libérée de la gravure au nickel dans un bécher de 100 millilitres d’eau déminéralisée.

Ensuite, transférez l’électronique du maillage dans un bécher frais d’eau déminéralisée au moins trois fois pour assurer le rinçage. Pour charger l’électronique à maille dans une aiguille, insérez une aiguille capillaire en verre dans le bécher de 100 millilitres de PBS contenant l’électronique à maille. Positionnez l’extrémité de l’aiguille près des coussinets d’entrée et de sortie d’une sonde électronique à maille et rétractez manuellement la seringue pour aspirer une sonde électronique à maille dans l’aiguille.

Poussez et tirez le piston de la seringue alors qu’il est encore immergé dans une solution saline pour ajuster la position de l’électronique de la maille dans l’aiguille. Pour injecter de l’électronique maillée dans le cerveau d’une souris, utilisez une perceuse dentaire et un cadre stéréotaxique pour ouvrir une craniotomie aux coordonnées souhaitées sur le crâne. Ouvrez une deuxième craniotomie loin du site d’injection pour l’insertion d’une vis ou d’un fil graphique en acier inoxydable.

Ensuite, fixez un substrat de serrage au crâne avec du ciment dentaire. Une coupe d’environ un millimètre de large dans le substrat améliore la fiabilité de l’étape de pliage plus tard dans la procédure. Ensuite, montez le porte-pipette avec l’aiguille contenant l’électronique de maille dans le cadre stéréotaxique à l’aide d’une pince d’extrémité à angle droit.

Fixez la sortie latérale du porte-pipette à une seringue de cinq millilitres fixée dans un pousse-seringue avec un tube capillaire de 0,5 à un mètre de long. Ensuite, utilisez le cadre stéréotaxique pour positionner la pointe de l’aiguille à l’endroit de départ souhaité dans le cerveau. Positionnez la caméra de manière à ce que le haut de la sonde électronique à maille soit affiché à l’intérieur de l’aiguille de verre.

Initiez le débit en réglant le pousse-seringue à basse vitesse et en appuyant sur start. Augmentez lentement le débit si la sonde électronique à maille ne bouge pas à l’intérieur de l’aiguille. Lorsque la sonde électronique à maille commence à se déplacer à l’intérieur de l’aiguille, utilisez le cadre stéréotaxique pour rétracter l’aiguille à la même vitesse que la sonde électronique à maillage est injectée en utilisant la position d’origine marquée de l’électronique à maillage comme guide.

Continuez à faire couler la solution saline et à rétracter l’aiguille jusqu’à ce que l’aiguille soit sortie du crâne. Ensuite, arrêtez l’écoulement de la pompe à seringue. Dans cette procédure, utilisez le cadre stéréotaxique pour guider soigneusement l’aiguille vers le substrat de serrage du câble plat et flexible à travers l’espace, en faisant couler la solution avec le pousse-seringue pour générer un relâchement dans les interconnexions électroniques maillées.

Une fois que l’aiguille se trouve au-dessus du substrat de serrage et à travers l’espace, reprenez le flux à un rythme rapide pour injecter l’entrée électronique de maillage, les tampons de sortie sur le substrat de serrage. À l’aide d’une pince à épiler et d’une pipette d’eau déminéralisée, pliez les tampons d’entrée et de sortie à un angle de 90 degrés, aussi près que possible du premier tampon d’entrée et de sortie. Une fois que les pads d’entrée et de sortie sont alignés et pliés et, à un angle de 90 degrés par rapport à la tige en maille, séchez-les en place avec de l’air comprimé qui circule doucement.

Coupez le substrat de serrage à un bord droit d’environ 0,5 à un millimètre du bord des tampons d’entrée et de sortie. Coupez également les parties superflues du substrat de serrage qui entraveront l’insertion dans le connecteur zif 32 canaux monté sur PCB. Ensuite, insérez les pads d’entrée et de sortie dans le connecteur zif du PCB et fermez le loquet.

Utilisez l’électronique de mesure pour mesurer l’impédance entre les canaux et la vis de terre afin de confirmer la réussite de l’interface. Si les valeurs d’impédance sont trop élevées, déverrouillez le connecteur zif, ajustez l’insertion et testez à nouveau jusqu’à ce que la connexion soit confirmée. Par la suite, couvrez le connecteur zif et les interconnexions électroniques à maille exposée avec du ciment dentaire pour la protection.

Retournez le PCB au niveau de l’espace dans le substrat et fixez le PCB avec du ciment sur le crâne de la souris. Pour des enregistrements en mouvement libre, relâchez la souris de la retenue après avoir inséré le circuit imprimé du préamplificateur et mis à la terre la vis de référence. Enregistrez pendant la durée souhaitée à l’aide du système d’acquisition de données pendant que la souris se comporte librement.

Voici les cartes thermiques représentatives du champ local des sondes électroniques à maillage à 32 canaux injectées dans l’hippocampe et le cortex somatosensoriel de la souris. Les données ont été enregistrées pendant que la souris explorait librement sa cage deux mois et quatre mois après l’injection. L’amplitude potentielle du champ local est codée en couleur en fonction de la barre de couleur à droite.

Des traces de filtre passe-haut, noires, montrant une activité de pointe, sont superposées sur le spectrogramme pour chacun des 32 canaux. Voici le pic isolé après tri des données tracées. Une activité de pic unitaire a été détectée sur 26 des 32 canaux, deux mois après l’injection et quatre mois après l’injection.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de tester l’interface d’E/S pour confirmer la connexion électrique réussie à la sonde électronique maillée. L’impédance de mesure permet de dépanner la source de tout problème et est essentielle pour identifier les problèmes d’interfaçage ou de fabrication. Suite à cette procédure, une histologie peut être réalisée afin d’étudier l’environnement cellulaire autour de chaque électrode enregistrée.

Contrairement aux sondes cérébrales rigides conventionnelles, l’électronique du maillage peut être laissée dans le tissu pendant l’histologie, ce qui permet de corréler avec précision les données électrophysiologiques avec l’analyse immunohistochimique.