Collection, isolement, et cytométrie en flux analyse des échantillons Endocervical humain

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules mononucléées cervicales d’un grattage endocervical à l’aide d’une brosse cyto. Une fois isolées, ces cellules peuvent être utilisées dans plusieurs essais, y compris la cytométrie en flux, où vous pouvez déterminer le phénotype et la fonction des cellules immunitaires au niveau de l’appareil génital féminin. Le prélèvement d’échantillons de brosse cyto et de lavage cervical est une procédure non invasive qui doit être effectuée par un gynécologue ou un médecin qualifié.

Le lavage vaginal cervical est effectué en premier lieu où l’endocol est lavé avec deux moulins de PBS, qui est ensuite prélevé sur le fornix postérieur après le lavage. L’extrémité concave d’un grattoir cervical est placée contre le col de l’utérus et tournée pour prélever un échantillon de l’ouverture cervicale ou de l’orifice cervical. Ensuite, la brosse cyto est insérée dans le système d’exploitation endocervical et tournée à 360 degrés.

L’utilisation d’une pression douce aidera à garantir l’absence de contamination sanguine de l’échantillon. La brosse cyto dans le grattoir est recueillie dans un tube contenant cinq mils de PBS. Après avoir été transporté sur de la glace, l’échantillon est rapidement tourbillonné pour dissocier les cellules de la brosse cyto.

Une fois que vous avez lavé les échantillons avec un média, ils sont ensuite filtrés à travers un filtre en nylon de cent microns. Cela permet de collecter les lymphocytes, les monocytes et les cellules épithéliales de l’échantillon. Les cellules sont maintenant prêtes à être colorées avec des anticorps contre les protéines de surface, et une fois qu’elles ont été fixées, elles peuvent être analysées sur le cytomètre en flux.

Nous allons vous montrer comment nous analysons les données résultantes pour évaluer le phénotype des populations de lymphocytes T CD quatre et CD huit présentes au niveau du col de l’utérus. Bonjour, je suis doctorant dans le laboratoire du Dr Keith folk. Nos recherches portent sur le lien entre l’activation immunitaire et la susceptibilité au VIH ainsi que la progression de la maladie.

Étant donné que la majorité des infections par le VIH se produisent maintenant lors de relations hétérosexuelles, nous nous intéressons également à déterminer les corrélats de la protection contre la transmission du VIH à l’appareil génital féminin. Malheureusement, la collecte d’échantillons de l’appareil génital peut être très difficile et assez invasive pour les participants à l’étude. L’utilisation de brosses cyto pour collecter des CMC ou des cellules mononucléées cervicales est une méthode plus rapide et plus facile par rapport à d’autres protocoles tels que les biopsies.

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment isoler et préparer les CMC pour une utilisation en cytométrie en flux ou d’autres applications en aval. Après la collecte, la brosse cyto et le grattoir sont transportés dans cinq mils de PBS froid. Il est important de transporter les échantillons sur de la glace jusqu’au moment du traitement, qui ne doit pas dépasser deux heures après le prélèvement de l’échantillon.

Tous les échantillons contaminés par des traces de sang à ce moment-là doivent être exclus d’une analyse plus approfondie afin de dissocier les cellules de la brosse cyto. Vortex le tube à feu vif pendant 45 secondes car les cellules resteront toujours sur la brosse cyto et le grattoir. Ils doivent être retirés manuellement.

Mettez une nouvelle paire de gants et utilisez la brosse cyto pour gratter tout matériau restant du grattoir. Après avoir jeté dans une solution d’eau de Javel, utilisez votre pouce et votre index pour retirer toutes les cellules restantes de la brosse cyto en pressant de haut en bas sur le tube de faucon. Après avoir jeté la brosse cyto, changez de gants avant de préparer un autre échantillon, utilisez une pipette de transfert pour laver les côtés du tube avec du PBS en vous assurant que tout l’échantillon est collecté.

Convient à un nylon de cent microns. Filtrez sur un tube Falcon frais et utilisez la pipette pour filtrer tout le volume de solution PBS. Ajoutez cinq mils de support RPMI sans FBS au tube d’origine.

Utilisez la pipette pour bien laver les côtés du tube afin d’éliminer tout mucus ou débris adhérents. Transférez ensuite le média à travers le filtre. Utilisez une partie du média filtré pour laver le fond du filtre avant de le jeter dans l’eau de Javel.

Pour granuler les cellules isolées. Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 1500 tr/min pour éviter que la pastille ne se déloge. N’oubliez pas de désactiver le frein de la centrifugeuse si les cellules doivent être utilisées pour la cytométrie en flux.

Préparez la solution de blocage nécessaire pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques. Lors de l’étape de centrifugation, utiliser 100 microlitres de solution bloquante par échantillon. La solution de blocage contient 93,2 microlitres de fax, wash ou PBS plus 2 % FBS, cinq microlitres de FBS et 1,8 microlitres d’IgG de souris.

Après le spin, la plupart des échantillons avec des cellules viables auront une pastille visible. Dans certains cas, le granulé sera assez gros. Alors que dans d’autres échantillons, il peut être à peine visible.

La taille des granulés n’est pas toujours liée au rendement cellulaire. Prenez soin de déranger le surnageant, en veillant à ne pas déranger les cellules, remettez la pastille en suspension par une légère agitation. Lavez les cellules avec cinq mils de PBS et répétez la centrifugation pendant 10 minutes à 1500.

RRP M avec la rupture, une fois de plus, décantez le surnageant et remettez le plomb en suspension comme précédemment. À ce stade, les cellules sont prêtes à être cryopréservées ou colorées en surface avant d’être colorées Avec des anticorps fluorescents, il est bénéfique de bloquer la liaison non spécifique en incubant les cellules avec une solution de blocage préparée lors d’une centrifugation antérieure. Une fois la pastille cellulaire remise en suspension, ajoutez une centaine de microlitres de solution bloquante à l’échantillon et mélangez soigneusement.

Les étapes restantes du protocole peuvent être effectuées dans une plaque à 96 puits ou un tube de télécopie. En fonction de la taille de la pastille CMC. Transférez la solution bloquante et le mélange de cellules dans un tube de télécopie.

Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant l’incubation de 10 minutes, préparez le colorant de viabilité qui sera utilisé pour distinguer les cellules vivantes et mortes. Lors de l’analyse des données, préparer le colorant de viabilité selon celui du fabricant et pré-titrer au besoin.

Assurez-vous de garder le mélange de colorant couvert de la lumière jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé. Après l’incubation de 10 minutes, lavez les cellules avec 500 microlitres de fax, wash ou PBS avec 2 %FBS, puis centrifugez pendant 10 minutes à 1600 tr/min. Après l’essorage, décantez le surnageant du tube de télécopie.

Remettre les cellules en suspension par agitation. Ajoutez maintenant le volume approprié de colorant de viabilité qui a été préalablement préparé. Incuber les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour s’assurer que les échantillons restent à l’abri de la lumière en les enveloppant dans du papier d’aluminium.

Au cours de cette incubation, vous pouvez préparer le mélange principal d’anticorps fluorescents qui seront utilisés pour marquer les cellules. Assurez-vous de pré-titrer et de valider vos anticorps sur des échantillons de contrôle du sang périphérique avant de les utiliser sur des CMC. Mélangez les anticorps titrés et amenez-les à un volume final de cent microlitres par échantillon.

Avec fax, lavez, protégez tous les anticorps de la lumière pendant ces étapes. Après l’incubation de 30 minutes, lavez à nouveau l’échantillon avec 500 microlitres de fax, lavez, centrifugez, décantez et remettez les cellules en suspension comme auparavant. Il est maintenant temps d’incuber les cellules avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps préparé lors de l’incubation précédente.

Encore une fois, incubez les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, en vous assurant qu’ils sont à l’abri de la lumière. Les CMC en incubation sont maintenant prêts à être lavés avec 500 microlitres de PBS pour la dernière fois. Centrifugez l’échantillon à 1600 tr/min pendant 10 minutes.

Après décantation et suspension de la pastille, diluez les cellules dans un volume final de 750 microlitres dans une solution de paraldéhyde à 1 %. Pour les fixer, il est important de remettre en suspension les cellules dans ce grand volume afin d’éviter l’obstruction du cytomètre en flux. Même à ce volume, le tube d’échantillon peut sembler assez trouble.

Gardez les cellules dans l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient acquises sur le cytomètre en flux. En plus de l’échantillon de brosse cyto, nous prélevons régulièrement deux mils de lavage PBS du col de l’utérus et du vagin. Cet échantillon est centrifuge à 1400 tr/min pendant sept minutes pour éliminer les débris cellulaires du lavage.

Le surnageant restant peut ensuite être attribué et congelé à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse future de la concentration en protéines solubles. Ces données peuvent être particulièrement utiles en combinaison avec les données de phénotype cellulaire obtenues par cytométrie en flux. Avant d’exécuter votre exemple CMC.

Il est utile de préparer des commandes PBMC pour faciliter l’utilisation des tubes de compensation de rodage, à l’aide de billes ou de cellules de coloration unique afin de s’ajuster au chevauchement spectral. Acquérez l’intégralité du tube CMC pour collecter tous les événements par rapport aux échantillons PBMC. Les CMC présenteront plus de doublets sur une aire FSC par rapport à un graphique de hauteur et peuvent ne pas présenter une population lymphocytaire aussi distinctive que le PBMC.

Après avoir acquis vos échantillons, exportez les fichiers pour analyse dans un programme tel que FlowJo. Nous montrerons ici les principaux composants d’une stratégie de contrôle typique pour les lymphocytes T CD quatre positifs et CD huit positifs dérivés de CMC. Utilisez un graphique FSC en fonction de l’aire en fonction de la hauteur à G sur les maillots de votre échantillon.

Dans cette comparaison appariée, vous pouvez clairement voir l’augmentation du nombre de doublets dans un échantillon CMC par rapport aux p BMC. Ensuite, le traçage d’un marqueur fluorescent ou FSC en fonction du temps sert d’étape de contrôle de la qualité. Si des modifications de débit ont introduit des artefacts dans les données, ils peuvent être supprimés à cette étape.

En haut, vous pouvez voir un profil de fluorescence cohérent dans le temps indiquant un échantillon de haute qualité. Ci-dessous, vous pouvez voir un échantillon avec plusieurs interruptions et débits, qui peuvent être exclus d’une analyse plus approfondie. L’identification de la population lymphocytaire dans les échantillons de CMC peut être difficile.

L’utilisation du contrôle A-P-B-M-C aidera au placement de la marche. Comme vous pouvez le voir, certains échantillons présentent de grandes populations claires tandis que d’autres échantillons manquent de populations de lymphocytes. Ensemble, ces échantillons doivent être exclus.

Bien que nous nous concentrions sur les populations de lymphocytes. Il est également possible de g sur les monocytes en gisant sur les cellules qui n’ont pas l’expression de marqueurs de lignée. Il est possible d’identifier des cellules qui expriment des combinaisons de cellules dendritiques et de marqueurs monocytaires tels que CD 16 et CD 11 C. L’inclusion d’un marqueur de viabilité ou d’un colorant est cruciale pour l’analyse CMC, même sur des cellules fraîches.

Comme vous pouvez le constater, la majorité des lymphocytes CMC sont viables, mais certains échantillons contiennent des fréquences élevées de cellules mortes qui doivent être exclues de l’analyse. Les cellules mortes peuvent absorber de manière non spécifique l’anticorps et confondre l’analyse des données dans la démarche lymphocytaire. La coloration du CD trois doit être robuste.

La proportion de lymphocytes T positifs pour la MC est plus faible et plus variable que dans les échantillons PBMC, c’est pourquoi il est crucial d’acquérir l’intégralité de l’échantillon CMC et de maximiser le nombre d’événements collectés. Les populations de lymphocytes T CD quatre positifs et CD huit positifs peuvent être identifiées tout comme dans les échantillons TBMC. Dans certains échantillons CMC.

Le rapport CD-4/CD 8 est plus faible que celui observé dans le sang périphérique et certains individus présentent une importante population de lymphocytes T doublement négatifs. Après avoir identifié les populations de lymphocytes T CD quatre positifs et CD huit positifs, il est possible de quantifier l’expression de nombreux marqueurs phénotypiques. Bien que l’expression de CD 1 61 puisse être détectée dans les CMC, la population brillante de CD 1 61 qui est évidente dans le sang est absente au niveau de l’appareil génital.

De même, l’expression de marqueurs d’activation tels que CD 69 et H-L-A-D-R, ainsi que de marqueurs tels que CCR cinq et un peuvent être mesurés de manière fiable parmi les échantillons CMC et quantifiés. L’utilisation d’échantillons de cyto brush nous permet de caractériser à la fois le phénotype et la fonction des cellules immunitaires des muqueuses, en particulier dans le contexte des maladies infectieuses. Non seulement cela nous donne un meilleur aperçu des mécanismes régulant l’immunologie muqueuse et reproductive, mais cela fournit également la base pour le développement de nouvelles mesures de l’efficacité du vaccin muqueux.