Une procédure d’Isolation RNA axée sur les oligonucléotides Tandem pour récupérer des Complexes protéine-ARNm eucaryotes

Un tandem RNA isolation (TRIP) pour la récupération des complexes protéine-ARNm endogène formé décrit. Plus précisément, complexes ARN-protéine sont réticulés en vivo, polyadénylé RNAs sont isolés des extraits avec oligo (décollement) perles et ARNm particulier est capturés avec des oligonucléotides antisens RNA mis à jour le. Protéines liés à l’ARNm sont détectés par l’analyse par immunotransfert.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régulation de l’expression génique, telles que la façon dont les protéines de liaison à l’ARN s’assemblent sur des ARN particuliers in vivo et imposent ainsi une régulation génique post-transcriptionnelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun clonage ou manipulation génétique. Il peut être adapté à n’importe quel organisme modèle ou sous-type.

Pour concevoir des oligonucléotides, analysez la structure secondaire de l’ARNm ou un fragment de celui-ci à l’aide d’outils en ligne. Entrez d’abord la séquence de nucléotides dans la case vide, puis dans la case Options de base, sélectionnez l’énergie libre minimale et évitez les paires de bases isolées. Dans la boîte Options de sortie, sélectionnez le tracé interactif de la structure secondaire de l’ARN, puis cliquez sur le bouton Continuer.

Une nouvelle fenêtre s’affichera pour afficher la structure secondaire de l’ARNm d’intérêt. Sélectionner au moins trois séquences différentes de 21 à 24 nucléotides de longueur dans l’ARNm d’intérêt, de préférence dans les régions dépourvues de structures secondaires étendues et situées dans des régions à 3 premiers non traduites. Sélectionnez des régions avec un rapport guanidine/cytosine proche de 50 % et dépourvues de répétitions nucléotidiques en tandem pour éviter la formation potentielle d’épingles à cheveux ou d’auto-recuit.

Concevoir manuellement des oligonucléotides d’ARN modifiés à 2-prime-méthoxy portant une fraction biotine à 3-prime qui sont entièrement complémentaires aux régions sélectionnées au sein de l’ARNm cible souhaité. Utilisez un outil en ligne approprié pour ajuster la température de fusion des hybrides d’ARN entre 60 et 65 degrés et ayant une bonne complexité de séquence linguistique. Utilisez l’outil de recherche d’alignement local de base pour rechercher une hybridation croisée potentielle de l’ASO avec d’autres ARNm dans le transcriptome.

Sélectionnez Nucleotide BLAST, insérez la séquence dans la case vide et sélectionnez l’organisme d’intérêt. Conservez les paramètres restants par défaut et cliquez sur BLAST. Transfectez des cellules HEK293 à 70 % de confluence dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres en mélangeant deux microgrammes du gène rapporteur avec 20 microlitres de réactif de transfection et en les ajoutant aux cellules.

Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 48 heures avant la récolte. Le jour de la récolte, retirez le milieu à l’aide d’une pipette sérologique et lavez rapidement les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez six millilitres de PBS dans le plat et placez-le sur de la glace.

Ensuite, exposez les cellules à la lumière UV à raison de 100 millijoules par centimètre carré dans un réticulant UV. Après l’exposition aux UV, grattez les cellules et le PBS et transférez-les dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules à 250 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir retiré le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans deux millilitres de tampon de lyse pré-refroidi en pipetant de haut en bas cinq ou six fois tout en maintenant le tube sur de la glace. Transférez le lysat à l’aide d’une pipette dans un tube de cinq millilitres placé sur de la glace et du sonicate pendant trois cycles composés de rafales de 20 secondes à une amplitude de 10 microns avec des périodes de refroidissement de 30 secondes sur la glace. Après avoir transféré le lysat dans des tubes de deux millilitres, centrifugez-le à 15 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube. Pour commencer l’isolement de l’ARN, équilibrez un milligramme de billes magnétiques oligo(dT)couplées dans 500 microlitres de tampon de lyse. Retirez le tube du rotateur, placez-le sur une grille magnétique et retirez le tampon de lyse.

Combinez quatre milligrammes d’extrait de protéine HEK293 avec les billes magnétiques couplées à l’oligo(dT)25. Mélangez vigoureusement les échantillons, puis incubez pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Placez les tubes sur un support magnétique pendant 10 secondes, puis retirez le surnageant.

Gardez le surnageant sur la glace pour les cycles de récupération suivants. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage A aux billes et vortex pendant cinq secondes. Prélevez les billes à l’aide d’un aimant, puis lavez-les deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage B.To éluez l’ARN, ajoutez 30 microlitres de Tris-HCl de 10 millimolaires et incubez le tube à 80 degrés Celsius pendant deux minutes en secouant continuellement à 1 000 tr/min.

Transférez le tube directement sur le support magnétique et collectez l’éluat le plus rapidement possible après environ 10 secondes pour éviter la reliaison potentielle des ARNm aux billes à des températures plus basses. Les éluats issus de cycles répétés sont ensuite combinés et peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius. Pour capturer des ARNm spécifiques, ajoutez 30 microlitres de billes magnétiques couplées à la streptavidine à un millilitre de tampon de liaison et de lavage contenant 0,1 milligramme par millilitre d’ARN de transfert d’E. coli.

Equilibrez-vous sur un rotateur pendant une heure à température ambiante. Au bout d’une heure, lavez les perles trois fois avec 750 microlitres de liant et de tampon de lavage. Vortex le tube, puis retirez le tampon B&W, puis remettez en suspension dans 30 microlitres de tampon et conservez sur de la glace jusqu’à utilisation.

Diluez environ 35 microgrammes de protéines totales provenant de l’isolement précédemment poly(A) dans 100 microlitres de tampon de liaison et de lavage, puis ajoutez 200 picomoles de l’oligonucléotide antisens approprié et incubez à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes pour faciliter le recuit. Retirez l’ensemble du bloc chauffant de l’appareil et placez-le à température ambiante pendant 10 minutes pour qu’il refroidisse lentement. Ensuite, ajoutez les 30 microlitres de billes magnétiques équilibrées couplées à la streptavidine à l’échantillon, puis incubez le mélange pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius avec une agitation constante à 950 tr/min dans un mélangeur.

Placez le tube sur le support magnétique, retirez le surnageant et lavez les perles trois fois avec 750 microlitres de liant préchauffé et de tampon de lavage à 55 degrés Celsius. Ajoutez 20 microlitres de Tris-HCl de 10 millimolaires et placez-le à 90 degrés Celsius en secouant constamment à 950 tr/min pendant 10 minutes pour éluer l’ARN. Au bout de 10 minutes, placez le tube dans le support magnétique et récupérez immédiatement l’éluat.

Il s’agit d’un gel d’agarose utilisé pour la détection des ARNm par RT-PCR à l’aide d’amorces spécifiques lors de la capture avec des oligo(dT) et d’un oligonucléotide antisens aux ARNm p27 à partir d’un extrait de cellule HEK293. Un contrôle sans oligonucléotides antisens est également mis en évidence. Les voies d’entrée montrent l’ARN total des cellules réticulées.

De plus, les résultats de la compétition avec le poly(A) sont également présentés. Voici une analyse immunoblot de protéines liées à l’ARNm avec des anticorps détectant l’antigène humain R, la protéine de liaison à l’ARN inconnue et la bêta-actine, qui est une protéine de contrôle négative. Le transfert montre que l’antigène humain R a été détecté avec succès dans les isolats de poly(A)ARN lors de la capture d’ARNm p27 avec des oligonucléotides antisens.

L’antigène humain R n’a pas été détecté dans les isolats témoins sans oligonucléotide antisens. Les voies d’entrée montrent les protéines de l’extrait à partir de cellules réticulées et les résultats de la compétition avec le poly(A) sont également présentés. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la spectrométrie de masse peuvent être effectuées pour analyser systématiquement l’ensemble de l’échantillon de protéine interagissant avec un ARN particulier in vivo.

Il est important de noter que TRIP est une approche polyvalente qui peut être adaptée à tous les types d’ARN polyadénylés à travers les organismes pour comprendre l’arrangement dynamique des interactions ARN-protéines. Par conséquent, il peut être utilisé pour étudier les ARN contrôlés par le développement ou liés à la maladie et peut éventuellement conduire à de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique.