Name: Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez la cytométrie en flux phospho pour analyser la signalisation cellulaire au niveau individuel. Cette méthode permet d'identifier des biomarqueurs et d'évaluer la pharmacodynamique.

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Ce travail a été effectué dans le laboratoire du professeur Kjetil Taskén et a été soutenu par la société norvégienne de Cancer et Stiftelsen Kristian Gerhard Jebsen. Johannes Landskron et Marianne Enger sont reconnus pour une lecture critique du manuscrit.

Des échantillons de sang ont été reçues après consentement éclairé de tous les donateurs. L’étude a été approuvée par le Comité régional à usage médical et de santé recherche éthique de la Norvège au sud-est et la recherche sur le sang humain a été effectuée conformément à la déclaration d’Helsinki8.
Remarque : Étapes 1-3 devraient être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte de culture de tissus.
1. isolement de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des échantillons de sang de patients de CLL
ATTENTION : Le sang humain doit être manipulé conformément aux règlements de niveau de biosécurité 2.
<ol><li>Diluer le sang de 1:1 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS : 136,9 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10,1 mM Na2HPO4 x 2 H2O, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) et le transfert aux tubes de 50 mL (tube de 30 mL).</li>
	<li>Soigneusement la couche 10 mL d’un milieu de gradient de densité (par exemple, Lymphoprep) au fond du tube à l’aide d’une pipette 10 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 800 x g pendant 20 min à 4 ° C. Les PBMC sont maintenant visibles sur le dessus de la couche moyenne gradient de densité.</li>
	<li>Utiliser une pipette Pasteur pour transférer les cellules dans deux nouveaux tubes de 50 mL. Laver deux fois avec du PBS (remplir les tubes).</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 15 min. jeter le surnageant et remettre en suspension dans 3 mL de PBS.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’une méthode de choix.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min. jeter le surnageant. Remarque : Étapes de 1,8 à 3,2 sont facultatives. Il est possible de passer directement à l’étape 3.3.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules en sérum fœtal (SVF) additionné de 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et gèle vers le bas en aliquotes appropriés à l’aide de cryo tubes. Remarque : DMSO est toxique pour les cellules. Travail rapide une fois que les cellules sont mélangées avec FBS/DMSO. Les cellules peuvent être stockées à long terme dans l’azote liquide.</li>
</ol>2. la décongélation des cellules
<ol><li>Rapidement décongeler les cellules dans un bain-marie à 37 ° C. Remarque : DMSO est toxique pour les cellules. Travailler vite pour limiter l’exposition au DMSO.</li>
	<li>Laver les cellules une fois avec 10 mL de froid milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 avec GlutaMAX supplémentaire, voir Table des matières).</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI 1640 additionné de pyruvate de sodium, des acides aminés non essentiels MEM et pénicilline/streptomycine (ajouté à une dilution 1 x conformément aux instructions) et 10 % FBS. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire petit et laisser dans un incubateur à 5 % CO2, 37 ° C pendant 1 heure pour permettre les cellules à calibrer.</li>
</ol>3. préparation des cellules
<ol><li>Compter les cellules viables à l’aide d’une méthode de choix.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI 1640 (étape 2.2) additionnés de 1 % FBS à pas plus de 50 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Transférer le montant requis de suspension cellulaire à Herbert George wells dans une plaque de fond V 96 puits. Remarque : Nombre de puits correspond au nombre des conditions à tester. Échantillons pour un temps de stimulation sont tirés d’un puits unique. Calculer 50 µL d’échantillon par point dans le temps + 50 µL de volume mort. Enregistrer les échantillons pour les contrôles de compensation (un échantillon non coloré + un échantillon par codes à barres colorant).</li>
	<li>Transférer la plaque 96 puits dans un bain d’eau préchauffée 37 ° C. Reposer les cellules pendant 10 min.</li>
</ol>4. la stimulation et la Fixation des cellules
Remarque : Effectuez les étapes 4-8 sur le banc de laboratoire (c.-à-d., non stérile).
ATTENTION : L’ingrédient principal du tampon Difficulté j’ai est paraformaldéhyde, qui est toxique (contact peau et inhalation). Manipuler avec précaution.
<ol><li>Préparer une plaque de fond en V puits 96 60 µl de tampon de Difficulté j’ai / puits par échantillon. Laisser dans le bain-marie à 37 ° C. Remarque : Cellules : Solution tampon devrait être de 1:1. Pour permettre l’évaporation à 37 ° C, le tampon de Fix est initialement dans l’abondance.</li>
	<li>Vous pouvez également traiter les cellules avec des médicaments avant la stimulation.</li>
	<li>Transférer un échantillon témoin de 50 µL dans la plaque de fix. La composition de pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Éventuellement, commencer la stimulation temporelle en ajoutant 10 µg/mL anti-IgM aux cellules. La composition de pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Transférer un 50 µL d’échantillon à la plaque de fix à chaque instant. La composition de pipetage de haut en bas. Remarque : IgM anti-induite est généralement initié au début de la signalisation (minutes).</li>
	<li>Laisser la plaque de fix à 37 ° C pendant 10 min après que le dernier échantillon a été ajouté.</li>
</ol>5. fluorescent cellule Barcoding (FCB)
Remarque : Voir le tableau 1 pour une liste de codes à barres réactifs.
<ol><li>Laver les cellules fixes 3 x avec du PBS (remplir les puits).</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Préparer une plaque de fond en V puits 96 avec des réactifs de codes à barres. Pipette 5 µL de chaque réactif de codes à barres / puits dans le nombre de combinaisons pour colorer tous les échantillons après la matrice de coloration, par exemple, dans la Figure 1 b. Chaque échantillon aura une combinaison unique des concentrations de différents codes à barres.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules en 190 µL de PBS et transfert sur la plaque de code à barres. Mélanger soigneusement. Remarque : Détachant un échantillon de compensation la plus forte concentration finale utilisée pour chaque réactif de codes à barres et enregistrer un échantillon non coloré.</li>
	<li>Laissez les cellules pendant 20 min à température ambiante, dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les cellules colorées 2 x avec lavage de flux (PBS, 1 % FBS, 0,09 % d’azide de sodium) (remplir les puits).</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 190 µL de lavage de flux dans les cellules et combiner les échantillons avec code à barres dans un tube de 15 mL. Transférer chaque commande de compensation dans un tube séparé de 1,7 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
</ol>6. cellule perméabilisation pour la coloration des antigènes intracellulaires
ATTENTION : L’ingrédient principal de Perm tampon III est de méthanol qui est toxique (contact par inhalation et la peau) et inflammable. Manipuler avec précaution.
<ol><li>Transférer 2 mL de Perm tampon III dans un tube de 15 mL. Laissez à-20 ° C n’est glacée après utilisation. Remarque : On peut laisser le tampon de Perm à-20 ° C dès le début de l’expérience.</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL de tampon de Perm glacé à la population de cellules avec code à barres (dans un tube de 15 mL) et 100 µL à chaque commande de compensation (dans des tubes de 1,7 mL) titration en vortex pour éviter que les cellules s’agglutiner ensemble.</li>
	<li>Les cellules de transfert directement à-80 ° C. Laissez pendant au moins 30 min. Remarque : Il est naturel de mettre en pause l’expérience à ce stade. Les cellules dans un tampon Perm peuvent être stockées à long terme à-80 ° C.</li>
</ol>7. anticorps
Remarque : Voir Table des matières pour obtenir une liste des déclarés anticorps phospho-spécifiques.
<ol><li>Les cellules de transfert de-80 ° C à une boîte de glace.</li>
	<li>Laver 3 x avec lavage de flux. Remarque : Il est important d’ajouter le flux lavage en excès pour voir le culot cellulaire, par exemple, ajouter 3 mL de lavage de flux à la population de cellules avec code à barres et 1 mL pour chaque commande de compensation.</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre la population de cellules avec code à barres dans un volume de lavage de flux, qui permet à 25 µL de suspension cellulaire par coloration phospho-anticorps. Resuspendre les commandes de compensation dans 200 µL de lavage de flux.</li>
	<li>Préparer des anticorps pour la coloration dans une plaque de fond V 96 puits. Le volume final sera 50 µL/puits. Par puits, ajoutez l’anticorps phospho-spécifiques dilué dans le débit de lavage pour un volume final de 10 µL, marqueur de surface dilué dans le débit de lavage pour un volume final de 15 µL et 25 µL de suspension cellulaire. Remarque : Les dilutions anticorps devraient être réglées avant l’expérience. Inclure le contrôle de l’isotype.</li>
	<li>Laissez les cellules pendant 30 min à température ambiante, dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les cellules colorées 2 x avec lavage de flux (remplir les puits).</li>
	<li>Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules de 150 µL de lavage de flux.</li>
</ol>8. préparation des commandes de Compensation
<ol><li>Préparer les contrôles de compensation pour les anticorps conjugués fluorochromes en parallèle avec la souillure d’anticorps. Utilisez des perles de compensation conformément aux instructions du fournisseur.</li>
</ol>9. analyse en cytométrie en flux
Remarque : L’expérience peut être exécutée sur un cytomètre de flux avec un Sampler élevée de débit (HTS).
<ol><li>Optimiser la tension du tube (PMT) photomultiplicateur avec le contrôle sans coloration.</li>
	<li>Exécuter les contrôles de compensation et de calculer la matrice de compensation.</li>
	<li>Exécuter les exemples. Le taux d’événements devrait être selon les spécifications de l’appareil.</li>
</ol>10. blocage stratégie et analyse des données
<ol><li>Importer les fichiers de FCS de l’expérience d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux comme FlowJo ou Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).</li>
	<li>Stratégie de blocage<ol>
<li>Sélectionnez des lymphocytes en traçant SSC-A contre FSC-a dans une parcelle de dot de densité.</li>
		<li>Affichez les lymphocytes et sélectionnez les maillots en traçant SSC-A contre FSC - W.</li>
		<li>Afficher les cellules individuelles et porte de la cellule type de traçage SSC-A contre le marqueur de surface.</li>
		<li>Afficher la population type de cellule dans un bleu Pacifique contre terrain de densité SSC-A, puis sélectionnez les différentes populations de FCB fondées sur leur intensité de coloration de Pacific Blue (voir la Figure 1 a).</li>
		<li>Tracer le canal d’anticorps phospho contre la chaîne FCB, ou comme un heatmap (voir Figure 1 a) pour afficher les événements de phosphorylation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer phospho-signaux à l’aide de l’arcsinus hyperbolique (arcsinh) de l’IFM (intensité de fluorescence médiane) de phospho-signal versus isotype contrôle (taux de phosphorylation basale, voir Figure 1), ou de stimulée par rapport populations de cellules non stimulées (voir Figure 1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
<li>Myhrvold, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+phospho-protein+levels+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia.</a> Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).</li>
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<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

L’auteur n’a rien à divulguer.

Phospho cytométrie en flux est une technique puissante pour mesurer le taux de phosphorylation de protéines dans des cellules individuelles. Étant donné que la méthode s’appuie sur la coloration avec des anticorps, phospho cytométrie en flux est limitée par la disponibilité des anticorps. En outre, afin d’obtenir des résultats fiables, les anticorps devraient être titrés et vérifiés avant toute utilisation. Un protocole détaillé pour le titrage d’anticorps phospho-spécifiques ont été décrits ailleurs12<...

Phospho cytométrie en flux est utilisé pour analyser le taux de phosphorylation de protéines à cellule unique résolution. L’objectif global de la méthode consiste à mapper les modèles de signalisation cellulaires dans des conditions spécifiées. En exploitant la capacité multiparamétrique de cytométrie en flux, plusieurs voies de signalisation peuvent être analysés simultanément dans différents sous-ensembles d’une population de cellules hétérogènes tels que du sang périphérique. Ces traits de caractère offrent des avantages par rapport aux autres technologies axées sur les anticorps comme immunohistochimie, immuno enzymatique (ELISA), alignement de protéine et inversion de phase protéine tableau (RPPA)1. Cytométrie en flux phospho est cumulable avec cellule fluorescente barcoding (FCB), ce qui signifie que les échantillons de cellules individuelles sont étiquetés avec des signatures uniques de colorants fluorescents afin qu’ils peuvent être mélangés entre eux, colorées et analysés comme un seul échantillon2. Cela réduit la consommation d’anticorps, augmente la robustesse des données grâce à la combinaison du contrôle et des échantillons traités et améliore la vitesse d’acquisition. La population combinée de FCB soient divisée en plus petits échantillons et colorée avec jusqu'à 35 anticorps phospho-spécifiques distincts, selon la quantité de matière première. Grandes expériences de profilage peuvent, ainsi, être exécutés avec le matériel standard cytomètre. Phospho écoulement cytometry a été appliqué au profil de signalisation dans les échantillons des patients de plusieurs cancers hématologiques, y compris la leucémie lymphoïde chronique (LLC)3,4,5, leucémie myéloïde aiguë (LMA) de lymphomes non hodgkiniens et 6 7. Phospho cytométrie en flux est donc une approche puissante pour caractériser des aberrations signalisation, identifier et valider des biomarqueurs et évaluer pharmacodynamique.
Ici, le protocole optimisé pour l’analyse des échantillons de patients de CLL par cytométrie en flux phospho est fourni (Figure 1 a). Exemples de caractérisation de signalisation basale, stimulation des récepteurs cellulaires anti-IgM/B et perturbation de la drogue sont indiqués. Une description détaillée d’une matrice FCB est fournie. Le protocole peut facilement être adapté à d’autres types de cellules de suspension.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>Additif au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>Additif au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>Additif au milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>Milieu de gradient de densité</td></tr><tr><td>Anti-IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>Pour la stimulation du récepteur des cellules B</td></tr><tr><td>BD Phosflow Fix Buffer I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>Tampon de fixation</td></tr><tr><td>BD Phosflow Perm Buffer III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>Tampon de perméabilisation</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>Réactif de codage</td></tr><tr><td>à barres Pacific Blue Succinimidyl Ester</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>Réactif de codage</td></tr><tr><td>à barres Pacific Orange Succinimidyl Ester, sel de triéthylammonium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>Réactif de codage à barres</td></tr><tr><td>Perles de compensation</td><td>Defined by user</td><td></td><td>Correct species réactivité</td></tr><tr><td>Tubes Falcon</td><td>Défini par l’utilisateur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf</td><td>Défini par l’utilisateur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond en V à 96 puits</td><td>Défini par l’utilisateur</td><td></td><td>Compatible avec le cytomètre</td></tr><tr><td>en flux Centrifugeuses</td><td>Défini par l’utilisateur</td><td></td><td>Pour les tubes Eppendorf, les tubes Falcon et les plaques</td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Défini par l’utilisateur</td><td></td><td>Cytomètre en flux régulé</td></tr> <tr><td></td><td>en températureDéfini par l’utilisateur</td><td></td><td>Avec échantillonneur à haut débit (HTS)</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4075</td><td>Clone : D9E Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans les cellules normales et transformées&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>Clone : F-1 Référence : </fort> Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>Clone : J117-1278 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Les inhibiteurs de la tyrosine kinase de la rate réduisent&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale chez normal et transformé&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>Clone : N35-86 Reference : Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B dans&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td>Clone : 24a/BTK (Y551)&nbsp ; Référence : Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale chez normal and transformed&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>Clone : 24a/BTK (Y551)&nbsp ; Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62</td></tr><tr><td>CD3&zeta ; (pY142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td>Clone : K25-407.69 Référence : Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>Clone : D2C8 Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284</td></tr><tr><td>I&kappa ; B&alpha ;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5743</td><td>Clone : L35A5 Référence : Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation du récepteur des cellules B dans&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>Clone : I58-1169 Référence : </fort> Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>Clone : 4/LCK-Y505&nbsp ; Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>Clone : J114-64 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410</td></tr><tr><td>NF-&kappa ; B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>Clone : K10-895.12.50 Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans le normal et transformé&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>NF-&kappa ; B p65 (pS536)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4887</td><td>Clone : 93H1 Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans les cellules normales et transformées&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4552</td><td>Clone : 28B10 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>Clone : E10 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans le normal et transformé&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><<td>strong>Clone : 16G8 Référence : Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication et surexpression de Bcl-2&hellip ;, Blood, 109(6) :2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone : Polyclonal Reference : Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication et Bcl-2 overexpression&hellip ;, Blood, 109(6) :2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><<td>strong>Clone : Polyclonal Reference : Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication et surexpression de Bcl-2&hellip ;, Blood, 109(6) :2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><<td>strong>Clone : Polyclonal Reference : Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication et surexpression de Bcl-2&hellip ;, Blood, 109(6) :2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>Clone : Polyclonal Référence : Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication et surexpression de Bcl-2&hellip ;, Blood, 109(6) :2589-96</td></tr><tr><td>PLC&gamma ; 2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>Clone : K86-689.37 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B dans&hellip ;, Sang, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>Clone : J112-906 Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>S6-Ribos. Prot. (pS235/236)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4851</td><td>Clone : D57.2.2E Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9257</td><td>Clone : G9 Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélium pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>Clone : J141-668.36.58&nbsp ; Référence : Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>Clone : 4a&nbsp ; Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B dans&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>Clone : 4/P-STAT3 Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>Clone : Polyclonal Référence : Uzel et al., 2001, Détection de STAT-4 phosphorylé intracellulaire par cytométrie en flux, Clin Immunol, 100(3) : 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>Clone : 47/Stat5(pY694) Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation du récepteur des lymphocytes B dans&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>Clone : 18/P-Stat6 Reference : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12081</td><td>Clone : C87C1 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Les inhibiteurs de la tyrosine kinase de la rate réduisent&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>Clone : 17A/P-ZAP70 Référence : Sk&aring ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans les cellules normales et transformées&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B dans&hellip ;, Sang, 129(6) : 759-770</td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de biomarker

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Signalisation cellulaire aberrante joue un rôle central dans le développement du cancer et de la progression. Plus de nouvelles thérapies ciblées visent en effet les protéines et les fonctions des protéines et des aberrations signalisation cellulaire peuvent donc servir de biomarqueurs pour indiquer les options de traitement personnalisé. Par opposition à des analyses d’ADN et d’ARN, changements dans l’activité de la protéine peuvent évaluer plus efficacement les mécanismes qui sous-tendent la résistance et sensibilité aux médicaments. Phospho cytométrie en flux est une technique puissante qui mesure les événements de phosphorylation de la protéine au niveau cellulaire, une caractéristique importante qui distingue cette méthode d’autres approches axées sur les anticorps. La méthode permet l’analyse simultanée de plusieurs protéines de signalisation. En combinaison avec cellule fluorescente barcoding, grands ensembles de données moyen - à haut-débit peuvent être acquis par matériel standard cytomètre en peu de temps. Phospho-cytométrie a des applications aussi bien dans des études de biologie fondamentale et en recherche clinique, y compris l’analyse, découverte de biomarqueurs et l’évaluation de la pharmacodynamique de signalisation. Ici, un plan expérimental détaillé est fourni pour l’analyse de flux de phospho de cellules mononucléaires de sang périphérique purifiée, utilisant des cellules de la leucémie lymphoïde chronique à titre d’exemple.

Les principales étapes du protocole phospho écoulement cytometry sont illustrées dans la Figure 1 a. Dans l’exemple présenté, cellules CLL ont été colorées avec le réactif de barcoding Pacific Blue à quatre dilutions. Code à barres en trois dimensions peut être effectuée en combinant trois colorants de codes à barres, comme illustré dans la Figure 1 b. Les échantillons individuels sont ensuite déconvolutés par blocage subséquent ...

Est présenté ici, un protocole d’analyse moyen - à haut-débit des événements de phosphorylation de la protéine au niveau cellulaire. Phospho cytométrie en flux est une approche puissante pour caractériser des aberrations signalisation, identifier et valider des biomarqueurs et évaluer pharmacodynamique.

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et de l’immunologie, comme comment les voies de signalisation sont-elles affectées par différents stimuli ou médicaments? Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous permet d’effectuer une analyse de signalisation cellulaire unique de façon moyenne à élevée. Après avoir re-suspendre les cellules dans le milieu supplémentaire RPMI 16/40, transférer la quantité requise de suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de 96 puits V-fond.Transférer la plaque dans un bain d’eau préchauffé de 37 degrés Celsius et lui permettre de s’y reposer pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 60 microlitres de tampon fixe un à chaque puits d’une nouvelle plaque de puits 96 pour installer la plaque fixe. Placez cette plaque dans le bain d’eau de 37 degrés Celsius.Transférez un échantillon de contrôle de 50 microlitres dans la plaque et mélangez-le en faisant des tuyaux de haut en bas. En option, ajoutez 10 microlitres par millilitre anti-IgM aux cellules pour commencer le cours du temps de simulation et mélanger en pipetting de haut en bas. Transférez un échantillon de 50 microlitres à la plaque fixe à chaque point de temps, en mélangeant chaque échantillon au fur et à mesure qu’il est ajouté.Après l’ajout du dernier échantillon, laisser la plaque fixe dans le bain d’eau pendant 10 minutes. Tout d’abord, laver les cellules trois fois avec PBS. Centrifuger la plaque à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le supernatant.Ensuite, préparez une plaque fraîche de 96 puits en V-fond avec des reagents de codage à barres, en pipetant cinq microlitres de chaque reagent de codage à barres dans chaque puits remplissant le nombre de puits nécessaires pour tacher chacun des échantillons. Dans la plaque cellulaire fixe, résuspendez les cellules dans chaque puits avec 190 microlitres de PBS. Ensuite, transférez chaque puits de cellules au puits correspondant dans la plaque de codage à barres, en mélangeant chacun bien à fond.Laisser reposer l’assiette à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Centrifuger la plaque à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Après cela, laver les cellules dans chaque puits deux fois avec le lavage d’écoulement.Ajouter ensuite 190 microlitres de lavage d’écoulement à chaque puits de cellules. Combinez tous les échantillons codés à barres en un seul tube de 15 millilitres et transférez chaque commande de compensation dans un tube séparé de 1,7 millilitre. Centrifugeuse à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le surnatant.Pour commencer, transférez deux millilitres de tampon perm trois à un tube de 15 millilitres. Conserver à moins 20 degrés Celsius de sorte qu’il fera froid lorsqu’il sera utilisé. Lorsqu’il est prêt, ajouter 1,5 millilitres de tampon perm froid de glace au tube de 15 millilitres contenant la population cellulaire codée à barres dropwise tout en vortexing pour éviter l’agglutination cellulaire.Ajouter 100 microlitres de tampon perm glacé à chacun des contrôles de compensation de la même manière. Transférez immédiatement les cellules dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Lorsque vous êtes prêt à commencer à colorer l’antigène, retirez les cellules du congélateur et transférez-les dans une boîte de glace.Lavez les cellules trois fois avec un excès de lavage d’écoulement. Centrifuger les cellules à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la population de cellules codées à barres dans un volume de lavage d’écoulement, de sorte qu’il y a 25 microlitres de suspension cellulaire par tache de phospho-anticorps.Suspendre à nouveau les contrôles de compensation dans 200 microlitres de lavage d’écoulement. Pour commencer à préparer des anticorps pour la coloration, ajouter 10 microlitres d’anticorps spécifiques au phospho, dilués dans le lavage d’écoulement, à chaque puits d’une plaque fraîche de 96 puits en V-fond. Ajouter 15 microlitres de marqueur de surface, dilués dans le lavage d’écoulement et 25 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits pour un volume final de 50 microlitres par puits.Laisser reposer les cellules pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après cela, lavez les cellules tachées deux fois avec le lavage d’écoulement. Centrifugeuse à 500 fois G pendant cinq minutes.Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 150 microlitres de lavage d’écoulement. Effectuez ensuite l’analyse de cytométrie du débit telle qu’elle est décrite dans le protocole de texte. Dans le protocole présenté, le codage à barres tridimensionnel est effectué en combinant trois dyes de codage à barres.Les échantillons individuels sont ensuite dé-alambiqués par des gations ultérieures sur chaque reagent de codage à barres par rapport à la zone de dispersion latérale. Les niveaux basaux et de stimulation induits de phosphorylation de 20 molécules de signalisation en aval du récepteur de cellules B sont alors caractérisés dans les cellules B des patients de CLL et les contrôles normaux dans diverses conditions. Le stat3 phospho tyrosine 705 est considéré comme significativement réglementé.Les cellules sont stimulées par l’anti-IgM pendant jusqu’à 30 minutes afin d’identifier les aberrations de signalisation induites par la voie des récepteurs cellulaires B. Tandis que les cellules de CLL des patients présentant l’affichage nonmuté d’IGVH ont augmenté la sensibilité vers la stimulation d’anti-IgM, elle est seulement statistiquement significative pour le sérine phosphore d’AKT 473. Les cellules sont ensuite exposées à l’idelalisib inhibiteur du delta de l’IP 3 kinase pour tester si le signal aberrant AKT pS473 peut être inversé.Comme indiqué ici, les niveaux aberrants sont sensiblement réduits sur le traitement d’une manière dépendante de concentration démontrant que des inhibiteurs de kinase peuvent être appliqués pour normaliser la signalisation aberrante dans les cellules de CLL. Avant d’essayer cette procédure, il est important de se rappeler de titrer les reagents et les anticorps de codage à barres, et de vérifier que certains marqueurs de surface sont compatibles avec les reagents de fixation et de permeabilisation. Les cellules doivent être en suspension pour l’analyse du phosphore, encore le protocole peut être adapté aux cellules aberrantes ou des tissus suivant les procédures pour obtenir une suspension cellulaire unique, comme la trypzination entière.

phospho-flow-cytometry-with-fluorescent-cell-barcoding-for-single

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La méthode IP-FCM est présenté, ce qui permet un sensible, robuste, l'évaluation biochimique de la maternelle interactions protéine-protéine, sans exiger le génie génétique ou échantillons de grande taille.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

La localisation subcellulaire des protéines est important dans la détermination de la régulation spatio-temporelle de la signalisation cellulaire. Ici, nous décrivons bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) comme une méthode simple pour le suivi des interactions spatiale des protéines dans la cellule.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Dans cette vidéo, nous démontrons l’interaction entre les protéines et les vésicules phospholipidiques artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux. La liaison des protéines marquées par fluorescence aux vésicules phospholipidiques marquées par fluorescence augmente l’intensité moyenne de la fluorescence, et cette augmentation est détectée par un cytomètre en flux.

Cytométrie quantitative en flux pour étudier les interactions entre les protéines marquées et les vésicules phospholipidiques

Cette vidéo met en évidence une méthode protéomique unicellulaire qui utilise des anticorps conjugués à des métaux lourds pour un codage à barres cellulaire distinct. Par la suite, l’immunocoloration et la cytométrie de masse sont appliquées pour évaluer les altérations immunitaires, phénotypiques et fonctionnelles dans les cellules immunitaires dérivées du sang total humain.

Un test de codage à barres pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules immunitaires

L'analyse par cytométrie de complémentation de fluorescence bimoléculaire fournit une méthode quantitative à haut débit pour étudier l'interaction protéine-protéine. Cette méthode peut être appliquée à des sites de liaison aux protéines de cartographie et de criblage de facteurs qui régulent l'interaction protéine-protéine.

L&#39;analyse par cytométrie de flux par fluorescence bimoléculaire complémentation: une méthode quantitative à haut débit pour étudier l&#39;interaction protéine-protéine

Depuis la découverte du gène de la protéine fluorescente verte, les protéines fluorescentes ont eu un impact sur la biologie cellulaire moléculaire. Ce protocole décrit comment l’expression de protéines fluorescentes distinctes par génie génétique est utilisée pour coder des cellules individuelles. La procédure permet de suivre des populations distinctes dans un mélange de cellules, ce qui est idéal pour les applications multiplexées.

Code-barres génétique avec protéines fluorescentes pour des applications multiplexés

Phosphoinositides sont des lipides dont l'abondance relative change rapidement en réponse à divers stimuli de signalisation. Cet article décrit une méthode pour mesurer l'abondance des phosphoinositides par les cellules métaboliquement étiquetage avec 3 H- myo-inositol, suivie par l'extraction et la désacylation. Glycéro-inositides extraites sont ensuite séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance et quantifiés par scintillation de flux.

Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Nous présentons ici une bicouche lipidique supportée dans le contexte d'une plate-forme microfluidique pour étudier les interactions protéines-phosphoinositides en utilisant une méthode sans étiquette basée sur la modulation du pH.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Ici, nous décrivons un ensemble de méthodes pour caractériser l’interaction des protéines avec les membranes de cellules ou de microvésicules.

Analyse de l’interaction des protéines marquées par fluorescence avec des microvésicules de phospholipides artificielles à l’aide de la cytométrie quantitative en flux

Découvrez la cytométrie en flux phospho pour analyser la signalisation cellulaire au niveau individuel. Cette méthode permet d'identifier des biomarqueurs et d'évaluer la pharmacodynamique.

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker (Vidéo) | JoVE Journal

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

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