Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

Est présenté ici, un protocole d’analyse moyen - à haut-débit des événements de phosphorylation de la protéine au niveau cellulaire. Phospho cytométrie en flux est une approche puissante pour caractériser des aberrations signalisation, identifier et valider des biomarqueurs et évaluer pharmacodynamique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire et de l’immunologie, comme comment les voies de signalisation sont-elles affectées par différents stimuli ou médicaments? Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous permet d’effectuer une analyse de signalisation cellulaire unique de façon moyenne à élevée. Après avoir re-suspendre les cellules dans le milieu supplémentaire RPMI 16/40, transférer la quantité requise de suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de 96 puits V-fond.

Transférer la plaque dans un bain d’eau préchauffé de 37 degrés Celsius et lui permettre de s’y reposer pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 60 microlitres de tampon fixe un à chaque puits d’une nouvelle plaque de puits 96 pour installer la plaque fixe. Placez cette plaque dans le bain d’eau de 37 degrés Celsius.

Transférez un échantillon de contrôle de 50 microlitres dans la plaque et mélangez-le en faisant des tuyaux de haut en bas. En option, ajoutez 10 microlitres par millilitre anti-IgM aux cellules pour commencer le cours du temps de simulation et mélanger en pipetting de haut en bas. Transférez un échantillon de 50 microlitres à la plaque fixe à chaque point de temps, en mélangeant chaque échantillon au fur et à mesure qu’il est ajouté.

Après l’ajout du dernier échantillon, laisser la plaque fixe dans le bain d’eau pendant 10 minutes. Tout d’abord, laver les cellules trois fois avec PBS. Centrifuger la plaque à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le supernatant.

Ensuite, préparez une plaque fraîche de 96 puits en V-fond avec des reagents de codage à barres, en pipetant cinq microlitres de chaque reagent de codage à barres dans chaque puits remplissant le nombre de puits nécessaires pour tacher chacun des échantillons. Dans la plaque cellulaire fixe, résuspendez les cellules dans chaque puits avec 190 microlitres de PBS. Ensuite, transférez chaque puits de cellules au puits correspondant dans la plaque de codage à barres, en mélangeant chacun bien à fond.

Laisser reposer l’assiette à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Centrifuger la plaque à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Après cela, laver les cellules dans chaque puits deux fois avec le lavage d’écoulement.

Ajouter ensuite 190 microlitres de lavage d’écoulement à chaque puits de cellules. Combinez tous les échantillons codés à barres en un seul tube de 15 millilitres et transférez chaque commande de compensation dans un tube séparé de 1,7 millilitre. Centrifugeuse à 500 fois G pendant cinq minutes et jeter le surnatant.

Pour commencer, transférez deux millilitres de tampon perm trois à un tube de 15 millilitres. Conserver à moins 20 degrés Celsius de sorte qu’il fera froid lorsqu’il sera utilisé. Lorsqu’il est prêt, ajouter 1,5 millilitres de tampon perm froid de glace au tube de 15 millilitres contenant la population cellulaire codée à barres dropwise tout en vortexing pour éviter l’agglutination cellulaire.

Ajouter 100 microlitres de tampon perm glacé à chacun des contrôles de compensation de la même manière. Transférez immédiatement les cellules dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Lorsque vous êtes prêt à commencer à colorer l’antigène, retirez les cellules du congélateur et transférez-les dans une boîte de glace.

Lavez les cellules trois fois avec un excès de lavage d’écoulement. Centrifuger les cellules à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez la population de cellules codées à barres dans un volume de lavage d’écoulement, de sorte qu’il y a 25 microlitres de suspension cellulaire par tache de phospho-anticorps.

Suspendre à nouveau les contrôles de compensation dans 200 microlitres de lavage d’écoulement. Pour commencer à préparer des anticorps pour la coloration, ajouter 10 microlitres d’anticorps spécifiques au phospho, dilués dans le lavage d’écoulement, à chaque puits d’une plaque fraîche de 96 puits en V-fond. Ajouter 15 microlitres de marqueur de surface, dilués dans le lavage d’écoulement et 25 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits pour un volume final de 50 microlitres par puits.

Laisser reposer les cellules pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après cela, lavez les cellules tachées deux fois avec le lavage d’écoulement. Centrifugeuse à 500 fois G pendant cinq minutes.

Jetez le supernatant et suspendez les cellules en 150 microlitres de lavage d’écoulement. Effectuez ensuite l’analyse de cytométrie du débit telle qu’elle est décrite dans le protocole de texte. Dans le protocole présenté, le codage à barres tridimensionnel est effectué en combinant trois dyes de codage à barres.

Les échantillons individuels sont ensuite dé-alambiqués par des gations ultérieures sur chaque reagent de codage à barres par rapport à la zone de dispersion latérale. Les niveaux basaux et de stimulation induits de phosphorylation de 20 molécules de signalisation en aval du récepteur de cellules B sont alors caractérisés dans les cellules B des patients de CLL et les contrôles normaux dans diverses conditions. Le stat3 phospho tyrosine 705 est considéré comme significativement réglementé.

Les cellules sont stimulées par l’anti-IgM pendant jusqu’à 30 minutes afin d’identifier les aberrations de signalisation induites par la voie des récepteurs cellulaires B. Tandis que les cellules de CLL des patients présentant l’affichage nonmuté d’IGVH ont augmenté la sensibilité vers la stimulation d’anti-IgM, elle est seulement statistiquement significative pour le sérine phosphore d’AKT 473. Les cellules sont ensuite exposées à l’idelalisib inhibiteur du delta de l’IP 3 kinase pour tester si le signal aberrant AKT pS473 peut être inversé.

Comme indiqué ici, les niveaux aberrants sont sensiblement réduits sur le traitement d’une manière dépendante de concentration démontrant que des inhibiteurs de kinase peuvent être appliqués pour normaliser la signalisation aberrante dans les cellules de CLL. Avant d’essayer cette procédure, il est important de se rappeler de titrer les reagents et les anticorps de codage à barres, et de vérifier que certains marqueurs de surface sont compatibles avec les reagents de fixation et de permeabilisation. Les cellules doivent être en suspension pour l’analyse du phosphore, encore le protocole peut être adapté aux cellules aberrantes ou des tissus suivant les procédures pour obtenir une suspension cellulaire unique, comme la trypzination entière.