Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la néphrologie sur le rôle du trafic de protéines de surface cellulaire dans les maladies rénales protéiques et non protéinées. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle facilite l’étude du trafic de protéines de surface cellulaire in vivo et que plus d’une protéine peut être analysée par expérience. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du trafic de surface des cellules glomerular, peut également être appliquée à d’autres systèmes d’organes qui sont perfusés et sont accessibles par des techniques d’isolement.

Commencez par confirmer un manque de réponse au pincement des pieds et désinfecter le côté ventral de la souris anesthésiée avec 70% d’isopropyl. Faire une coupe médiane à travers la peau du bassin au sternum et utiliser des pinces à épiler pour enlever la peau du fascia abdominal. Couper la peau des deux côtés de la ligne médiane abdominale et faire un milieu à travers la couche musculaire abdominale de la vessie au xiphoïde.

Utilisez les ciseaux et les forceps pour diviser les muscles en quatre quadrants et utilisez deux pinces chirurgicales pour fixer les deux quadrants supérieurs vers le cou des animaux. Placez l’animal sous un microscope disséquant et utilisez un échange stérile pour déplacer de côté les organes viscérals. À l’aide de ciseaux fins, couper le ligament phrénique hépatique.

À l’aide de pinces chirurgicales fines, placez une suture autour de l’artère mésentérique hépatique branial des artères rénales. Et autour de l’aorte, proximale aux artères rénales, à la glande surrénale. Libérez l’aorte distale du fascia, de la graisse et d’autres tissus.

Puis, pincez la vena cava et l’aorte à la hauteur de la bifurcation et placez une autre suture autour de l’aorte distal des artères rénales. Utilisez des pincettes pour resserrer la suture aortique proximale, atténuant le flux sanguin et couper un petit trou la moitié du diamètre de l’aorte dans l’aorte, distal aux artères rénales. Insérez un cathéter de 10 centimètres attaché à une seringue de 10 millilitres contenant cinq millilitres de PBS glacé plus calcium et magnésium dans l’aorte.

Et fixer le cathéter avec les ligatures préparées. Commencez ensuite à perfuser les reins à un débit de deux millilitres par minute. À l’aide de ciseaux fins pour couper un trou dans la veine rénale des artères rénales et resserrer la suture autour des artères hépatique et mésentérique.

Après que le volume entier de PBS ait été livré remplace le perfusate par cinq millilitres de PBS froid de glace plus le calcium et le magnésium complétés avec 0.5 milligrammes par biotine millilitres pour l’étiquetage de surface. Continuer à parcourir les reins à un débit de deux millilitres par minute. Lorsque tout le volume a été livré, fixez une seringue contenant cinq millilitres de PBS glacé ainsi que du calcium et du magnésium complétés par de la glycine de 100 millimlaires au cathéter.

Étanchez le glomeruli avec les cinq millilitres de la solution glycine à un débit de deux millilitres par minute. Puis parcourir les reins avec cinq millilitres de PBS glacé plus le calcium et le magnésium complété par 200 microlitres de perles magnétiques par millilitre à un débit de deux millilitres par minute. L’embolisation du glomeruli avec les perles magnétiques brunes sera visible sur la surface rénale.

Lorsque toutes les perles ont été livrées enlever la capsule des reins et de récolter les reins à l’hilum. Placez les reins dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres contenant 15 millilitres de PBS plus calcium et magnésium. Utilisez une nouvelle lame à double tranchant pour couper les reins en plus petits morceaux possibles.

Transférer le tissu dans un tube de deux millilitres contenant un millilitre de collagène A pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, en mélangeant la solution tissulaire doucement avant et après la digestion avec une pointe de pipette modifiée de 1000 microlitres. À la fin de l’incubation, filtrer le tissu digéré à travers une passoire cellulaire de 100 microns. Utilisez un grattoir cellulaire et un PBS glacé, ainsi que du calcium et du magnésium pour écraser le reste du tissu à travers la passoire cellulaire.

Apportez le volume final de la suspension d’une seule cellule rénale jusqu’à 50 millilitres avec pbs froid glacé frais plus calcium et magnésium et recueillir les cellules rénales par centrifugation. Retirez le supernatant puis suspendez la pastille avec un peu moins de 1,5 millilitres de PBS glacé plus calcium et magnésium tout en vortexant et transférez la suspension glomerular dans un nouveau tube de deux millilitres. Pour laver le glomeruli, placez le tube dans un aimant pour agréger le glomeruli.

Après une minute, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour enlever le supernatant. Et retirez le tube de l’aimant. Ajouter un millilitre de PBS plus le calcium et le magnésium aux tissus.

Pipette le glomeruli de haut en bas une fois et vortex les cellules. Remettre le tube à l’aimant et laver le glomeruli à nouveau comme il vient de le démontrer. Jusqu’à ce qu’une pureté de l’échantillon ait atteint au moins 90 % par analyse au microscope léger à un grossissement de 40 à 100 X.

Puis recueillir la perle magnétique purifié glomeruli par centrifugation. Pour atteindre une pureté supérieure à 95%, le glomeruli devait être lavé à fond comme démontré. La perfusion de biotine facilite l’étiquetage des boucles capillaires dans les reins de souris perfusés biotine mais non contrôlés.

Les précipitations immunitaires de la fraction de biotine des extraits glomériques révèlent que les protéines transmembranes glomerular néphrin et podocalyxin sont immunoprécipitées avec la biotine mais pas avec la fraction de contrôle. La coloration de la fraction immunoprécipitée avec la streptavidine confirme davantage la présence de néphrine laded de biotine dans les animaux perfusés de biotine mais pas de contrôle perfusé. La cadhérine endothéliale vasculaire de protéine endothéliale et la molécule intracellulaire d’adhérence deux sont également immunopréciées dans la fraction de biotine.

Dans la phase précoce de néphrite néphrotoxique, une expression réduite de la néphrine de surface cellulaire est observée chez les animaux néphrite néphrotoxiques par rapport aux témoins. En effet, l’analyse densitometic montre une réduction significative de la néphrine laded de biotine chez les animaux néphrite néphrotoxiques comparés aux contrôleurs. L’analyse quantitative du rapport néphrine-actine total ne révèle aucune différence significative entre les souris témoins et néphrites néphrotoxiques.

En outre, des quantités égales de podocytes sont observées chez les néphrites néphrotoxiques et les animaux témoins. Dans la néphrite néphrotoxique tardive, les animaux néphritiques néphrotoxiques présentent une récupération de l’expression néphrin sans différences significatives dans la néphrine de surface cellulaire mesurée entre les souris nephritiques de contrôle et néphrotoxiques et une réduction totale globale de néphrine chez les animaux néphritiques néphrotoxiques. De plus, le nombre de podocytes diminue par rapport aux animaux de contrôle.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder les seringues bulle libre pendant leur connexion afin d’éviter l’embolie de l’air du glomeruli et de travailler dans des conditions glacées une fois la perfusion rénale a commencé. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’isolement de l’ARN glomeruli et des protéines peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur l’expression des protéines ou les interactions dans les reins sains et maladies.