Name: Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Apprenez une méthode standardisée d'analyse quantitative de la composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées chez la souris par marquage immunofluorescent.

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Nous remercions le centre d’imagerie biologique (pris en charge par le NIH 1S10OD019973-01) à l’Université de Pittsburgh, pour leur aide. Ce travail a été soutenu par est pris en charge par bourse de développement scientifique 15SDG25860021 de l’American Heart Association à la D.G. R.A.B. a été pris en charge par NIH grant F30 HL136188.

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<li>Kirii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+interleukin-1beta+decreases+the+severity+of+atherosclerosis+in+ApoE-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).</li>
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<li>Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+at+specific+gene+loci+in+single+cells+in+histological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections.</a> Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).</li>
<li>Feil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+to+macrophage-like+cells+during+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis.</a> Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).</li>
<li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nature Medicine. 21, 628(2015).</li>
<li>Cherepanova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+pluripotency+factor+OCT4+in+smooth+muscle+cells+is+atheroprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective.</a> Nature Medicine. 22, 657(2016).</li>
<li>Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+cells+involved+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).</li>
<li>Chappell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Proliferation+of+a+Subset+of+Differentiated%2C+yet+Plastic%2C+Medial+Vascular+Smooth+Muscle+Cells+Contributes+to+Neointimal+Formation+in+Mouse+Injury+and+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models.</a> Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).</li>
<li>Newman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irradiation+abolishes+smooth+muscle+investment+into+vascular+lesions+in+specific+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li>
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<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+regulates+clonality+and+fate+of+smooth+muscle-derived+atherosclerotic+plaque+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 2073(2018).</li>
<li>Majesky, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Smooth+Muscle+Cells+Generate+a+Subpopulation+of+Resident+Vascular+Progenitor+Cells+in+the+Adventitia+Regulated+by+Klf4%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4.</a> Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Malgré des décennies de recherche et de progrès techniques dans l’étude de l’athérosclérose, le domaine a une histoire décevante de traduire des résultats scientifiques aux thérapies cliniques34,35. Ce phénomène peut s’expliquer en partie par des différences dans les modèles animaux expérimentaux et analyses de la lésion. Ici, nous décrivons un pipeline expérimental que nous avons utilisé pour analyser la composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques...

L’athérosclérose est la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde entier qui sous-tend la plupart des maladies des artères coronaires, maladies artérielles périphériques et les AVC. Stades de l’athérosclérose coronarienne peut entraîner des complications sévères, y compris la comptabilité d’infarctus du myocarde pour près de 16 % du monde population mortalité1,2. En raison de ses effets dévastateurs sur la santé publique, un effort important a été déposée auprès de décrypter les mécanismes conduisant la progression de l’athérosclérose, ainsi que de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pourtant, le taux de probabilité d’approbation (LOA) d’essais cliniques pour les maladies cardiovasculaires est parmi les plus faibles comparativement aux autres domaines cliniques (seulement 8,7 % pour la phase I)3. Cela peut s’expliquer en partie par les nombreux obstacles que l’athérosclérose pose au développement de médicaments efficaces dont sa nature presque ubiquiste, cliniquement silencieuse progression et hétérogénéité significative de la maladie. En outre, la conception sous-optimal des études précliniques sur des animaux aussi peut s’expliquer le manque de succès dans la traduction clinique. Plus précisément, il nous paraît nécessaire mettre en œuvre des études d’intervention lorsque c’est possible d’étudier l’efficacité des stratégies thérapeutiques. En outre, il y a un besoin essentiel d’effectuer des procédures normalisées pour les analyses de lésion incluant la caractérisation avancée des composition cellulaire avancé lésion athéroscléreuse de phénotypage et cartographie sort.
La grande majorité des études de l’athérosclérose se concentrer sur les modèles de prévention de l’athérosclérose consistant en médicaments traitement ou gène manipulation (knockout ou knock-in) chez la souris jeunes, avant le déclenchement de la maladie et la progression. Ces études ont découvert un grand nombre de gènes et molécules de signalisation qui jouent un rôle dans le développement de l’athérosclérose. Toutefois, la plupart de ces objectifs ne se traduisent par des thérapies efficaces chez les humains. En effet, il est difficile d’extrapoler l’effet une thérapie sur jeune chez la souris pour les personnes âgées atteintes de lésions athéroscléreuses avancées. Ainsi, la mise en œuvre des études d’intervention dans le pipeline expérimental préclinique probable offre une représentation plus précise de la pertinence et l’efficacité d’une nouvelle thérapeutique. L’idée est soutenue par les effets très divergentes de l’inhibition de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β) lorsque vous employez une prévention4,5,6 ou intervention stratégie7. Différences entre prévention et études d’intervention suggèrent que les différents processus cellulaires se produisent à différentes phases du développement de l’athérosclérose et met en évidence le fait que les études de prévention sont probables insuffisantes pour modéliser le scénario clinique adéquatement.
L’American Heart Association a récemment publié une déclaration scientifique détaillant les recommandations pour la conception expérimentale appropriée, normalisation procédurale, analyse et signalement des animaux athérosclérose études8. Il met en évidence les avantages et les limites des techniques prédominantes utilisées dans le domaine. Par exemple, visage en Soudan IV coloration de l’aorte est souvent interprétée comme une première lecture. Bien que le visage en Soudan IV coloration des dépôts de lipides est une méthode appropriée pour l’évaluation du fardeau global de plaque, il est incapable de distinguer les lésions de stade précoce gras strie de lésions de stades plus avancées. Par conséquent, l’interprétation de la coloration du visage en est souvent ambigu et superficielle9. Une analyse minutieuse des tissus, coupes à l’aide de la taille de navire, lésion et lumen paramètres morphologiques et la quantification des indices de stabilité de la lésion fournit une compréhension plus précise de l’effet d’une expérience.
Enfin, des études de histopathologie humaine ont suggéré que la composition cellulaire est un meilleur indicateur de rupture que la taille de lésion elle-même, avec les pauvres de lésions dans les cellules musculaires lisses (SMC) et riche en macrophages étant plus susceptibles de se rompre à10, 11. Ces observations étaient basées sur une coloration pour marqueurs classiquement utilisés pour l’identification de la cellule (c.-à-d. ACTA2 pour SMC et LGALS3 ou CD68 de macrophages). Toutefois, l’expression de ces marqueurs n’est pas strictement limitée aux cellules du même type dans les lésions athérosclérotiques en raison de la plasticité de multiples lignées y compris SMC, les cellules endothéliales et les cellules myéloïdes12. En particulier, l’identification sans ambiguïté du SMC au sein de la lésion athéroscléreuse était pratiquement impossible jusqu'à la dernière décennie en raison de la propriété de ces cellules de dédifférenciation et réprimer leurs gènes marqueur lignée spécifique (un processus appelé commutation phénotypique) dans les vaisseaux malades ou blessés,13. Cette limitation dans l’identification de la SMC a été contournée par le développement de la lignée traçage7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. il se compose de l’étiquetage en permanence SMC et leur progéniture pour suivre leur destin et leur évolution phénotypique au cours de la progression de l’athérosclérose en utilisant une combinaison de l’expression de la recombinase Cre grâce aux promoteurs de SMC spécifiques (p. ex., Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 et, SM22α14,16) et l’activation des reporters (protéines fluorescentes, β-galactosidase) [revu Bentzon et Majesky 201827]. Dans l’une des premières études employant traçage lignée SMC à l’extérieur de réglage de l’embryogenèse, Speer et coll.14 fourni la preuve que SMC peut moduler leur phénotype et se transdifférencier en cellules chondrogéniques au cours de la calcification vasculaire à l’aide de un modèle de suivi SM22α Cre R26R LacZ lignée. Bien que ces études pionnier de traçage de lignée SMC, ils sont partiellement équivoques que toute donnée non-SMC SM22α exprimant dans le cadre de la maladie serait étiqueté par le journaliste. Cette limitation a été contournée par le développement et l’utilisation de la Cre inductibles par tamoxifène ERT/LoxP permettant un contrôle temporel de l’étiquetage de la cellule. Marquage de cellules se produit uniquement lors de l’accouchement de tamoxifène et se limitera à la cellule exprimant le promoteur spécifique au type cellule conduite expression Cre ERT au moment de l’exposition de tamoxifène, évitant le traçage des types de cellules alternative activation Cre dans la définition de progression de la maladie. Pour le traçage de la lignée des SMC dans l’athérosclérose, le transgène de - Cre/ERT2 Myh11inductibles par tamoxifène associé à fluorescents reporters (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, confettis20,22,23 pour les études de l’expansion clonale) a démontré une efficacité remarquable et une spécificité dans l’étiquetage des SMC et a servi à devenir carte SMC populations dans les lésions athéroscléreuses dans des études récentes. Ce qui est important, ces études ont révélé que : 1) 80 % du SMC avancé dans les lésions athéroscléreuses pas exprès des marqueurs classiques de SMC (ACTA2, MYH11) utilisées dans l’analyse d’immunohistological et donc serait ont été confondues avec sans suivi de lignée 17; 2) sous-ensembles de SMC expriment des marqueurs de types de cellules remplaçant incluant des marqueurs de macrophages ou cellules souches mésenchymateuses marqueurs16,17,19; et 3) SMC investir et remplir la lésion athéroscléreuse en expansion oligoclonales et SMC clones conservent la plasticité à la transition à phénotypiquement différentes populations20,23. Pour résumer, il est clair désormais que les cellules musculaires lisses présentent une remarquable diversité phénotypique des lésions athéroscléreuses et peuvent avoir des rôles bénéfiques ou néfastes sur la pathogénie des lésions selon la nature de leurs transitions phénotypiques. Ces découvertes représentent une remarquable nouvelle voie thérapeutique pour le ciblage SMC athero-promotion phénotypiques transitions dans l’athérosclérose tardifs.
Dans les présentes, nous vous proposons un protocole standardisé pour l’analyse des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. Pour déterminer l’effet d’inhibition de l’Interleukin-1β sur le devenir de la SMC et phénotype, nous avons utilisé lignée SMC traçage ApoE- / - souris soumises à un régime occidental pendant 18 semaines avant de recevoir des injections hebdomadaires d’un anticorps anti-IL1β ou d’isotype IgG témoins.

<table><tbody><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Perfusion et fixation tissulaires</td></tr><tr><td>Aiguille papillon 23G</td><td>Fisher</td><td>BD367342</td><td></td></tr><tr><td>aiguille 25G</td><td>Fisher</td><td>14-821-13D&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal A1</td><td>Microscope confocal</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>ACTA2-FITC Anticorps (souris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Alexa-647 anti chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Solution de démasquage de l’antigène, à base d’acide citrique</td><td>Vector Labs</td><td>H-3300</td><td>Solution de récupération d’antigène</td></tr><tr><td>Chow Diet</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.7012</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-544-14</td><td>N’importe quel verre de couverture 50 x 24 mm</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Nucleus fluorescent contre-coloration</td></tr><tr><td>Donkey Alexa-488 anti-lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Donkey Alexa-555 anti-rat</td><td>Abcam</td><td>ab150154</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>DPBS 10X sans Calcium et Magnésium</td><td>Gibco</td><td>14200166</td><td>PBS pour les dilutions et les lavages en solution. Diluer à 1x dans de l’eau désionisée</td></tr><tr><td>Cassette d’encastrement</td><td>Fisher</td><td>15-182-701D</td><td></td></tr><tr><td>Tube à vide ETDA</td><td>Fisher</td><td>02-685-2B</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Tampon en mousse</td><td>Fisher</td><td>22-222-012</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de poisson d’eau froide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFP (chèvre)</td><td>abcam</td><td>ab6673</td><td>Anticorps primaires</td></tr><tr><td>de chèvre Contrôle des IgG</td><td>Vector Labs</td><td>I-5000</td><td>Contrôle des IgG</td></tr><tr><td>Régime riche en graisses</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Programme informatique https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anticorps LGALS3 (rat)</td><td>Cedarlane</td><td>CL8942AP</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Microscope confocal LSM700</td><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope, Superfrost Plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microtome</td><td>Fisher</td><td>30-538-35</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des IgG de la souris</td><td>Vector Labs</td><td>I-2000</td> Contrôle des <td>IgG</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie NIS element</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie Nikon pour l’acquisition d’images z-stack</td>Sérum de cheval normal Sigma Aldrich H1270 Pap Pen Fisher 50-550-221 Huile d’arachide Sigma P2144 Prolong gold Montage anti-effacement Invitrogen P36930 Support de montage&nbsp ;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des IgG chez le lapin</td><td>Vector Labs</td><td>I-1000</td><td>Contrôle</td></tr> des <tr><td>IgG chez le rat Contrôle des IgG</td><td>Vector Labs</td><td>I-4000</td><td>Contrôle des IgG</td></tr><tr><td>RUNX2 anticorps (lapin)</td><td>Abcam</td><td>ab192256</td><td>Seringue d’anticorps primaire</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>seringue de 1 ml</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>X55K-4</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie Zen</td> Logiciel <td>Zeiss</td><td>Imaging pour l’acquisition d’images</td><td></td> z-stack</tr></tbody></table>

analyse quantitative de la composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de muscle lisse cell lineage-tracing souris

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

L’athérosclérose demeure la principale cause de décès dans le monde et, malgré d’innombrables études précliniques décrivant des cibles thérapeutiques prometteuses, nouvelles interventions reste insaisissables. Cela s’explique probablement en partie, à un recours aux modèles précliniques de prévention portant sur les effets des manipulations génétiques ou des traitements pharmacologiques sur le développement de l’athérosclérose, plutôt que la maladie établie. Aussi, les résultats de ces études sont souvent confusion en raison de l’utilisation des analyses de lésion superficielle et l’absence de caractérisation de populations cellulaires de lésion. Pour aider à surmonter ces obstacles translationnelles, nous proposons un recours accru aux modèles d’intervention qui emploient l’enquête des changements dans la composition cellulaire au niveau unicellulaire par immunofluorescence et microscopie confocale. À cette fin, les auteurs décrivent un protocole pour tester un agent thérapeutique putatif dans un modèle murin d’intervention y compris une approche systématique pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. En outre, en raison de la diversité phénotypique des cellules à l’intérieur des stades de lésions athéroscléreuses, nous décrivons l’importance d’utiliser des systèmes de souris pour le traçage lignée cellulaire spécifique, inductible et comment cela peut être exploité pour la caractérisation objective des populations de cellules de lésion athéroscléreuse. Ensemble, ces stratégies peuvent aider les biologistes vasculaires plus précisément modéliser les interventions thérapeutiques et analyser la maladie athéroscléreuse et seront traduira si tout va bien un taux plus élevé de réussite dans les études cliniques.

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - souris ont été injectés par le tamoxifène entre six et huit semaines avant d’être nourris avec un régime riche en graisses. À 18 semaines de régime riche en graisses alimentation, deux groupes de huit souris ont été traitées par semaine avec un anticorps anti-IL-1β monoclonal de souris ou un témoins du même isotype IgG à 10 mg/kg pendant 8 semaines (Figure 1)7. Souris ont été sacr...

Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Notre protocole aide les chercheurs à mettre en œuvre des pipelines expérimentaux normalisés pour effectuer la caractérisation phénotypique de populations similaires par coloration immunofluorescente. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent analyser rigoureusement la composition similaire des tissus complexes de la maladie et effectuer des analyses qualitatives et quantitatives des phénotypes des types de cellules d’intérêt. Sidney Mahan, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour préparer l’animal à la récolte de l’artère brachiocéphale, couper le péritoine jusqu’au sternum, en prenant soin de ne pas endommager les tissus abdominaux. Et faire deux coupures à la ligne axillaire moyenne à travers le thorax, en prenant soin de ne pas endommager le cœur et les poumons. Ensuite, coupez le diaphragme pour exposer partiellement le cœur.Pour profuser la souris, installez un système de profusion de gravité de telle sorte que la pression du fluide de profusion soit équivalente à la tension artérielle murine moyenne pour permettre une profusion et un entretien cohérents de la morphologie du vaisseau. Puis, profuse l’animal avec cinq millilitres de température ambiante PBS, 10 millilitres de 4%température ambiante paraformaldéhyde, et cinq millilitres supplémentaires de température ambiante PBS. Connectez une aiguille papillon de calibre 23 ou 25 au système de profusion de gravité et courez PBS à travers l’aiguille pour expulser l’air des tubes avant d’insérer l’aiguille dans le ventricule gauche.Après avoir obtenu l’aiguille en place, utilisez des ciseaux d’iris pour faire une incision de moins de deux centimètres dans l’atrium droit. Récoltez les tissus d’intérêt dans le paraformaldéhyde frais de 4%. Pour exposer l’artère brachiocéphale, utilisez des ciseaux pour faire une incision dans la ligne médiane du sternum à travers le manubrium et utilisez des forceps pour tirer les deux côtés de la cage thoracique pour ouvrir complètement la cavité thoracique.Ensuite, placez l’animal sous un microscope disséquant pour visualiser partiellement les carotides, et utilisez des pinces fines pour tirer les muscles, le tissu conjonctif et la graisse jusqu’à ce que la carotide droite, l’artère brachiocéphale, la bifurcation subclavienne et l’arc aortique soient nettoyés et isolés du tissu conjonctif et de la graisse environnants. Ensuite, utilisez des forceps pour saisir la carotide droite au-dessous de sa bifurcation et faire une première coupe au-dessus des forceps. Pourtant, tenant la carotide, faire une deuxième coupe à travers l’artère subclavienne et faire les deux dernières coupes à travers l’arc aortique de chaque côté de l’artère brachiocéphale.Ensuite, recueillir tous les autres tissus vasculaires d’intérêt et de placer l’artère brachiocéphale et les autres tissus dans 4% solution de paraformaldéhyde pendant la nuit à température ambiante. Pour la coloration immunofluorescente de l’artère brachiocéphale, utilisez un microtome pour obtenir 10 sections de micromètres à travers l’échantillon de tissu incorporé paraffine jusqu’à ce qu’il puisse être confirmé par la microscopie légère que l’arc aortique a été sectionné à travers et l’artère brachiocéphale est visible. Ajustez l’orientation du bloc jusqu’à ce que le tissu soit complètement perpendiculaire à la lame de microtome et obtenez trois sections périodiques de 10 micromètres d’épaisseur de l’artère brachiocéphale par glissière de verre, jusqu’à ce que la bifurcation subclavienne soit atteinte.Lorsque toutes les sections ont été recueillies, hydratez les échantillons de tissus sous une hotte chimique avec deux immersions de xylène de cinq minutes, suivies d’une série d’immersion de cinq minutes à l’éthanol comme indiqué, et de deux immersions d’eau déionisées de cinq minutes. Ensuite, incuber des diapositives dans la solution de récupération des antigènes, selon les protocoles standard, suivies par le chauffage au micro-ondes pendant 20 minutes. Après une heure de refroidissement à température ambiante, utilisez un stylo hydrophobe pour encercler chaque section tissulaire.Et bloquez toute liaison non spécifique avec tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, étiquetez les échantillons de tissus pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec le cocktail principal d’anticorps d’intérêt, ou isotype assorti aux anticorps de contrôle IgG. Le lendemain matin, le lavage glisse trois fois en PBS pendant cinq minutes par lavage, suivi d’une incubation d’une heure dans le cocktail d’anticorps secondaire conjugué fluorescence approprié et DAPI pour la visualisation du noyau.Ensuite, utilisez un support de montage adapté à la microscopie de fluorescence pour monter des coverslips sur les toboggans. Pour l’imagerie par microscopie confocale des sections de tissus étiquetés, utilisez des sections tachées du contrôle IgG et des anticorps primaires pour définir la sensibilité du détecteur, sa puissance laser et sa compensation pour chaque canal individuel. Ensuite, définissez les positions supérieures et inférieures pour l’acquisition de z-stack et déterminez l’épaisseur et le nombre de piles à imager.Lorsque toutes les images ont été acquises, ouvrez les images d’ImageJ et ouvrez le panneau d’outils de canal et pseudo colorez les différents canaux de coloration. Fusionner les canaux de couleur. Tous les canaux doivent être visibles sur la même image.Activez et éteignez les canaux de couleur individuels dans le panneau d’outils du canal, et cliquez à droite sur l’icône de comptage pour sélectionner l’outil multi-points. Double clic sur l’icône de comptage pour ouvrir le panneau d’outils point et sélectionner le type et la taille des éléments utilisés pour compter les cellules. Vérifiez tout afficher et activez le canal DAPI uniquement dans le panneau d’outils du canal.Ensuite, sélectionnez le canal compteur zéro et cliquez sur les noyaux individuels à tagués, en faisant défiler les z-stacks pour compter tous les noyaux tachés dans la région d’intérêt. Le nombre d’événements quantifiés à cellule unique sera indiqué ci-dessous dans le panneau d’outils à points. Lorsque tous les noyaux ont été marqués, allumez un autre canal de coloration et sélectionnez le canal de compteur un pour marquer les cellules dans lesquelles il y a une colocalisation entre le DAPI et la coloration des anticorps.Pour la coloration cytoplasmique, sélectionnez les cellules avec coloration entourant le noyau dans toute la profondeur du noyau, en vérifiant plusieurs z-stacks si nécessaire. Les résultats peuvent ensuite être exprimés comme le nombre de cellules au nombre total de cellules positives DAPI, ou le nombre de cellules par zone dans la région d’intérêt. La coloration immunofluorescente avec des anticorps ciblant les marqueurs phénotypiques, comme démontré, permet d’acquérir des images de chaque marqueur individuel de coloration et de contraste différentiel d’interférence pour la délimitation des régions d’intérêt pour le comptage d’une seule cellule.Le comptage d’une seule cellule pour déterminer l’abondance de différentes populations lisses dérivées de cellules musculaires peut ensuite être effectué à l’aide d’ImageJ. Par exemple, l’analyse de comptage de cellules simples dans la région fibreuse de chapeau de ces sections transversales représentatives a indiqué des différences remarquables dans la composition cellulaire de la zone fibreuse de chapeau entre les souris traitées avec l’anticorps bêta d’IL-1 et les souris traitées avec un contrôle IgG assorti d’isotype. En effet, l’inhibition de la bêta il-1 a été associée à une diminution des cellules musculaires lisses YFP-positives, et à une augmentation des cellules galectin-3-positives.En outre, une diminution du nombre de YFP-positif muscle lisse alpha actin-positif cellules musculaires lisses a été observée. Tandis que le nombre relatif de macrophages yfp-positifs de galectin-3-positifs lisses de cellules de muscle a été sensiblement augmenté aux deux emplacements brachiocephalic d’artère. Notamment, l’inhibition de la bêta IL-1 n’a pas eu d’impact sur le nombre global de cellules ostéochondrogènes dans la lésion, ni sur la proportion de cellules chondrogenic lisses dérivées des cellules musculaires ou dérivées du macrophage.Ce protocole a été conçu pour améliorer la rigueur et la reproductibilité dans l’analyse des lésions athéroclérotiques en standardisant les étapes clés telles que la collecte, le traitement et la sectionnement des tissus, ainsi que le comptage des cellules simples. Ce protocole peut être employé pour analyser les lits vasculaires additionnels enclins à présenter des lésions athérosclérostiques comprenant l’aorte et la racine aortique.

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Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

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