Name: Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion dischémie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Découvrez un modèle murin reproductible pour étudier les métastases hépatiques du cancer colorectal et les effets de l'ischémie-reperfusion sur la croissance tumorale. Cette méthode aide à comprendre l'impact chirurgical sur la progression cancéreuse.

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Les auteurs remercient Sara Minemyer et Alexander Comerci pour la révision linguistique.

Tous les protocoles sur les animaux sont approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux et sont respectés aux Lignes directrices des National Institutes of Health (NIH). Les instruments utilisés pour n'importe quelle intervention chirurgicale ont été complètement stérilisés.
1. Préparation initiale
<ol><li>Avant d'injecter des cellules cancéreuses dans la rate de la souris, autoclave et stériliser tous les instruments à utiliser pendant la procédure.</li>
	<li>Stériliser et/ou autoclaver un coussin chauffant, des gants chirurgicaux, de la gaze, des paires de ciseaux, de petites pinces, un dilatateur de vaisseau, des forceps chirurgicaux et un porte-aiguille.</li>
	<li>Préparer l'analgésique postopératoire (0,1 mg/kg de buprénorphine) à administrer après la splenectomy et tous les 12 h pendant 2 jours.</li>
</ol>2. Culture cellulaire
<ol><li>Assurez-vous que les cellules cancéreuses sont exemptes de contamination par le mycoplasme à l'aide d'un kit Mycoplasma ELISA.</li>
	<li>Préparer une solution de 500 ml du milieu de culture de l'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 4 oC pour la culture des cellules cancéreuses colorectales murines (MC38). Les supports de culture doivent être complétés par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF), 100 U/mL de pénicilline, 100 g/mL de streptomycine, 15 mM de HEPES et 200 mM de L-glutamine.</li>
	<li>Cellules cancéreuses de culture dans un flacon sans ARN et RNAse (75 cm2). Incuber la culture cellulaire dans un incubateur humidifié cellulaire/tissu contenant 5 % de CO2. Maintenir la température à 37 oC.</li>
	<li>Une fois que les cellules proliférantes atteignent 90 à 100% de confluence, aspirez les vieux médias, lavez les cellules avec 1x saline tamponnée par phosphate (PBS) et les traitez avec 1x trypsine (0,25%) pour détacher les cellules du flacon.</li>
	<li>Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifugeuse pendant 5 min à 700 x g.</li>
	<li>Aspirer les médias et laver avec 1x PBS deux fois par centrifugation répétée.</li>
	<li>Procédez pour confirmer la viabilité cellulaire en taclant les cellules avec la tache bleue de trypan (0.4%).</li>
	<li>Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/ 100 l en 1x PBS. Les cellules pipet s'engouffrent complètement pour éviter les amas. Gardez les cellules cancéreuses sur la glace avant l'injection.</li>
</ol>3. Injection de cellules tumorales
<ol><li>Anesthésiez les souris mâles de 8 à 12 semaines (C57BL6) en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm).</li>
	<li>Raser la peau abdominale des souris à l'aide de tondeuses pour éviter toute infection postopératoire.</li>
	<li>Placez les souris sur le système de rétraction du fixateur magnétique. Confirmez que les souris sont complètement sous l'effet de l'anesthésie en pinçant un orteil ou la queue.</li>
	<li>Ajouter des gouttes saline dans les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure.</li>
	<li>Frotter la solution povidone-iode (7,5%) à la paroi abdominale rasée pour désinfecter la peau avant de faire une incision chirurgicale.</li>
	<li>Soulevez d'abord la peau avec les forceps dentés et faites une incision de midline avec l'aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, soulevez le muscle abdominal et le péritoine pour créer une incision médiane d'environ 3 cm de longueur (processus midabdominal à xiphoïde pour exposer le contenu abdominal. Prenez garde de ne pas étendre l'incision au-delà du processus de xiphoïde pour éviter les saignements importants.</li>
	<li>Placez l'hemostat des deux côtés de l'incision et sous le processus xiphoïde. Étendre l'abdomen en tirant la queue vers le bas et en l'encaignant. Utilisez l'applicateur de pointe de coton stérile de 6 pouces pour séparer et exposer la rate du tissu adipeux pancréatique.</li>
	<li>Avant l'injection dans la rate, vortex les cellules cancéreuses pour éviter les amas cellulaires.</li>
	<li>Utilisez une seringue à insuline de 0,5 ml 28 G (0,36 mm x 13 mm) pour l'injection. Évitez les bulles d'air.</li>
	<li>Insufflez lentement et soigneusement 100 l de cellules dans la pointe de la rate. Placez une pointe de coton et ajoutez une légère pression pour éviter le reflux dans la région abdominale. Une injection réussie peut être observée en identifiant le changement de couleur du foie pendant l'injection.</li>
	<li>Humidifiez une gaze stérile avec 1x PBS et placez-la sur le secteur disséqué.</li>
	<li>Transférer les souris sur un coussin chauffant pendant 15 minutes pour permettre aux cellules cancéreuses de circuler dans le système.</li>
	<li>Pour procéder à l'ischémie chirurgicale et aux dommages de réperfusion, suivez des étapes 5.3-5.10. REMARQUE : Cette procédure est d'étudier l'effet de l'établissement induit d'I/R des foyers métastatiques.</li>
</ol>4. Splenectomy
<ol><li>Pour effectuer une splencectomie, utilisez un dispositif de cautérisation portatif. Soulevez soigneusement la rate avec des forceps lisses et cautérisez les vaisseaux sanguins spléniques pour éviter les saignements excessifs. Retirez la rate en transectant les vaisseaux à la section cautérisée.</li>
	<li>Immédiatement après la procédure, fermer l'incision dans un modèle de double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez 4-0 sutures en polypropylène pour la paroi abdominale et la peau.</li>
	<li>Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles.</li>
	<li>Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.</li>
	<li>Injecter des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.</li>
</ol>5. Blessures de réperfusion d'ischémie
<ol><li>À 5 jours après la première laparotomie, anesthésiez les souris en administrant de la kétamine (150 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) par voie intrapéritone à l'aide d'une aiguille de 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm). Suivez les étapes 3.3-3.4.</li>
	<li>Frotter la solution povidone-iode (7,5%) sur l'abdomen rasé de la souris pour désinfecter la peau et effectuer une laparotomie de midline comme décrit ci-dessus dans l'étape 3.6.</li>
	<li>À l'aide de deux bouts de coton humidifiés, déplacez doucement l'intestin de la cavité pour exposer les structures associées, y compris la veine du portail. Disséquer le hilum du foie libre du tissu environnant.</li>
	<li>Soulevez les lobes médians et latéraux gauches contre le diaphragme. Séparez le lobe quadrate du lobe latéral gauche en disséquant le hilum du foie avec les ciseaux de ressort à l'aide d'un microscope opératoire pour permettre une visibilité claire vers la structure de la triade du portail.</li>
	<li>Placez un petit coton humide entre le lobe médian et le lobe latéral droit pour créer suffisamment d'espace pour le serrage. À l'aide des forceps du dilatateur du navire, passez soigneusement le fil de 10 cm (4,0 suture en polypropylène) pour soulever la triade du portail. Occlude toutes les structures dans la triade de portail (artère hépatique, veine de portail, et conduit biliaire) aux lobes gaucheets de foie en plaçant une pince microvasculaire utilisant un applicateur de pince micro-serrefine avec la serrure.</li>
	<li>Si les lobes ne montrent pas de blanchiment significatif, réajuster la pince en enlevant et en réappliquant. REMARQUE : Si le blanchiment immédiat du foie ne se produit pas même après avoir réajusté la pince, examinez attentivement s'il faut procéder ou non à l'I/R.</li>
	<li>Retirer le petit coton-tige placé entre les lobes médians et les lobes latéraux droits. Remplacer délicatement l'intestin dans la cavité abdominale. Couvrir la paroi abdominale d'une gaze humide (trempée de 1x PBS) et couvrir d'une pellicule plastique pour minimiser la perte d'évaporation.</li>
	<li>Placer la souris sur le coussin chauffant et appliquer la pince pendant une période de 60 min.</li>
	<li>Tout au long de l'intervalle ischémique, recherchez l'évidence des dommages d'ischémie en visualisant le blanching pâle des lobes médial et latéral médial et gauche s'est prolaissé.</li>
	<li>Initier la réperfusion en enlevant les pinces après la période de 60 min. REMARQUE : L'évidence de la reperfusion peut être observée par un changement immédiat de couleur des lobes latéraux médians et gauches.</li>
	<li>Immédiatement après la réperfusion, fermez l'incision avec un modèle de suture à double couche en sucisant d'abord la couche musculaire, puis la peau. Utilisez la suture 4-0 en polypropylène à l'aide d'un porte-aiguille pour fermer la paroi abdominale et la peau.</li>
	<li>Avant de répéter la procédure sur un autre animal, désinfectez tous les instruments en les pulvérisant avec 70% d'isopropanol ou en les insérant dans un bain de perles chauffés.</li>
	<li>Replacez les souris dans des cages d'origine et recherchez des signes de détresse et de douleur post-chirurgicale.</li>
	<li>Injecter des analgésiques postopératoires (0,1 mg/kg de buprénorphine) tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.</li>
	<li>Pour les souris de faux foie I/R, effectuer la laparotomie, dissection hilum et sutures abdominales. REMARQUE: Le rôle du stress chirurgical influençant l'établissement des métastases hépatiques peut être étudié à travers deux conceptions expérimentales différentes. Le protocole ci-dessus (Modèle-1) est utilisé pour établir une maladie hépatique micrométastatique et étudier l'effet du foie I/R sur leur croissance (Figure 1A). Alternativement, l'injection de foie I/R et de tumeur peut être exécutée simultanément (modèle-2) pour étudier l'effet des dommages d'I/R dans l'établissement de nouveaux foyers métastatiques (figure 1B). Pour ce faire, injecter des cellules cancéreuses dans la rate comme décrit ci-dessus et leur permettre de circuler pendant 15 min. Effectuer le foie I / R ou une chirurgie simulée après la période de circulation pendant 60 min. Effectuer splenectomy latérale 60 min plus tard, puis fermer l'incision laparotomy.</li>
</ol>6. Évaluation des souris opérées
<ol><li>Pendant la procédure chirurgicale s'assurer que les souris sont sous l'influence de l'anesthésie de stade III en effectuant l'essai palpebral et cornéen de réflexe. Une dose anesthésique supplémentaire doit être administrée sur les signes de réflexes.</li>
	<li>Fournir des analgésiques postopératoires (Buprenorphine 0,1 mg/kg) juste après la chirurgie et tous les 12 h pendant 2 jours pour éviter les douleurs post-chirurgicales.</li>
	<li>Laissez les souris de 30 à 60 min de temps de récupération après l'anesthésie. Surveillez constamment les souris et ne les laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu'elles soient complètement guéries.</li>
	<li>Recherchez les signes de détresse tels que le dos voûté, les yeux fermés, le mouvement lent et l'incapacité à se toiletter. Traiter en conséquence jusqu'à ce que les souris retournent à leur activité normale.</li>
	<li>Les soins supplimental comprenant des fluides, la chaleur, l'agent d'inversion de Yohimbine pour la xylazine, la literie douce de serviette de papier (pour éviter l'aspiration) devraient être fournis après la chirurgie pour améliorer la période de rétablissement.</li>
</ol>7. Évaluation des lésions de réperfusion d'ischémie hépatique
<ol><li>Immédiatement après l'application de la pince, assurez-vous que le blanchissement pâle des lobes latéraux médians et gauches se produit par rapport aux lobes de caudate et de quadrate.</li>
	<li>Évaluer les lésions ischémiques hépatiques en mesurant les niveaux de transaminase d'alanine (sALT) de sérum, d'aspartate de sérum (sAST) et de lactate de lactate de séride (sLDH). Le sang peut être prélevé dans la veine faciale pour extraire le sérum de 3 à 6 h après l'initiation de la réperfusion. Effectuer l'histologie du foie pour analyser la zone de la tumeur pour cent dans le lobe ischémique.</li>
</ol>

<ol><li>Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).</li>
<li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+gastroenterological+surgery%22%5BJournal%5D)">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li>
<li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+treatment+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li>
<li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+present+concepts+and+potential+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+surgery+on+tumor+growth%3A+a+century+of+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).</li>
<li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li>
<li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model%3A+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).</li>
<li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis%3A+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Communications%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs ne révèlent aucun conflit d'intérêts qui se rapporte à ce travail.

Le modèle animal décrit dans ce manuscrit est basé sur deux approches principales. La première est de reconnaître la capacité des cellules cancéreuses à localiser et à proliférer dans les lobes du foie. La deuxième est d'étudier l'effet des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie influençant la croissance et les métastases de tumeur. Ce modèle permet l'étude pertinente des métastases hépatiques en l'absence de métastases secondaires chez une souris immunocompétente. Le modèle est utile pour aborder les questions de...

Le foie est l'un des sites les plus communs pour le développement de la maladie métastatique1. La mortalité est presque invariablement attribuable aux complications liées à la croissance tumorale dans le foie. Dans les patients présentant les tumeurs pleines métastatiques dans le foie, la chirurgie demeure une intervention cruciale pour le contrôle de la maladie et une approche curative possible. Cependant, la grande majorité des patients se présentent finalement avec la maladie récurrente, principalement dans le foie2,3. Pendant la chirurgie hépatique, le saignement peropératoire est commun, nécessitant souvent la transfusion sanguine et différentes approches techniques pour commander le saignement, y compris les méthodes vasculaires de serrage. Cependant, de telles mesures causent l'ischémie/reperfusion hépatique (I/R) au tissu de foie. Les effets défavorables de I/R sur la fonction hépatocellulaire ont été bien documentés. L'insulte de foie I/R enflamme des cascades inflammatoires pendant la restauration du flux sanguin par des voies inflammatoires4. Non seulement les dommages de foie I/R contribuent à l'échec de foie, mais les preuves actuelles montrent également que les dommages d'I/Rstimulent l'adhérence de cellules de tumeur, et favorise l'incidence de la formation de métastases et la croissance de la maladie micrométastatique existante 5. Nous avons précédemment rapporté que le stress chirurgical induit l'activation des cellules immunitaires qui aide non seulement à lacroissance de la tumeur primaire, mais facilite également les métastases en capturant des cellules cancéreuses dans la circulation 6.
Ici nous décrivons en détail une technique pour établir un modèle de tumeur de souris de métastasie de foie. Dans ce modèle, nous présentons également une méthode pour induire des dommages hépatiques de reperfusion d'ischémie qui agit en tant que substitut au stress chirurgical présent médicalement pendant des hepatectomies. Les méthodes combinées de l'injection de cancer et de l'I/R hépatique peuvent interpréter avec succès le développement de CRLM dans les patients qui ont subi la résection primaire de tumeur.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Lonza</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Fisher scientifique</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Stretomysin</td><td>Fisher scientifique</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>SH3023701</tr><tr><td>Trypsin</td><td>Hyclone</td><td>sh30042.02</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire 75cm</td><td>5 cellules Star</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>15ml PP Tubes Coniques</td><td>BioExcell</td><td>41021037</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Giibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisherbrand</td><td>1376152</td><td></td></tr><tr><td>Cautry</td><td>Bovie</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Pince microvasculaire</td><td>Outils Finescience</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Serrefin pince applicatrice avec serrure</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18056-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Dilatateur de récipient</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-00276-13</td><td></td></tr><tr><td>Fixateur magnétique Système de rétraction</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18200020</td><td></td></tr><tr><td>Pince Micro-Adson</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11019-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince Micro-Adson</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11018-12</td><td></td></tr><tr><td>4-0 suture en polypropylène</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8826</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1443915</tr><tr><td>Clipper</td><td>Oster</td><td>559A</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine solution</td><td>Medline</td><td>MDS093945</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1ml 25G</td><td>BD safety Glide</td><td>305903</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline 0,5 ml</td><td>BD Seringues à insuline</td><td>32946</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical Microscope</td><td>Leica</td><td>LR92240</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma Elisa Kit</td><td>Roche</td><td>11663925910</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Putney</td><td>#056344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>NADA</td><td>#139-236</td><td></td></tr><tr><td>Bande ALT</td><td>Heska</td><td>15809554</td><td></td></tr><tr><td>Bande AST</td><td>Heska</td><td>15809542</td><td></td></tr><tr><td>Bande LDH</td><td>Heska</td><td>15809607</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

L'ischémie hépatique et la lésion de reperfusion (I/R), un défi clinique commun, demeure un processus pathophysiologique inévitable qui a été montré pour induire des dommages multiples de tissu et d'organe. En dépit des avances récentes et des approches thérapeutiques, la morbidité globale est restée insatisfaisante particulièrement dans les patients présentant des anomalies parenchymales sous-jacentes. Dans le contexte de la croissance agressive de cancer et de la métastasie, l'I/R chirurgical est suspecté pour être le promoteur régulant la répétition de tumeur. Cet article vise à décrire un modèle murine médicalement pertinent de foie I/R et métastasie colorectale de foie. Ce faisant, nous visons à aider d'autres chercheurs à établir et à perfectionner ce modèle pour leur pratique de recherche de routine afin de mieux comprendre les effets du foie I/R sur la promotion des métastases hépatiques.

Toutes les souris de type sauvage (C57BL6) (n - 20) ont été soumises au modèle de métastases hépatiques en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Toutes les souris injectées avec ou sans lésion de réperfusion d'ischémie ont survécu jusqu'à la date du sacrifice. Le diagramme schématique Figure 1A d'un foie cancéreux illustre le serrage de la triade du portail (artère hépatique, veine de portail, et canal biliaire) qui induit un ischémique partiel de foie (70%) insulter les lobes latéraux mé...

Nous décrivons en détail un modèle de tumeur de métastases de foie de cancer côlorectal médicalement pertinent (CRLM) et l'influence de la reperfusion d'ischémie de foie (I/R) dans la croissance de tumeur et la métastase. Ce modèle peut aider à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la promotion induite par la chirurgie de la croissance métastatique du foie.

Modèle de Murine des tumeurs métastatiques de foie dans le cadre des dommages de reperfusion d'ischémie

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Les preuves expérimentales et cliniques montrent que la reperfusion d’ischémie de foie peut augmenter la formation des foyers métastatiques en faisant circuler des cellules cancéreuses et la croissance de la maladie micrométastatique. Ce modèle murin reproductible permet l’étude pertinente de l’établissement des métastases et de la croissance de la tumeur préexistant dans le foie. La chirurgie hépatique, le saignement, et le choc septique sont tous associés à la reperfusion d’ischémie de foie et peuvent affecter la croissance de la maladie métastatique.Ces techniques permettent l’étude de ce phénomène dans un effort pour mieux diagnostiquer et prévenir l’effet préjudiciable de la reperfusion d’ischémie sur la croissance de tumeur dans un arrangement clinique. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez un mâle anesthésié de huit à 12 semaines C57 noir 6 souris, désinfecter la peau de la paroi abdominale exposée avec un gommage povidone-iode et utiliser des forceps dentaires pour soulever la peau. À l’aide d’un scalpel chirurgical, faire une incision à mi-ligne dans la peau et soulever le muscle abdominal et le péritoine pour faciliter la création d’une incision de trois centimètres à mi-ligne pour exposer le contenu abdominal.Après avoir placé un hémostat des deux côtés de l’incision et sous le processus xiphoïde, tirez et collez la queue vers le bas pour étendre l’abdomen et utilisez un applicateur stérile de pointe de coton de six pouces pour séparer et exposer la rate du tissu adipeux pancréatique. Ensuite, vortex de la suspension des cellules cancéreuses d’intérêt pour dissocier les touffes de cellules et de charger les cellules dans une seringue d’insuline de 0,5 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 28. Injectez lentement et soigneusement 100 microlitres de cellules dans le bout de la rate, en plaçant une pointe de coton adjacente au côté de la ponction d’aiguille pour absorber tout déversement possible de tumeur dans la cavité péritonéale tout en ajoutant une pression douce pour stabiliser la rate pendant l’injection.Une injection réussie sera évidente par un changement dans la couleur du foie. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, placez un morceau de gaze stérile imbibé de PBS sur la zone disséquée et placez la souris sur un coussin chauffant pendant 15 minutes pour permettre aux cellules cancéreuses de circuler dans le système. Pour induire une ischémie et des blessures de reperfusion, utilisez deux pointes de coton humidifié pour déplacer doucement l’intestin de la cavité pour exposer la veine portail et placer la souris sous un microscope disséquant.Soulevez le terre-plein central et les lobes latéraux gauches de foie vers le haut contre le diaphragme. Placez un petit coton-tige humide entre le lobe médian et le lobe latéral droit pour créer suffisamment d’espace pour serrer et passer soigneusement un forceps de dilatateur de navire derrière la triade du portail et, à l’aide des forceps du dilatateur du navire, utilisez un morceau de 10 centimètres de suture de polypropylène de 4 à 0 pour passer derrière et soulever la triade portail. Utilisez un applicateur à pinces micro-serrifine avec une serrure pour placer une pince microvasculaire sur les lobes hépatiques gauches et médians pour occluser toutes les structures de la triade portail.Lorsque le blanchiment est observé, enlever la suture de polypropylène 4-0 et le petit coton-tige et retourner soigneusement l’intestin dans la cavité abdominale. Couvrez la paroi abdominale d’un nouveau morceau de gaze imbibée de PBS et recouvrez la gaze d’une pellicule plastique pour minimiser la perte d’évaporation. Ensuite, placez la souris sur le coussin chauffant pendant 60 minutes.Tout au long de l’intervalle ischémique, visualisez le blanchissage pâle des lobes médials, médiaux gauches et latériels droit pour confirmer l’évidence de la blessure d’ischémie. À la fin de la période de blessure, retirez la pince. Pour effectuer une splenectomy, soulevez soigneusement la rate avec des forceps lisses et utilisez un dispositif portatif de cautérisation pour cautériser les vaisseaux sanguins spléniques pour éviter le saignement excessif.Transect les vaisseaux à la section cautérisée pour enlever la rate et immédiatement utiliser 4-0 sutures de polypropylène pour fermer les incisions musculaires et cutanées dans un modèle de suture à double couche. Ensuite, placez la souris dans sa cage d’accueil avec surveillance jusqu’à ce que la récupération complète. Le stress chirurgical augmente considérablement la quantité de micrométastases préétamentées dans le foie.Cette différence est observée même deux semaines après la reperfusion d’ischémie comparée aux souris reperfusées de non-ischémie. La reperfusion d’ischémie hépatique et l’injection de cellules tumorales peuvent être affectées par la température ambiante et la viabilité cellulaire, alors prenez soin de contrôler ces variables. Cette technique facilite l’étude des effets du stress chirurgical et des lésions hépatiques sur la croissance de la maladie métastatique.Ceci aidera des chercheurs à mieux comprendre le phénomène de croissance chirurgicale-induite de tumeur.

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