Construit en FLS: une méthode simple pour la modification des cellules / Virion surfaces avec une gamme de marqueurs biologiques sans affecter leur viabilité

L’objectif global de cette procédure est de marquer rapidement et sans danger les surfaces des cellules vivantes ou S avec des constructions bioactives. Pour ce faire, il faut d’abord préparer une solution d’espaceur de fonction, de lipide ou de construction FSL. Ensuite, une partie égale de la solution de construction est mélangée à une partie égale de la solution de cellules ou de VIR.

Dans un troisième temps, le mélange est incubé pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. La dernière étape consiste à laver les cellules ou les cytes modifiés ou les VIR modifiés et à les utiliser expérimentalement comme d’habitude. En fin de compte, les cellules vivantes modifiées en surface ou S peuvent être visualisées à l’aide de toutes les techniques d’analyse expérimentale de routine, y compris la cytométrie en flux, la microscopie et l’agglutination.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le marquage covalent, est qu’elle est rapide, robuste, flexible et n’affecte pas la vitalité de la cellule modifiée ou du varien. Pour préparer d’abord la solution mère de construction FSL, ajoutez un millilitre de diluant au dossier du produit pour reconstituer le produit FSL sec, en créant une solution mère d’un milligramme par millilitre. Sonicez le flacon pendant 30 secondes, aliquotez le stock dans des récipients stériles de 100 microlitres et conservez les récipients à une température de deux à huit degrés Celsius pendant une semaine maximum.

Pour préparer des solutions de construction FSL fonctionnelles à insérer juste avant l’utilisation, soniquez à nouveau la solution pendant 30 secondes pour homogénéiser toutes les cellules mis, puis diluez la construction FSL et tamponnez à la concentration requise. Conservez la solution de travail à une température de deux à huit degrés Celsius jusqu’à une semaine après la suspension de Resus dans un milieu sans lipides ou une centrifugeuse PBS, les cellules pour la modification du FSL étant exemptes de lipides non liés. Ensuite, emballez les cellules dans 100 microlitres de diluant, lavez les cellules pour les contrôles dans les mêmes conditions à 100 microlitres de cellules non modifiées.

Ajouter 100 microlitres d’une dilution appropriée de la solution FSL si désiré. En parallèle, créez également des contrôles négatifs avec des solutions FSL et/ou PBS non liées. Ensuite, incubez tous les sous-ensembles cellulaires pendant une heure à 37 degrés Celsius après l’incubation.

Lavez toutes les cellules deux fois avec un milieu sans lipides ou PBS pour éliminer toutes les constructions libres de FSL et préparez une suspension appropriée dans un milieu sans lipides. Une fois le processus de modification du FSL terminé, les coys peuvent être stockés à quatre à huit degrés Celsius comme une fleur. Les constructions FSL se composent de trois composants principaux, la tête fonctionnelle ou F, qui peuvent être une variété de groupes biologiquement fonctionnels.

L’espaceur RS conçu pour induire un espacement de la tête fonctionnelle loin de la membrane afin d’améliorer la dispersion de l’eau et d’être non réactif avec le sérum humain et le lipide DAL ou L, ce qui permet à la construction de s’incorporer spontanément dans les surfaces quatre. Des groupes représentatifs de FLS sont montrés dans les cinq images suivantes. Des embryons murins vivants ont été directement marqués avec de la fluorescéine FSL par la méthode de deux heures à 37 degrés Celsius dans des milieux de culture de cellules libres de sérum lavés, puis examinés au microscope à fluorescence.

Sur cette première image, on peut voir un embryon miroir à deux cellules libre de zop palita. La coloration intense au milieu de l’embryon est représentative d’une coloration classique du corps polaire. Dans les deux images suivantes, des embryons à quatre cellules libres de zop palita et des embryons à huit cellules miroir qui présentent une coloration ombragée des cellules qui sont en dehors du foyer du microscope P sont montrés ici.

Une image d’un embryon miroir de 16 cellules libre de zop palita est montrée dans cette dernière image d’embryons miroirs vivants marqués à la fluorescéine FSL âgés de quatre à cinq jours d’embryons avec à la fois l’embryon et le zop LUCITA marqués sont montrés dans cette prochaine série d’images. Le marquage à la fluorescéine FSL du poisson zèbre est montré. Cette première image est celle d’une micro-angiographie d’une larve de poisson-zèbre de 52 heures après la fécondation à laquelle on a injecté directement de la fluorescéine FSL dans la circulation.

La coloration du système vasculaire du poisson-zèbre peut être observée ici. La fluorescéine FSL, les cellules hétérogènes du tissu rénal du poisson-zèbre ou les cytes ZK ont été créés exvivo, puis micro-injectés dans la circulation d’un poisson zèbre récepteur 52 heures après la fécondation des observations in vivo des cytes ZK ont été effectuées deux heures après l’injection par imagerie du système vasculaire en fluorescence avec microscopie time-lapse montré est une seule image vidéo avec de grandes cellules se déplaçant lentement ou immobiles indiquées par des flèches orange et des cellules se déplaçant rapidement, qui semblaient flous en raison de leur mouvement indiqué par des flèches vertes. Dans cette image, le marquage à la fluorescéine FSL par absorption orale de la construction obtenue en immergeant des embryons de poisson-zèbre et des milieux contenant de la fluorescéine FSL pendant une période allant jusqu’à cinq jours est montré.

La microscopie à fond clair du poisson-zèbre traité à la fluorescéine FSL à gauche correspond à l’image fluorescente adjacente à droite. La fluorescence était préférentiellement localisée dans le tractus intestinal. Aucune coloration n’a été observée chez les embryons témoins non traités présentés ici.

Ici, le virus de la stomatite vésiculeuse ou VSV directement marqué avec 10 microgrammes par millilitre de fluorescéine FSL pendant deux heures à 37 degrés Celsius, suivi d’une fixation avec 4 % d’aldéhyde paraforme, puis l’analyse par balayage des faits n’a montré aucune purification du VSV vir. L’étiquetage post-FSL était requis. Cet histogramme montre des cellules testiculaires porcines infectées par des VIR humains A Puerto Rico 8, 19, 34 ou H, un, N, un, marqués à la fluorescéine FSL.

Les cellules non infectées non fluorescentes sont représentées par la ligne noire tandis que la fusion du couronne H one N one avec les cellules porcines, qui a entraîné la fluorescence, est indiquée par la ligne rouge. Dans cette prochaine série d’images, les cellules ont d’abord été marquées avec de la biotine FSL pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis lavées et réagies avec de l’avadon marqué au fluor quatre, puis lavées et montées à l’eau pour la microscopie à fluorescence. La première image montre une image confocale compilée d’un embryon murin assisté, et cette figure montre une tranche confocale centrale de l’embryon de l’image précédente.

Voici des humains mobiles vivants perm zoa. Le flou se produit à la suite de leur mouvement. Une image représentative plus distincte des spermatozoïdes humains fixés dans 4 % d’aldéhyde paraforme après l’insertion peut être vue dans cette figure ici.

Les érythrocytes humains marqués à la biotine FSL montrent que la fixation avec 4 % d’aldéhyde paraforme l’insertion pres n’affecte pas le marquage FSL comme illustré dans les deux figures suivantes ici, 4 % de cellules de carcinome endométrial humain RL 95 fixes peuvent être observées. Alors que sur cette image, les cellules du carcinome humain de l’endomètre RL 95 ne sont pas fixes. Pratiquement aucune différence dans l’étiquetage n’est observée entre les deux images avec ou sans fixation.

Les cytes rouges marqués à la biotine FSL observés dans un échantillon de sang prélevé deux heures après la perfusion intraveineuse des cytes sont montrés ici à gauche, les cellules ont été observées en microscopie optique à droite, le même champ de cellules a été observé en fluorescence et les deux cytes présents peuvent être identifiés en vert. Le calcul du rapport entre les cytes et les cellules non marquées peut être utilisé comme indicateur de survie. Cette dernière image cellulaire marquée à la biotine FSL montre des cytes de biotine endométriale humaine en direct qui ont été visualisés en se liant à des billes réduites.

Cette dernière série d’images montre les interactions de construction du FSL avec les marqueurs de groupe sanguin. La première image est celle de cytes GLI de globules rouges humains recouverts d’une concentration de 500 microgrammes par millilitre de FSLG testés contre des dilutions de sérum humain. Les globules rouges humains ne réagissent pas naturellement avec l’antigène GALI de Xena.

En tant que tels, les cytes peuvent être utilisés pour quantifier les niveaux d’anticorps dans le sérum. Dans cet exemple, il a été déterminé que le patient avait un titre antigénique de un à 32 en créant des cytes avec des niveaux décroissants de FSL. Semblable à la création d’un titre d’antigène, un niveau d’antigène optimal pour détecter l’anticorps peut être déterminé, des cellules peuvent être créées pour donner un résultat positif uniquement lorsque le niveau d’anticorps dépasse un titre spécifique.

Le niveau d’antigène FSL requis pour donner un résultat positif dépend de la qualité et du niveau d’anticorps détectés. Typiquement pour les antigènes glucidiques, une solution FSL de 100 microgrammes par millilitre entraînera une forte réaction positive. Les globules rouges du groupe humain O modifiés pour avoir un niveau spécifique d’un antigène ou soi-disant standardisé.

Les cytes A sont utilisés pour quantifier avec précision et reproductibilité l’antia dans le sérum humain. Dans cet exemple, les cytes ont été préparés à partir des propres globules rouges du donneur et le taux d’antia dans le sérum du groupe O testé s’est avéré être de 1 à 32. Montré ici dans le sixième tube, les antigènes sanguins des groupes sanguins A et B insérés simultanément dans un seul échantillon de globules rouges du groupe O ont été utilisés pour créer des cytes de la semaine B.

Ces cytes peuvent être utilisés à des fins de contrôle de la qualité d’une VO. L’analyse des cycles spécifiquement formulés une semaine, une semaine B testés contre les réactifs antia et anti B donne les réactions faibles attendues, comme en témoigne cette figure, les réactions se produisant dans la zone inférieure médiane des tubes. Cette technique simple peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement.