Construit en FLS: une méthode simple pour la modification des cellules / Virion surfaces avec une gamme de marqueurs biologiques sans affecter leur viabilité

L'objectif général de cette procédure est d'étiqueter de manière inoffensive et rapide les surfaces de cellules vivantes ou de S à l'aide de constructions bioactives. Cette opération est réalisée en préparant tout d'abord une solution de construction d'espacement fonctionnel, de lipide ou de FSL. Ensuite, une partie égale de la solution de construction est mélangée avec une partie égale de la solution de cellules ou de VIRs.

Comme troisième étape, le mélange est incubé pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. La dernière étape consiste à laver les cellules ou cytes modifiées ou les VIRs ou VIRs modifiés et à les utiliser expérimentalement comme d'habitude. En fin de compte, les cellules vivantes ou S modifiées en surface peuvent être visualisées par l'ensemble des techniques d'analyse expérimentale courantes, notamment la cytométrie en flux, la microscopie et l'agglutination.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le marquage covalent réside dans sa rapidité, sa robustesse, sa flexibilité, et le fait qu'elle n'affecte pas la viabilité de la cellule modifiée ou de la souche. Pour préparer la solution mère du construct FSL, ajoutez d'abord un millilitre de diluant au flacon de produit afin de reconstituer le produit FSL sec, créant ainsi une solution mère à un milligramme par millilitre. Soniquez le flacon pendant 30 secondes, aliquotez la solution mère dans des récipients stériles de 100 microlitres, puis conservez les récipients à une température comprise entre 2 et 8 degrés Celsius pendant une durée maximale d'une semaine.

Pour préparer des solutions de travail de constructions FSL destinées à être insérées juste avant utilisation, soniquez à nouveau la solution pendant 30 secondes afin d'homogénéiser les éventuelles agrégats, puis diluez la construction FSL et le tampon à la concentration requise. Conservez la solution de travail à deux à huit degrés Celsius pendant un maximum d'une semaine après la resuspension dans un milieu sans lipides ou dans du PBS. Centrifugez les cellules pour éliminer les lipides non liés avant modification par le FSL. Ensuite, resuspendez les cellules dans 100 microlitres de diluant, et lavez les cellules destinées aux contrôles dans les mêmes conditions jusqu'à obtention de 100 microlitres de cellules non modifiées.

Ajoutez 100 microlitres d'une dilution appropriée de la solution FSL si désiré. En parallèle, préparez également des contrôles négatifs avec des solutions FSL non apparentées et/ou du PBS. Incubez ensuite tous les sous-ensembles cellulaires pendant une heure à 37 degrés Celsius après l'incubation.

Lavez toutes les cellules deux fois avec un milieu sans lipides ou du PBS afin d'éliminer tous les composés FSL libres et préparez une suspension appropriée dans un milieu sans lipides. Une fois le processus de modification par FSL terminé, les coys peuvent être conservés entre quatre et huit degrés Celsius comme une fleur. Les composés FSL sont constitués de trois composantes majeures : la tête fonctionnelle ou F, qui peut être une variété de groupes fonctionnels biologiques.

L'espacer RS est conçu pour induire un écartement de la tête fonctionnelle par rapport à la membrane afin d'améliorer la dispersibilité dans l'eau et pour ne pas réagir avec le sérum humain ni avec le lipide DAL ou L, ce qui permet à l'assemblage de s'incorporer spontanément dans les surfaces quatre. Des groupes FSL représentatifs sont présentés dans les cinq images suivantes. Des embryons de souris vivants ont été directement marqués avec le fluorescéine FSL selon la méthode de deux heures à 37 degrés Celsius dans un milieu de culture cellulaire sans sérum, lavés, puis observés en microscopie de fluorescence.

Dans cette première image, on peut observer un embryon miroir à deux cellules libre de zop palita. La coloration intense au centre de l'embryon est représentative d'une coloration classique du corps polaire. Sur les deux images suivantes, sont présentés des embryons miroirs à quatre cellules et à huit cellules libres de zop palita, qui présentent une coloration floue des cellules situées en dehors du plan de focalisation du microscope.

Une image d'un embryon miroir de 16 cellules sans zop palita est présentée dans cette dernière image de FSL fluorescéine marquant des embryons miroirs vivants, des embryons blastocystiques miroirs intacts âgés de quatre à cinq jours, avec marquage à la fois de l'embryon et du zop LUCITA, montrés dans cette série d'images suivante. Le marquage à la fluorescéine FSL chez le poisson zèbre est illustré. Cette première image montre une micro-angiographie d'une larve de poisson zèbre à 52 heures post-fécondation à laquelle de la fluorescéine FSL a été directement injectée dans la circulation.

La coloration du système vasculaire du poisson zèbre peut être observée ici. Des cellules FSL fluorescéine, des cellules tissulaires hétérogènes du rein de poisson zèbre ou des ZK cytes ont été créées ex vivo, puis micro-injectées dans la circulation d’un poisson zèbre receveur âgé de 52 heures post-fécondation. Des observations in vivo des ZK cytes ont été réalisées deux heures après l’injection par imagerie du système vasculaire en fluorescence à l’aide d’une microscopie en enregistrement temporel. Une image unique issue de la vidéo est présentée, montrant de grandes cellules lentes ou immobiles, indiquées par des flèches oranges, ainsi que des cellules rapides, qui apparaissent floues en raison de leur mouvement, indiquées par des flèches vertes. Sur cette image, la marquage par FSL fluorescéine via une absorption orale du vecteur, obtenu en plongeant des embryons de poisson zèbre dans un milieu contenant de la FSL fluorescéine pendant jusqu’à cinq jours, est illustré.

La microscopie en champ clair du poisson zèbre traité au fluorescéine FSL à gauche correspond à l'image fluorescente adjacente à droite. La fluorescence était localisée préférentiellement dans le tube intestinal. Aucune coloration n'a été observée dans les embryons contrôles non traités présentés ici.

Ici, le virus de la stomatite vésiculaire ou VSV, marqué directement avec 10 microgrammes par millilitre de fluorescéine FSL pendant deux heures à 37 degrés Celsius, suivi d'une fixation avec du paraformaldéhyde à 4 %, puis analysé par scan fact, est présenté sans purification du virion VSV. Une étape de marquage postérieur par FSL était nécessaire. Cet histogramme montre des cellules testiculaires porcines infectées par le virus humain A Puerto Rico 8 19 34 ou H1N1 marqué avec la fluorescéine FSL.

Les cellules non infectées non fluorescences sont représentées par la ligne noire, tandis que la fusion de la corona H1N1 avec les cellules porcines, entraînant une fluorescence, est indiquée par la ligne rouge. Dans cette série d'images suivante, les cellules ont d'abord été marquées avec du biotine FSL pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis lavées et réagies avec de l'avidine marquée Fluor 4, avant d'être à nouveau lavées et montées humides pour la microscopie de fluorescence. La première image montre une image confocale composée de blastomères murins, et cette figure présente une coupe confocale centrale de l'embryon provenant de l'image précédente.

Voici des spermatozoïdes humains mobiles en vie. Le flou est dû à leur mouvement. Une image plus nette et représentative de spermatozoïdes humains fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % après insertion peut être observée sur cette figure ci-dessous.

Des érythrocytes humains marqués par la biotine FSL sont présentés après fixation avec du paraformaldéhyde à 4 % ; la préservation par insertion ne modifie pas le marquage FSL, comme illustré dans les deux figures suivantes. Ici, des cellules de carcinome endométrial humain RL 95 fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % peuvent être observées. Alors que sur cette image, les cellules de carcinome endométrial humain RL 95 ne sont pas fixées. Pratiquement aucune différence dans le marquage n'est observée entre les deux images, avec ou sans fixation.

Des hématies marquées à la biotine FSL observées dans un échantillon sanguin prélevé deux heures après l'infusion intraveineuse des cellules sont montrées ici à gauche ; les cellules ont été observées en microscopie optique à droite, le même champ de cellules a été visualisé en fluorescence, et les deux cellules présentes peuvent être identifiées en vert. Le calcul du ratio des cellules marquées par rapport aux cellules non marquées peut servir d'indicateur de survie. Cette dernière image de cellules marquées à la biotine FSL montre des cellules vivantes de l'endomètre humain marquées à la biotine, visualisées par liaison à des billes revêtues d'anticorps.

Cette série finale d'images montre les interactions des constructions FSL avec les marqueurs de groupes sanguins. La première image représente des globules rouges humains GLI recouverts d'une concentration de 500 microgrammes par millilitre de FSLG, testée contre des dilutions de sérum humain. Les globules rouges humains ne réagissent pas naturellement avec l'antigène Xena ou l'antigène GALI.

Par conséquent, les cytes peuvent être utilisés pour quantifier les niveaux d'anticorps dans le sérum. Dans cet exemple, on a déterminé que le patient présentait un titre d'anticorps de un à 32 en créant des cytes avec des concentrations décroissantes de FSL. De façon similaire à la détermination d'un titre d'antigène, on peut établir une concentration optimale d'antigène permettant la détection d'anticorps ; des cellules peuvent alors être conçues pour donner un résultat positif uniquement lorsque le niveau d'anticorps dépasse un titre spécifique.

Le niveau d'antigène FSL nécessaire pour obtenir un résultat positif dépend de la qualité et de la concentration de l'anticorps détecté. Généralement, pour les antigènes glucidiques, une solution FSL de 100 microgrammes par millilitre entraîne une réaction positive forte. Les globules rouges humains de groupe O modifiés pour présenter un niveau spécifique d'antigène sont dits normalisés.

Des cytes sont utilisés pour quantifier de manière précise et reproductible les anticorps anti-A dans le sérum humain. Dans cet exemple, les cytes ont été préparés à partir des globules rouges du donneur lui-même, et le taux d'anticorps anti-A dans le sérum de groupe O testé s'est révélé être compris entre un et trente-deux. Sur cette image, des cytes faibles A et faibles B ont été préparés en insérant simultanément des antigènes des groupes sanguins A et B dans un échantillon unique de globules rouges de groupe O.

Ces hématies peuvent être utilisées à des fins de contrôle de qualité VO. L'analyse des hématies spécifiquement formulées, testées une semaine A, une semaine B avec les réactifs anti-A et anti-B, donne les réactions faibles attendues, comme le montre cette figure où les réactions se produisent dans la zone inférieure centrale des tubes. Cette technique simple peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.