L'onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l'analyse de protéines complexes

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer la forme globale des complexes protéiques. Ceci est réalisé en acquérant des données de mobilité du fer par spectrométrie de masse pour les ions complexes protéiques et en mesurant les valeurs de temps de dérive de chaque état de charge. Dans un deuxième temps, les conditions expérimentales sont validées afin d’assurer des mesures de mobilité des structures protéiques natives.

Ensuite, les valeurs de temps de dérive mesurées sont corrélées avec les sections transversales. Les résultats déterminent les valeurs de section efficace de collision de protéines ou de complexes protéiques dont la structure tridimensionnelle est inconnue. Ces informations fournissent des indices sur leur forme globale, leur empilement de sous-unités et leur topologie.

Bonjour, je m’appelle Isaac Leski du laboratoire de micro du département de chimie biologique de l’Institut Wiseman des sciences, et je m’appelle Naam Kirschenbaum, également du laboratoire de mi. Aujourd’hui, nous allons montrer une procédure de mesure de complexes protéiques transversaux de collision à l’aide d’instruments de spectrométrie de masse hybride et de mobilité du fer. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la forme globale et l’organisation aire des complexes protéiques.

Alors commençons. Cette procédure se concentre sur la mobilité du fer, la spectrométrie de masse ou l’analyse IMM MS de complexes protéiques. Les étapes de préparation des échantillons, l’étalonnage de l’instrument et les procédures d’optimisation MS et MS en tandem sont illustrées dans un protocole JO associé.

En général, ce protocole implique de faibles concentrations micromolaires de complexe dans un tampon volatil tel que l’acétate d’ammonium. Étant donné qu’un à deux microlitres sont consommés par capillaire à flux nanométrique, préparer 10 à 20 microlitres comme volume minimum pour permettre l’optimisation des conditions MS. Pour commencer cette procédure, réglez l’onde progressive ou l’onde T synap IMMS sur les modes de fonctionnement suivants : mobilité tof dans laquelle la tri-onde et les pressions sont automatiquement réglées pour l’IM et le temps de vol, la séparation des ions, l’acquisition d’ions positifs et le mode V, en réglant la trajectoire des ions à travers le tube de vol et la réflexion pour allumer tous les gaz ici.

L’azote est utilisé pour la séparation IM et l’argon pour les régions de piégeage et de transfert. Les valeurs initiales recommandées sont un débit de gaz de 24 millilitres par minute pour l’appareil IMS et de 1,5 millilitre par minute pour la région du piège. Ensuite, définissez la plage d’acquisition du rapport de charge du mât pour un complexe protéique inconnu.

Utilisez d’abord une large gamme de masses, qui peut ensuite être réduite aux valeurs souhaitées, ajustez le profil MS en conséquence. Pour une efficacité de transmission maximale pour les grands complexes, la plage de masse d’acquisition doit être réglée de 1030 à 2000 MA et le profil MS à auto. Sinon, le profil peut être défini selon le tableau présenté.

Vérifiez le réglage RF et, si nécessaire, ajustez aux valeurs appropriées pour les grands complexes protéiques, comme indiqué. Ensuite, chargez l’échantillon, appliquez une tension capillaire et une faible pression d’écoulement nanométrique. Une fois les pulvérisations initiées, essayez de réduire la pression du nano-flux à une valeur minimale.

De plus, ajustez la position du capillaire par rapport au cône, ajustez les paramètres d’acquisition MS afin d’acquérir un spectre MS bien résolu. Optimisez le gradient de pression le long de l’instrument et du cône d’échantillonnage, ainsi que les paramètres potentiels du piège de polarisation du cône d’extraction et du transfert, comme détaillé dans le protocole JoVE associé. Bien que ces paramètres soient dépendant de l’échantillon, voici les conditions utilisées pour l’acquisition de spectres MS de diverses masses de fer, des complexes peptidiques aux complexes protéiques.

Les gros ions nécessitent des énergies de collision et une tension de polarisation plus élevées. Il est également recommandé d’augmenter la contre-pression pour l’analyse de grands complexes protéiques afin de minimiser l’activation du complexe. Essayez de réduire progressivement par paliers d’environ 10 volts, les tensions d’extraction du cône d’échantillon, de piège à cône et de polarisation sans changer la position du pic.

Une fois qu’un spectre de masse optimal est obtenu, le temps de dérive ou le profil IM doit être ajusté lors de l’analyse des assemblages de protéines. Les conditions optimales pour les mesures de masse et de mobilité sont souvent incompatibles. Par conséquent, il est important de trouver le bon équilibre entre les deux.

Dans l’ensemble, le graphique de la mobilité du fer doit être optimisé de manière à ce que les pics soient répartis sur toute la plage de temps de dérive et que le profil des pics soit lisse. À l’approche d’une distribution générale, une asymétrie de pic significative peut être liée à une mauvaise séparation de plusieurs conformations La vitesse de l’onde T, la hauteur de l’onde T et le débit de gaz IMS peuvent être ajustés pour optimiser la séparation de la mobilité. L’augmentation de la vitesse de l’onde T élargit le profil de distribution du temps de dérive.

Alors que l’augmentation des valeurs de hauteur de l’onde T la rétrécit de la même manière, l’augmentation du débit de gaz IMS à partir de 10 millilitres par minute minimum déplace le profil de temps de dérive vers des valeurs plus élevées pour optimiser le spectre de mobilité du fer. En fixant deux des trois variables et en optimisant la troisième, réglez la vitesse de l’onde T à 250 mètres par seconde et le débit de gaz à 24 millilitres par minute. Ensuite, comme point de départ, réglez la hauteur à trois volts et, par étapes, augmentez-la par incréments d’un volt.

Lorsque des tensions de polarisation élevées sont utilisées, il est recommandé de réduire la pression de gaz IMS et de permettre ainsi la diminution de la tension de polarisation. En conséquence, l’activation complexe et la dissociation seront réduites. Un effet de renversement peut apparaître lorsque les conditions ne sont pas optimisées, observé comme un pic identique dans la première partie du spectre des temps de dérive et le bord de queue.

Lorsque les ions ne traversent pas le dispositif IAM, leur voyage peut prendre plus de temps que le temps nécessaire pour que le prochain paquet de fer soit libéré dans la cellule de mobilité. En conséquence, un nouveau paquet d’ions est libéré de la région de piège avant que le paquet précédent n’ait été livré à la région de poussée. Pour éliminer cet artefact, augmentez la hauteur de l’onde T et diminuez la vitesse de l’onde T et la pression IMS.

De plus, le temps de libération du piège peut être ajusté. De plus, il est important de valider que la hauteur de transfert de l’onde T est réglée sur au moins cinq volts. Également pour empêcher les fuites d’ions vers la cellule IMS.

La hauteur du piège de mobilité doit être maintenue à des niveaux maximum. Une faible vitesse et une amplitude élevée des ondes T de transfert peuvent conduire à l’ondulation du profil de distribution du temps de dérive. Cet artefact se produit lorsque la séparation de mobilité des ions n’est pas maintenue à travers le transfert et les régions difficiles en raison d’une synchronisation partielle entre la fréquence pusha et la vitesse de transfert de l’onde T.

Pour éliminer cet effet, il faut ajuster soit le temps de poussée, soit la vitesse de transfert de l’onde T. Étant donné que la fréquence pusha est liée à la gamme de masse, cet artefact peut réapparaître. Lorsque ce paramètre est modifié.

hauteur de l’onde T exerce un effet mineur. Bien que sa réduction puisse également aider à éliminer les ondulations. Une fois les paramètres susmentionnés optimisés, les données IMMS peuvent être acquises pour obtenir une résolution élevée.

ms. Les complexes protéiques Peaks sont souvent activés dans le spectromètre de masse pour favoriser le stripping de l’eau résiduelle et des composants tampons. Cependant, si l’énergie d’activation est augmentée au-delà d’une valeur seuil, un dépliage partiel peut se produire en formant plusieurs états intermédiaires, qui sont peu susceptibles de correspondre à la structure d’état de la solution native. En conséquence, le pic de temps de dérive peut être décalé et élargi en fonction de la population hydrogène des structures dépliées.

Afin d’obtenir des données de temps de dérive cohérentes avec les structures de phase de solution, il est essentiel de contrôler soigneusement les tensions utilisées pour accélérer les ions avant la séparation IM, par conséquent, d’augmenter la tension capillaire et conique de manière progressive tout en surveillant l’effet sur le spectre de temps de dérive. De plus, pour une résolution MS élevée, il est préférable d’augmenter le transfert plutôt que la tension de piège. Le dispositif IM est positionné en premier, suivi de la région de transfert et de l’analyseur TOF.

Étant donné que l’activation suit la mesure IM et qu’elle n’est pas affectée pour l’IM, tandis que la précision MS peut être augmentée pour garantir que l’acquisition des données est effectuée dans des conditions qui maintiennent la structure native du complexe, il est important de collecter des données sur une gamme de conditions expérimentales et de solutions plutôt que de respecter un seul ensemble optimisé de paramètres. Pour cette raison, augmentez la tension de collision du piège de manière progressive et acquérez des données à des intervalles de 10 volts tout en surveillant l’effet sur le profil de mobilité du fer. Enfin, pour identifier les confirmations dépliées et évaluer les données acquises, induire manuellement la dissociation du complexe protéique en titrant l’échantillon avec de l’acide acétique sur une plage de pH de deux à sept et enregistrer les données, procéder à l’analyse des données dans le système IMS à ondes T, les zones transversales définies par une approche d’étalonnage en temps de dérive, en utilisant des protéines de Caïn dont les valeurs de section efficace sont connues.

Tout d’abord, préparez des solutions de protéines de calibre dénaturé à 10 micromolaires chacune. Utilisez du cytochrome C équin, de la myoglobine cardiaque et de l’ubiquitine bovine dans 49, 49, 0,2, rapport de volume d’eau, de méthanol, d’acide acétique. Ensuite, acquérez les données IMMS pour les protéines de calibre dans exactement les mêmes conditions d’instrument que celles utilisées pour la protéine cible ou le complexe protéique, maintenez toutes les tensions et valeurs de pression identiques pour préserver les paramètres de séparation IM.

Après avoir acquis les données, extrayez la valeur du temps de dérive expérimentale pour chaque charge. L’état des protéines de Caïn corrige chacun des temps de dérive de calibre T prime D en utilisant l’équation suivante où MOVZ est le rapport de charge principal de l’ion observé, et C est le coefficient de retard EDC du rapport cyclique amélioré. Sa valeur, généralement comprise entre 1,4 et 1,6, dépend de l’instrument.

La valeur EDC est indiquée dans les paramètres d’acquisition du système, un onglet de configuration d’acquisition, corrigez chacune des sections transversales du calibre pour l’état de charge du fer et la masse réduite. Où oméga C est la section efficace corrigée, oméga est la section efficace de la littérature, Z est la charge de fer. L’état M est le poids moléculaire de l’ion caïne, et MG est le poids moléculaire du fer.

Le gaz de fond, qui est généralement de l’azote, oppose le lan de T prime D à celui d’oméga C. La courbe résultante correspond à l’équation suivante. Les paramètres X et A peuvent être extraits en ajustant le tracé à une relation linéaire. La pente X correspond au facteur de proportion exponentielle et A représente la constante d’ajustement déterminée.

Calculez le coefficient de corrélation d’ajustement R au carré. Les valeurs acceptables pour R au carré sont supérieures à 0,95. Une valeur de coefficient de corrélation plus faible peut être due à un dépliage incomplet de la protéine, au vieillissement de l’échantillon.

Des conditions expérimentales différentes ont été utilisées pour les protéines de différents calibres, un spectre bruyant et un traitement incomplet des données ou une erreur de calcul. Corrigez le temps de dérive ca à l’aide du facteur exponentiel X déterminé et validez vos calculs en regroupant oméga C en fonction de T prime D. Définissez à nouveau le coefficient de corrélation. Des valeurs supérieures à 0,95 doivent être attendues de la même manière que les étapes décrites ci-dessus, corriger le temps de dérive mesuré de la protéine ou du complexe protéique cible et calibrer le temps de dérive de la protéine ou du complexe protéique cible à l’aide du facteur exponentiel X calculé. Calculer oméga de la protéine ou du complexe protéique cible à l’aide de la constante d’ajustement déterminée A où oméga est égal à un DT. Répétez ces étapes pour chaque condition expérimentale.

Lors de la définition de l’aire de la section efficace de la protéine ou du complexe protéique inconnu, nous recommandons que chaque expérience soit répétée au moins trois fois et que l’écart-type de ces mesures triples soit déterminé une fois que les valeurs de la section efficace de collision sont déterminées. Des approches de modélisation sont employées afin de prédire la topologie ou les arrangements du complexe. Cela se fait en ajustant les valeurs expérimentales de section efficace de collision dans les valeurs silico Omega calculées à partir des structures de modèle générées dans l’ensemble, ce domaine en est encore à ses débuts et un développement supplémentaire est nécessaire pour rendre cette approche générique et applicable à un large éventail de complexes.

La représentation superficielle de la forme tétramère de l’hémoglobine bovine est illustrée ici. Le complexe d’hémoglobine du transporteur d’oxygène peut servir d’exemple pour l’approche mentionnée ci-dessus. L’hémoglobine est un complexe protéique tétramère composé de deux sous-unités alpha et de deux sous-unités bêta, colorées respectivement en bleu et en rouge, qui forment un dimère de dimères d’alpha bêta

Le spectre IMMS de l’hémoglobine est montré ici. Le spectre IM ms acquis du complexe révèle une distribution des séries de charges majeures correspondant au complexe intact et aux séries de charges mineures, qui s’ajuste aux masses des alpha-bêta-dimères et des sous-unités alpha-monomères et bêta-monomères. Le CCS théorique et mesuré des différentes formes d’hémoglobine est présenté ici.

Les valeurs de temps de dérive récupérées pour plusieurs états de charge des formes dimérique et tétramérique ont été utilisées pour calculer les valeurs oméga. Celles-ci ont été comparées aux valeurs théoriques. Étant donné qu’un complexe tétramérique a trois possibilités d’association : soit un dièdre cyclique, soit des empilements en forme de chaîne.

En calculant l’augmentation d’oméga lors du passage d’un dimère à un tétramère, l’organisation structurelle peut être prédite. Des études antérieures et nos propres expériences ont montré une forte corrélation entre le ccss mesuré et les surfaces protéiques dérivées de données structurées en cristaux. Cette corrélation peut être utilisée pour calculer l’augmentation attendue de la surface d’un tétramère par rapport à un dimère pour les différentes formes d’emballage.

Cela se fait en considérant chaque objet asphérique de sous-unité. Un assemblage semblable à une chaîne augmentera le tétramère CCS d’environ deux fois, tandis qu’un garnissage C quatre ou D deux donnera une augmentation d’environ 1,5 et 1,67 respectivement. Le rapport calculé entre les valeurs CCS mesurées des formes tétramères et DME de l’hémoglobine était de 1,57 plus ou moins 0,03.

Ce nombre illustre que la structure native n’est pas organisée linéairement, mais qu’elle est disposée sous une forme plus compacte, soit sous forme de tétramère cyclique, soit sous forme de tétramère dièdre. En répétant le même calcul sur la structure cristalline résolue de l’hémoglobine, le rapport des surfaces des formes tétramères et DME était de 1,63, ce qui correspond à une symétrie D deux. De toute évidence, ce modèle géométrique a été simplifié et les sous-unités protéiques ne sont pas simplement sphériques.

Cependant, ce calcul démontre le potentiel passionnant de l’IMMS pour révéler l’empilement de complexes avec des structures inconnues à haute résolution. Je viens de vous montrer comment mesurer le temps de dérive des protéines et des complexes protéiques, c’est-à-dire comment calculer leurs valeurs de section efficace de collision. Lors de cette procédure, il est important d’acquérir les données IMMS pour les protéines de calibre en utilisant exactement les mêmes conditions que celles utilisées pour la protéine cible ou les complexes protéiques.

De plus, nous recommandons fortement de répéter au moins trois fois ces expériences et de déterminer l’écart-type de ces mesures en trois exemplaires. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.