Name: Londe T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour lanalyse de protéines complexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: Apprenez à analyser la forme des complexes protéiques par spectrométrie de masse à mobilité ionique. Cette méthode permet de déterminer les sections efficaces de collision et la topologie des structures protéiques inconnues.

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Les auteurs remercient les membres du groupe de Sharon pour leur examen critique, et pour leur contribution au manuscrit. Nous sommes reconnaissants de l&#39;appui des programmes et des Morasha Bikura, l&#39;Israel Science Foundation (Grant 378/08 et n ° 1823-1807), Josef Cohn Minerva Centre de recherche biomembrane, la famille Chais Fellows Program pour les nouveaux chercheurs, l&#39;Abraham et Sonia Rochlin Fondation Trust Wolfson famille de bienfaisance, le Helen et Milton A. Kimmelman Center for Structure biomoléculaire et de l&#39;Assemblée; la succession de Shlomo et Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, et Karen Siem, Royaume-Uni.

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Le protocole décrit ici permet de définir la section de collision des protéines ou des complexes de protéines avec une structure en trois dimensions inconnues, dans le but de fournir des informations sur leur forme générale, l&#39;emballage sous-unité et de la topologie. À cette fin, une fois les valeurs de collision section transversale sont représentés, il est nécessaire de convertir ces valeurs pour plus de détails structuraux. Ce processus exige des efforts supplémentaires d&#39;expérimentation ainsi que l&#39;analyse informatique, qui sont brièvement discutées ci-dessous. Pour commencer, il est recommandé d&#39;analyser les protéines ou des complexes de protéines avec des structures connues. Ces mesures peuvent fournir un contrôle de la qualité de la méthodologie utile et permettra évaluation de l&#39;exactitude des paramètres d&#39;acquisition en comparant les valeurs théoriques et mesurées Ω. La théorie Croix zones sectionnelle peut calculer la structure cristalline coordonne utilisant les MOBCAL 15,16 logiciel qui sont une source du logiciel open FORTRAN base permettent édition codes conformément aux besoins conducteur. Pour exécuter ces calculs, il est nécessaire de modifier le programme de telle sorte que le nombre de calculs itératifs effectués par la structure d&#39;entrée est augmentée et que les fichiers contenant de coordonner grand nombre d&#39;atomes sont acceptés 1. Une stratégie de GI-MS pour la définition des arrangements topologique de sous-unités au sein des assemblées multicomposant a été récemment proposé 4,6. La méthode implique la surveillance des voies de dissociation des assemblages de protéines pour de plus petits composants. Cette dissociation est obtenue par un ajustement des conditions contrôlées en phase solution, qui donne lieu à une répartition des sous-complexes reflet de la «building blocks» des assemblées. La mesure simultanée des valeurs de Ω à la fois des complexes intacts et le démontage des produits génère des contraintes structurelles qui sont ensuite utilisés pour calculer les modèles topologiques des complexes protéiques. L&#39;hypothèse de base de cette méthodologie est que le sous-complexes générées conservent leur native-like confirmations, et en effet des études récentes ont démontré que la structure en solution des produits de démontage est maintenue et aucun réarrangement majeur dans les deux phases de solution ou de gaz ont eu lieu 4,6. La dernière étape dans la cession de la structure quaternaire des protéines à des ions en phase gazeuse complexe montage des valeurs de collision section transversale de modèles par ordinateur. Approches de modélisation sont employées dans le but d&#39;explorer les différents arrangements possibles topologique de sous-unités et de leurs valeurs dans Ω silico sont calculés et comparés à ceux expérimentaux. Actuellement, seuls quelques approches de calcul sont utilisées, comme le spheretype grossiers méthode qui se rapproche du diamètre de 1,8 unités. Dans l&#39;ensemble, ce domaine est encore à ses débuts et le développement est nécessaire pour faire de cette approche générique et applicable à un large éventail de complexes.

l&#39;onde t de mobilité ionique et spectrométrie de masse: procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

De mobilité ionique (IM) est une méthode qui mesure le temps pris pour un ion de voyager à travers une cellule de pression sous l&#39;influence d&#39;un champ électrique faible. La vitesse avec laquelle les ions traversent la région de dérive dépend de leur taille: les gros ions connaîtront un plus grand nombre de collisions avec le gaz inerte de fond (généralement N 2) et donc voyager plus lentement à travers le dispositif de messagerie instantanée que ceux des ions qui composent une petite section transversale. En général, le temps qu&#39;il faut pour les ions de migrer si la phase de gaz dense qui les sépare, selon leur collision section transversale (Ω). Récemment, la spectrométrie de IM a été couplée à la spectrométrie de masse et un voyage-onde (onde T) Synapt mobilité ionique du spectromètre de masse (IM-MS) a été libéré. Intégration spectrométrie de masse avec la mobilité des ions permet une dimension supplémentaire de séparation des échantillons et la définition, ce qui donne un spectre en trois dimensions (masse à temps de charge, l&#39;intensité et la dérive). Cette technique de séparation permet le chevauchement spectral à diminuer, et permet la résolution des complexes hétérogènes avec une masse très semblable, ou masse-charge des ratios, mais les temps de dérive différent. Par ailleurs, les mesures de temps de dérive de fournir une couche importante d&#39;informations structurelles, comme Ω est liée à la forme générale et la topologie de l&#39;ion. La corrélation entre les valeurs mesurées du temps de dérive et Ω est calculée en utilisant une courbe de calibration générée à partir des protéines calibrant avec défini des sections 1. La puissance de l&#39;approche MI-MS réside dans sa capacité à définir l&#39;emballage sous-unité et la forme globale des assemblages de protéines à des concentrations micromolaires, et proche des conditions physiologiques 1. Plusieurs études récentes de messagerie instantanée à la fois des protéines individuelles 2,3 et complexes protéiques non-covalentes 4-9, démontré avec succès que la structure des protéines quaternaires est maintenue dans la phase gazeuse, et a souligné le potentiel de cette approche dans l&#39;étude des assemblages protéiques de géométrie inconnue . Ici, nous fournir une description détaillée de l&#39;IMS-MS analyse des complexes protéiques en utilisant les Synapt (quadripôle-Ion Mobility-Time-of-Flight) instrument de HDMS (Waters Ltd; le seul commerciales IM-MS instruments actuellement disponibles) 10. Nous décrivons les étapes d&#39;optimisation de base, l&#39;étalonnage de la collision des sections, et les méthodes de traitement des données et leur interprétation. L&#39;étape finale du protocole décrit les méthodes de calcul des valeurs théoriques Ω. Globalement, le protocole ne vise pas à couvrir tous les aspects de la GI-MS caractérisation des assemblages protéiques, mais plutôt son objectif est de présenter les aspects pratiques de la méthode à de nouveaux chercheurs dans le domaine.

De mobilité ionique et spectrométrie de masse est une société émergente en phase gazeuse technologie qui sépare les ions, basée sur leur collision section transversale et la masse. La méthode fournit des informations tridimensionnelles sur la topologie et la forme générale de complexes protéiques. Ici, nous présentons une procédure de base pour réglage de l&#39;appareil et l&#39;optimisation, l&#39;étalonnage du temps de dérive, et l&#39;interprétation des données.

L&#39;onde T de mobilité ionique et spectrométrie de masse: Procédures de base expérimentale pour l&#39;analyse de protéines complexes

La mobilité ionique (MI) est une méthode qui mesure le temps nécessaire à un ion pour traverser une cellule pressurisée sous l'influence d'un champ électrique faible. ...

Le but général de l'expérience suivante est de déterminer la forme globale des complexes protéiques. Cela est réalisé en acquérant des données de mobilité ionique en spectrométrie de masse pour les ions de complexes protéiques et en mesurant les valeurs de temps de dérive de chaque état de charge. Dans un deuxième temps, les conditions expérimentales sont validées afin de garantir des mesures de mobilité de structures protéiques natives.Ensuite, les valeurs mesurées du temps de dérive sont corrélées aux aires de section efficace. Les résultats permettent de déterminer les valeurs de section efficace de collision des protéines ou des complexes protéiques dont la structure tridimensionnelle est inconnue. Ces informations fournissent des indices sur leur forme globale, l'empaquetage des sous-unités et la topologie.Bonjour, je suis Isaac Leski du laboratoire de Mic, département de chimie biologique à l'Institut Wiseman des Sciences, et je suis Naam Kirschenbaum, également du laboratoire de mi. Aujourd'hui, nous allons présenter une procédure de mesure des sections efficaces de collision de complexes protéiques à l'aide de spectrométrie de masse hybride et d'instruments de mobilité ionique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la forme globale et l'organisation spatiale des complexes protéiques.Commençons. Cette procédure porte sur la mobilité du fer et l'analyse par spectrométrie de masse, ou analyse IMM MS, des complexes protéiques. Les étapes de préparation des échantillons, l'étalonnage de l'instrument ainsi que les procédures d'optimisation de la spectrométrie de masse et de la spectrométrie de masse en tandem sont décrites dans un protocole JOVE associé.En général, ce protocole implique des concentrations faibles en micromolaire du complexe dans un tampon volatil tel que l'acétate d'ammonium. Étant donné qu'un à deux microlitres sont consommés par capillaire à débit nanométrique, préparez 10 à 20 microlitres comme volume minimal afin d'optimiser les conditions de spectrométrie de masse. Pour commencer cette procédure, réglez l'IMMS à onde de déplacement ou onde T sur les modes opératoires suivants : mobilité en fonction du temps de vol, dans lesquels les ondes triphasées et les pressions sont automatiquement réglées pour la séparation des ions par mobilité ionique et par temps de vol, acquisition en mode ion positif et mode V, en définissant le trajet des ions à travers le tube de vol et en activant la réflexion ; activez tous les gaz ici.L'azote est utilisé pour la séparation en IMS et l'argon pour les régions de piégeage et de transfert. Les valeurs initiales recommandées sont un débit de gaz de 24 millilitres par minute pour le dispositif IMS et de 1,5 millilitre par minute pour la région de piégeage. Ensuite, définissez la plage d'acquisition du rapport de charge du mât pour un complexe protéique inconnu.Utilisez initialement une plage de masse étendue, que vous pourrez ensuite réduire aux valeurs souhaitées, puis ajustez le profil de spectrométrie de masse en conséquence. Pour une efficacité maximale de transmission des grands complexes, la plage de masse d'acquisition doit être définie entre 1030 et 2000 MA rapport de charge, et le profil MS sur auto. Sinon, le profil peut être réglé selon le tableau indiqué.Vérifiez le réglage RF et, si nécessaire, ajustez-le aux valeurs appropriées pour les grands complexes protéiques comme indiqué. Ensuite, chargez l'échantillon, appliquez une tension capillaire et une pression d'écoulement nanolitrique faible. Une fois que les pulvérisations ont commencé, essayez de réduire la pression d'écoulement nanolitrique à une valeur minimale.En outre, ajustez la position du capillaire par rapport au cône, et réglez les paramètres d'acquisition du spectromètre de masse afin d'obtenir un spectre de masse bien résolu. Optimisez le gradient de pression le long de l'appareil et du cône d'échantillonnage, ainsi que les réglages de potentiel du piège de polarisation du cône d'extraction et du transfert, comme détaillé dans le protocole JoVE associé. Bien que ces paramètres dépendent de l'échantillon, voici les conditions utilisées pour acquérir les spectres de masse de diverses masses de fer, allant des peptides aux complexes protéiques.Les ions de grande taille nécessitent des énergies de collision et une tension de polarisation plus élevées. Il est également recommandé d'augmenter la pression arrière lors de l'analyse de grands complexes protéiques afin de minimiser l'activation du complexe. Essayez de réduire progressivement par paliers d'environ 10 volts les tensions d'extraction du cône d'échantillon, du piège à cône et de polarisation, sans modifier la position du pic.Une fois qu'un spectre de masse optimal est obtenu, il convient d'ajuster le temps de dérive ou le profil de mobilité ionique lors de l'analyse des assemblages protéiques. Les conditions optimales pour les mesures de masse et de mobilité sont souvent incompatibles. Il est donc essentiel de trouver un compromis adéquat entre les deux.Dans l'ensemble, le tracé de mobilité de l'ion doit être optimisé de manière à ce que les pics soient répartis sur toute la plage de temps de dérive et que le profil du pic soit lisse. Une asymétrie prononcée du pic peut indiquer une séparation insuffisante de plusieurs conformations. La vitesse de l'onde T, la hauteur de l'onde T et le débit du gaz IMS peuvent être ajustés pour optimiser la séparation par mobilité. L'augmentation de la vitesse de l'onde T élargit le profil de distribution du temps de dérive.Alors que des valeurs accrues de la hauteur de l'onde T la rétrécissent de manière similaire, l'augmentation du débit de gaz IMS à partir d'un minimum de 10 millilitres par minute déplace le profil de temps de dérive vers des valeurs plus élevées, ce qui permet d'optimiser le spectre de mobilité ionique. En fixant deux des trois variables et en optimisant la troisième, réglez la vitesse de l'onde T à 250 mètres par seconde et le débit de gaz à 24 millilitres par minute. Ensuite, comme point de départ, réglez la hauteur à trois volts et, de manière progressive, augmentez-la par incréments d'un volt.Lorsqu'on utilise des tensions de polarisation élevées, il est recommandé de réduire la pression du gaz dans le système IMS afin de permettre une diminution de la tension de polarisation. Par conséquent, les activations et dissociations complexes seront réduites. Un effet de recouvrement peut apparaître lorsque les conditions ne sont pas optimisées, observé sous la forme d'un pic identique dans la partie initiale du spectre des temps de dérive et sur le flanc de décroissance.Lorsque les ions ne traversent pas entièrement le dispositif IAM, leur trajet peut effectivement prendre plus de temps que celui nécessaire à la libération du prochain paquet de fer dans la cellule de mobilité. Par conséquent, un nouvel ensemble d'ions est libéré depuis la région de piégeage avant que le paquet précédent n'ait été acheminé vers la région de poussée. Pour éliminer cet artefact, augmentez la hauteur de l'onde T et réduisez la vitesse de l'onde T ainsi que la pression du SMF.En outre, la durée de libération du piège peut être ajustée. Par ailleurs, il est important de valider que la hauteur de l'onde T de transfert est réglée à au moins cinq volts. Également pour éviter toute fuite d'ions vers la cellule IMS.La hauteur du piège de mobilité doit être maintenue à son niveau maximal. Une faible vitesse et une amplitude élevée des ondes de transfert T peuvent entraîner des ondulations dans le profil de distribution du temps de dérive. Cet artefact se produit lorsque la séparation par mobilité des ions n'est pas conservée à travers les régions de transfert et de passage en raison d'une synchronisation partielle entre la fréquence de poussée et la vitesse de l'onde T de transfert.Pour éliminer cet effet, il convient de régler soit le temps du pousseur, soit la vitesse de l'onde T de transfert. Étant donné que la fréquence du pousseur est liée à la plage de masse, cet artefact peut réapparaître lorsque ce paramètre est modifié.La hauteur de l'onde T exerce un effet mineur. Bien que sa réduction puisse également contribuer à éliminer les ondulations. Une fois que les paramètres susmentionnés sont optimisés, les données IMMS peuvent être acquises afin d'obtenir une résolution élevée.Les complexes protéiques MS.Peaks sont souvent activés dans le spectromètre de masse afin de favoriser l'élimination de l'eau résiduelle et des composants tampons. Toutefois, si l'énergie d'activation dépasse une valeur seuil, un dépliement partiel peut survenir, formant plusieurs états intermédiaires qui ne correspondent vraisemblablement pas à la structure native en solution. En conséquence, le pic de temps de dérive peut être décalé et élargi, reflétant la population hétérogène de structures dépliées.Pour obtenir des données de temps de dérive cohérentes avec les structures en phase solution, il est essentiel de contrôler soigneusement les tensions utilisées pour accélérer les ions avant la séparation par mobilité ionique ; par conséquent, augmentez progressivement la tension du capillaire et celle du cône tout en surveillant leur effet sur le spectre de temps de dérive. De plus, afin d'obtenir une résolution MS élevée, il est préférable d'augmenter la tension de transfert plutôt que la tension de piégeage. Le dispositif de mobilité ionique est positionné en premier, suivi de la région de transfert et de l'analyseur TOF.Étant donné que l'activation suit la mesure de l'IM, les données restent inchangées pour l'IM, tandis que la précision de la SM peut être augmentée afin de garantir que l'acquisition des données s'effectue dans des conditions permettant de préserver la structure native du complexe. Il est donc essentiel de recueillir des données sur une gamme de conditions expérimentales et de solutions, plutôt que de se limiter à un seul ensemble de paramètres optimisés. Pour cette raison, augmentez progressivement la tension de collision du piège par paliers de 10 volts et acquérez des données à chaque intervalle, tout en surveillant l'effet sur le profil de mobilité ionique. Enfin, afin d'identifier les conformations dénaturées et d'évaluer les données obtenues, induisez manuellement la dissociation du complexe protéique en titrant l'échantillon avec de l'acide acétique sur une plage de pH allant de deux à sept, enregistrez les données, puis procédez à leur analyse dans le système T wave IMS, en déterminant les aires de section efficace à l'aide d'une méthode de calibration du temps de dérive, en utilisant des protéines Cain dont les valeurs de section efficace sont connues.Préparez tout d'abord des solutions protéiques dénaturées d'étalonnage à 10 micromolaire chacune. Utilisez du cytochrome C équin, de la myoglobine cardiaque et de l'ubiquitine bovine dans un rapport volumétrique de 49, 49, 0,2 d'eau, de méthanol et d'acide acétique. Ensuite, acquérez les données IMMS pour les protéines d'étalonnage dans des conditions instrumentales strictement identiques à celles utilisées pour la protéine cible ou le complexe protéique, en conservant toutes les tensions et valeurs de pression identiques afin de préserver les paramètres de séparation IM.Après avoir acquis les données, extrayez la valeur expérimentale du temps de dérive pour chaque charge. À l'aide des protéines Cain, corrigez chacun des temps de dérive calibrés T' D en utilisant l'équation suivante, où MOVZ est le rapport de charge principal de l'ion observé, et C est le coefficient de retard du cycle de travail amélioré (EDC). Sa valeur, généralement comprise entre 1,4 et 1,6, dépend de l'instrument.La valeur EDC est indiquée dans les paramètres d'acquisition du système, sous l'onglet configuration de l'acquisition ; elle permet de corriger chacune des sections efficaces pour l'état de charge du fer et la masse réduite. Où ωC correspond à la section efficace corrigée, ω à la section efficace issue de la littérature, Z à l'état de charge du fer, M au poids moléculaire de l'ion cationique et MG au poids moléculaire du fer.Gaz résiduel, qui est généralement de l'azote plop lelan de T prime D contre lelan de omega C. La courbe obtenue correspond à l'équation suivante. Les paramètres X et A peuvent être extraits en ajustant le tracé à une relation linéaire. La pente X correspond au facteur de proportionnalité exponentielle, et A représente la constante déterminée par l'ajustement.Calculez le coefficient de corrélation du modèle, R carré. Les valeurs acceptables de R carré sont supérieures à 0,95. Une valeur plus faible du coefficient de corrélation peut être due à un déroulement incomplet de la protéine ou au vieillissement de l'échantillon.Conditions expérimentales différentes utilisées pour les protéines de calibre variable, spectre bruité et traitement incomplet des données ou erreur de calcul. Corrigez le temps de dérive du ca en utilisant le facteur exponentiel X déterminé et validez vos calculs en traçant à nouveau l'omega C en fonction de T prime D. Redéfinissez le coefficient de corrélation. Des valeurs supérieures à 0,95 sont à attendre. De manière similaire aux étapes décrites précédemment, corrigez le temps de dérive mesuré de la protéine cible ou du complexe protéique et étalonnez le temps de dérive de la protéine cible ou du complexe protéique à l’aide du facteur exponentiel X calculé. Calculez l'omega de la protéine cible ou du complexe protéique à l’aide de la constante A déterminée par ajustement, où omega est égal à a TD. Répétez ces étapes pour chaque condition expérimentale.Lors de la détermination de la section efficace d'un protéine ou d'un complexe protéique inconnu, nous recommandons de répéter chaque expérience au moins trois fois et de calculer l'écart type de ces mesures en triplicat une fois les valeurs de section efficace de collision obtenues. Des approches de modélisation sont utilisées afin de prédire la topologie ou l'agencement du complexe. Cela s'effectue en ajustant les valeurs expérimentales de section efficace de collision aux valeurs Omega calculées in silico à partir de structures modèles générées. Dans l'ensemble, ce domaine en est encore à ses débuts et nécessite des développements supplémentaires pour rendre cette approche générique et applicable à un large éventail de complexes.La représentation de surface de la forme tétramérique de l'hémoglobine bovine est montrée ici. Le complexe transporteur d'oxygène, l'hémoglobine, peut servir d'exemple pour l'approche mentionnée ci-dessus. L'hémoglobine est un complexe protéique tétramérique composé de deux sous-unités alpha et de deux sous-unités beta, colorées respectivement en bleu et en rouge, qui forment un dimère de dimères alpha beta.Le spectre IMMS de l'hémoglobine est présenté ici. Le spectre IM ms acquis pour le complexe révèle une distribution principale en série de charges correspondant au complexe intact, ainsi que des séries de charges mineures correspondant aux masses du dimère alpha-bêta et des sous-unités monomériques alpha et bêta. Les valeurs théoriques et mesurées de la CCS des différentes formes de l'hémoglobine sont indiquées ici.Les valeurs de temps de dérive obtenues pour plusieurs états de charge des formes dimériques et tétramériques ont été utilisées pour calculer les valeurs d'omega. Celles-ci ont été comparées aux valeurs théoriques. Étant donné qu'un complexe tétramérique présente trois possibilités d'association, soit des empilements cycliques, diédriques ou en chaîne.En calculant l'augmentation de l'omega lors du passage d'un dimère à un tétramère, il est possible de prédire l'organisation structurale. Des études antérieures et nos propres expériences ont montré une forte corrélation entre les ccss mesurés et les aires de surface des protéines dérivées de données structurales cristallines. Cette corrélation peut être utilisée pour calculer l'augmentation attendue de la surface d'un tétramère par rapport à un dimère pour les différentes formes d'empilement.Cela est effectué en considérant chaque sous-unité comme un objet non sphérique. Un assemblage en forme de chaîne augmentera la CCS du tétramère d'environ deux fois, tandis qu'un empilement de type C4 ou D2 entraînera une augmentation d'environ 1,5 et 1,67 respectivement. Le rapport calculé entre les valeurs de CCS mesurées des formes tétramérique et DME de l'hémoglobine était de 1,57 ± 0,03.Ce nombre indique que la structure native n'est pas organisée de façon linéaire, mais qu'elle adopte une forme plus compacte, soit un tétramère cyclique, soit un tétramère diédral. En répétant le même calcul sur la structure cristalline résolue de l'hémoglobine, le rapport des aires superficielles des formes tétramériques et DME était de 1,63, ce qui correspond à une symétrie D deux. Évidemment, ce modèle géométrique était simplifié et les sous-unités protéiques ne sont pas simplement sphériques.Cependant, ce calcul démontre le potentiel prometteur de la SMIM pour révéler l'empaquetage de complexes dont les structures à haute résolution sont inconnues. Je viens de vous montrer comment mesurer le temps de dérive des protéines et des complexes protéiques, ainsi que comment calculer leurs valeurs de section efficace de collision. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel d'acquérir les données de SMIM pour les protéines étalon en utilisant exactement les mêmes conditions que celles utilisées pour la protéine cible ou les complexes protéiques.En outre, nous recommandons vivement de répéter ces expériences au moins trois fois et de déterminer l'écart type de ces mesures en triple exemplaire. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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