Visualisation et quantification des données de cytométrie à haute dimension à l'aide de Cytofast et des méthodes de clustering en amont FlowSOM et Cytosplore

Les données générées par la cytométrie de masse sont complexes et doivent être visualisées de manière efficace et simple. Cytofast est une méthode qui met en évidence les modèles immunologiques au sein de la population de cellules immunitaires et détermine les sous-ensembles cellulaires qui sont liés à des traitements cliniques ou des groupes expérimentaux. Cytofast peut être appliqué après n’importe quelle méthode de cristallisation comme FlowSOM ou Cytosplore.

Il vous permettra de découvrir un sous-ensemble cellulaire lié au traitement clinique ou à un groupe expérimental. Avec cette méthode, vous serez en mesure de voir la vue d’ensemble immunologique des données en un coup d’œil d’une manière quantitative. Commencez par créer des clusters avec Cytosplore ou FlowSOM.

Si vous utilisez Cytosplore, téléchargez les fichiers FCS en cliquant sur Fichiers et ouvrez les fichiers FCS. Sélectionnez ensuite un cofacteur pour la transformation Hyperbolic ArcSinh lorsqu’il est invité et cliquez sur ajouter une balise d’échantillon unique comme canal. Sélectionnez exécuter HSNE pour exécuter un niveau HSNE de trois et attendre que la carte soit générée.

Au premier niveau HSNE, vérifiez les cellules positives pour le CD161 en sélectionnant les cellules positives CD161 et en cliquant à droite sur la sélection. Au deuxième niveau, répétez la procédure pour atteindre le troisième niveau avec seulement des événements positifs CD161. Une fois la dernière carte TSNE générée, enregistrez les clusters définis par Cytosplore en cliquant à droite sur la carte et en choisissant des clusters d’sauvegarde.

Choisissez l’répertoire des fichiers de sortie tel qu’il est invité par Cytosplore et notez cet emplacement, car il sera plus tard utilisé pour charger les fichiers FSC dans R.Utilisez un nom de caractères simple seulement lors de la renommation des fichiers de sortie qui rendra l’identification et la manipulation plus facile et sélectionnez enregistrer. Chargez les fichiers en R avec la fonction désignée readcytosploreFCS. Pour nettoyer les données, supprimez certains paramètres tels que le temps et l’arrière-plan en vérifiant la position de la colonne liée à ses paramètres inutiles et en les supprimant de la matrice.

Ensuite, réorganisez les marqueurs de sorte que les marqueurs de lignée soient affichés d’abord suivis de marqueurs fonctionnels. Reliez le fichier de métadonnées aux données générées par Cytosplore en téléchargeant le métafichier de la feuille de calcul contenant des informations cliniques. Pour effectuer le clustering par FlowSOM, chargez les données brutes qui étaient précédemment activées sur les événements positifs CD161 en R avec la lecture.

fonction flowSet. Sélectionnez les marqueurs biologiques pertinents en sélectionnant les colonnes appropriées et en transformant les données d’une manière ArcSinh5. Appliquez un cofacteur de cinq en choisissant cofacter=5 dans la fonction.

Regroupez les données à l’aide de la fonction FlowSOM et comparez FlwoSOM et Cytosplore en choisissant de regrouper les données en 10 sous-ensembles identiques à la sortie précédemment donnée par Cytosplore. Ensuite, assignez chaque cellule à son sous-ensemble identifié et à son échantillon ID.Chargez le fichier de métadonnées en R contenant l’affectation du groupe et reliez-la aux fichiers FCS en utilisant le code du manuscrit du texte. Créez une liste des FC en fonction du cadre de données obtenu auprès de FlowSOM.

Puis réorganiser les marqueurs pour apparaître de la même manière que la sortie de l’analyse Cytosplore. Avant de créer les cartes thermiques, générer la table de compt compte par échantillon en utilisant la cellule fonctionCount. Étant donné que certains clusters contiennent moins de cellules que d’autres, mettre à l’échelle les données par cluster en spécifier scale=true à l’intérieur de la fonction, ce qui facilite la dispersion entre les échantillons.

Visualisez les données à l’aide d’une carte thermique puis visualisez avec des parcelles de boîte en générant le nombre de cellules, mais pas en faisant le point sur les données pour obtenir la fréquence de chaque cluster. Enfin, visualisez l’intensité d’expression des marqueurs CD45, CD11c et CD54 par les noms des marqueurs de notage et les inclure dans la fonction de l’intrigue MSI. Cytofast exécute plusieurs sorties possibles, y compris la carte thermique de tous les clusters identifiés dans l’analyse et basés sur l’expression des marqueurs.

Le dendrogram sur le dessus représente la similitude hiérarchique entre les clusters identifiés. Le panneau supérieur affiche une autre carte thermique montrant la quantité relative de sous-ensembles correspondants dans chaque échantillon. Pendant ce temps, le dendrogram sur la droite montre la similitude entre les échantillons basés sur des fréquences sous-ensemble démontrant que le phénotype des cellules tueuses naturelles est façonné par le traitement PD-L1 trois jours après l’injection.

Les cartes thermiques combinées peuvent être obtenues pour FlowSOM suivi de Cytofast et de Cytosplore suivi de Cytofast. Cytofast peut également être utilisé pour présenter les données quantitativement et afficher les résultats dans les parcelles de boîte. Une autre caractéristique qui est incluse dans le paquet Cytofast est la fonction de parcelle MSI qui montre l’intrigue médiane d’intensité du signal de chaque marqueur par groupe.

Cette fonction permet de détecter des changements mondiaux tels que l’augmentation de l’expression du CD54 ou du CD11c dans les cellules tueuses naturelles du groupe traité PD-L1. Cette technique est un moyen rapide de visualiser et de quantifier les données et peut être utilisée pour découvrir de nouvelles réponses cellulaires après la thérapie. Après cette méthode, le paquet de test global en R peut être utilisé pour tester un groupe de covariates pour l’association avec les variables de réponse.

Cela montrera la corrélation entre chaque sous-ensemble et les résultats cliniques.