Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Cet article présente des méthodes pour générer, purifier et quantifier les vésicules extracellulaires Caenorhabditis elegans.

Le champ de vésicules extracellulaires n’a pas de modèle d’invertébré génétiquement rétractable pour étudier les signaux protéiques et ARN des vésicules extracellulaires. Ce protocole établit les méthodes pour obtenir des vésicules extracellulaires abondantes et pures de C.elegans. Ceci est suffisant pour une analyse robuste de l’ARN-SEQ et de la protéomique.

Lorsque la culture synchronisée C.elegans a épuisé les aliments de leur assiette moyenne de croissance normale, utilisez des élastiques pour fixer un bouchon de filtre en maille de nylon de cinq micromètres sur une bouteille stérile et démarrer un vide. Verser les vers L1 sur le filtre et passer un volume égal de milieu sur les agrégats de vers. Après vortex, transférer trois volumes de 10 microlitres de la suspension du ver sur un couvercle de plaque de culture de vers et compter le nombre d’animaux dans chaque goutte.

Réglez la suspension du ver à deux animaux par microlitre de milieu frais et vortex de la suspension à nouveau. Ensuite, ajoutez neuf gouttes de vers de 10 microlitres sur un nouveau couvercle de plaque et comptez manuellement le nombre d’animaux dans chaque goutte. Calculez ensuite l’erreur moyenne et standard de la moyenne en pourcentage de chaque population de vers et calculez le nombre total d’animaux dans chaque population.

Pour préparer les vers à la génération sécrétaire, lavez les vers avec trois lavages de cinq minutes en 15 millilitres de milieu stérile M9 avec 50 microgrammes par millilitre de carbenicilline par plaque par lavage avec un tourbillonnant doux pour déloger les vers, en mettant en commun les lavages dans un tube conique de 50 millilitres. Après le dernier lavage, diluer les vers à un animal par microlitre de solution S-Basel complété par 2,5 microgrammes par millilitre de cholestérol et 50 micromolaires de concentration de carbenicilline. Ajoutez ensuite jusqu’à 400 millilitres de suspension de ver à un flacon stérile de deux litres dérouté.

Placez le flacon sur un rotateur circulaire à 20 degrés Celsius et 100 rotations par minute pendant 24 heures. Pour la récolte extracellulaire de vésicule, transférez les vers dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation et décantez le supernatant par un filtre sous vide de 0,22 micromètre pour enlever les débris de particules. Après compter, placez une goutte de vers suspendus sur une pelouse bactérienne et marquez les animaux comme se déplaçant, paralysés ou morts après 15 minutes.

Ensuite, concentrez le supernatant filtré à 700 microlitres avec un filtre régénéré de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons et ajoutez 150 microlitres de solution S-Basel fraîche à la réduction. Filtrez et vortexez la solution qui en résulte et répétez la réduction et la filtration deux fois de plus comme nous venons de le démontrer. Après la dernière filtration, centrifugez le supernatant pour éliminer les particules et les débris qui pourraient s’être accumulés pendant la manipulation et ajouter le cocktail inhibiteur de la protéase plus EDTA selon les instructions du fabricant.

Pour préparer la colonne d’exclusion de taille, décanter 15 millilitres de résine d’agarose suspendue dans une cartouche vide de colonne d’écoulement de gravité. Lorsque la colonne est drainée, ajouter la solution S-Basel jusqu’à ce que le lit en résine soit emballé à un volume final de 10 millilitres. Remplacez le tampon de résine par 40 millilitres de solution S-Bâle filtrée stérile, en prenant soin de ne pas déranger la résine, et laissez la gravité drainer le tampon à travers la colonne.

Une fois que le dessus de la résine n’est plus submergé, capuchon le fond de la cartouche pour arrêter le flux et placer un tube de collecte sous la colonne. Pour initier la fractionnement sécrétome, retirez le bouchon et ajoutez immédiatement la solution sécréteuse concentrée en haut du lit de colonne, suivie de l’ajout d’un millilitre de solution S-Basel drop-wise. Placez un tube de collecte frais sous la colonne et remplissez lentement le réservoir de la colonne supérieure de cinq millilitres de solution S-Basel.

Après avoir recueilli les deux premiers millilitres d’évasif, changez rapidement les tubes pour recueillir les quatre millilitres suivants. Utilisez un filtre de spin de coupure de poids moléculaire régénéré de 10 kilodaltons pour concentrer la vésicule extracellulaire contenant de l’allongement de la colonne à 300 microlitres et transférer le filtre à un tube de microcentrifugeuse à faible liaison. Lavez ensuite la membrane filtrante deux fois avec 100 microlitres de solution S-Basel à 20 secondes de vortex par lavage et combinez les lavages avec le retentate d’origine pour un volume final d’échantillon de 500 microlitres.

Pour préparer les vésicules extracellulaires à la quantification par analyse cytométrique de flux, ajoutez 840 microlitres de solution S-Basel et 60 microlitres de vésicules extracellulaires purifiées à un tube de microcentrifugeuse. Ajouter 300 microlitres de l’échantillon dans deux tubes de microcentrifugeuses supplémentaires ainsi que sept microlitres d’une sonde potentiométrique appropriée par tube. Ajouter sept microlitres de 1%Triton X-100 au dernier tube et mélanger tous les tubes par vortex.

Placez une pointe de sonicator au centre du tube du troisième échantillon et pulsez l’échantillon 10 fois à 20% de puissance et un cycle de 30% de service. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution S-Basel à deux tubes de microcentrifugeuse de commande et ajoutez sept microlitres de sonde au tube de colorant seulement. Étiquetez le deuxième tube Buffer Only.

Puis incuber tous les tubes pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière avant leur analyse par cytométrie d’écoulement selon les protocoles standard. Pour analyser les données, ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse cytométrique de flux approprié. Réglez une porte rectangulaire commençant en haut de la parcelle s’étendant du niveau de dispersion de lumière de petit angle à un moment 10 aux deux à une fois 10 aux quatre et apportant la porte vers le bas jusqu’à ce qu’elle contienne environ 2.5% des événements totaux.

Nommez la porte d’après la sonde et copiez et coller la porte sur les deux autres parcelles d’échantillons et de données de contrôle. Exportez ensuite l’analyse vers une feuille de calcul. Ici, les résultats représentatifs de 10 répliques biologiques sont affichés.

La variabilité entre les répliques n’est pas significative et l’erreur standard typique de la moyenne de la taille de la population est d’un peu plus de 10 %Le transfert d’animaux entre les plaques entraîne une perte d’environ 10 % des animaux, tandis qu’environ 20 % des animaux sont perdus dans l’étape de flottaison du saccharose. En moyenne, 1000 jeunes animaux adultes de type sauvage sécrèteront un microgramme de protéines de plus de 10 kilodaltons dans leur environnement. Lorsque cette fraction est encore séparée par chromatographie d’exclusion de taille, le profil total d’élitution des protéines démontre un petit pic protéique entre deux et six millilitres et un grand pic après huit millilitres.

Les vésicules extracellulaires sont contenues dans les cinq premiers millilitres de la colonne élucider. Dans une comparaison directe des caractéristiques de cytométrie d’écoulement entre C.elegans et vésicules extracellulaires humaines, un histogramme des événements extracellulaires d’échantillon de vésicule de C.elegans, triés par la dispersion de lumière de petit angle, montre que toutes les préparations culmine à une intensité moyenne de fluorescence d’approximativement une fois 10 à la troisième. La sonde potentiométrique DI-8-ANEPPS, qui étiquette solidement les vésicules extracellulaires C.elegans et l’abondance de vésicules extracellulaires purifiées triées par l’expression DI-8-ANEPPS, n’est pas significativement différente entre les préparations dérivées du C.elegans et de la culture cellulaire.

Les échantillons préparés par cette procédure sont disponibles pour toutes les méthodes typiques d’analyse des vésicules extracellulaires en aval, y compris l’ARN-SEQ, la cytométrie du débit, l’analyse du suivi des nanoparticules et l’analyse protéomique. L’établissement de méthodes de purification des vésicules extracellulaires C.elegans permet aux chercheurs d’utiliser ce modèle d’invertébré simple pour étudier les voies génétiques et les processus physiologiques qui ont un impact sur la composition extracellulaire de la cargaison vésicule.