Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

Nos recherches portent sur la caractérisation des vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus et leur rôle dans les interactions parasite-hôte. Nous étudions l’absorption de la composition par les cellules dendritiques de l’hôte et l’influence potentielle sur l’immunomodulation. Nous avons démontré que les VE d’E. granulosus sont absorbées par les cellules dendritiques, influençant la maturation et la présentation de l’antigène. Nous identifions également des protéines immunomodulatrices et antigéniques clés dans la cargaison de VE, qui peuvent influencer les interactions parasite-hôte et les réponses immunitaires.

Notre protocole optimise la culture parasitaire in vitro pour une production accrue de petits VE, garantit un isolement de haute qualité et intègre des tests de cellules dendritiques pour étudier l’immunomodulation. Il peut être appliqué dans son ensemble ou en plusieurs parties. Nos recherches futures exploreront les effets in vivo des VE d’E. granulosus sur les réponses immunitaires, leur potentiel en tant que composants vaccinaux et leur impact sur les cellules dendritiques, les microphages et les modèles immunitaires de ces cellules.

[Narrateur] Pour commencer, nettoyez la surface ventrale de la souris euthanasiée atteinte de la maladie hydatique avec de l’alcool à 70 %. Ouvrez chirurgicalement la cavité péritonéale pour retirer les métacestodes développés à l’aide de ciseaux et de pinces. Ensuite, transférez les masses métacestodes dans une boîte de Pétri stérile à l’aide d’une pince. Retirez le tissu conjonctif à l’aide d’une pince, si nécessaire, pour libérer les kystes des masses métacestodes. Lavez les métacestodes obtenus avec du PBS supplémenté à quatre degrés Celsius. Maintenant, préparez le milieu de culture en utilisant tous les composants requis et mélangez doucement la solution par inversion. Transférez cinq millilitres du milieu de culture préparé dans chaque tube Leighton. Ajoutez les parasites dans le milieu de culture et incubez les tubes à 37 degrés Celsius pendant cinq jours sans changer de milieu. Prélevez le milieu de culture de parasites de chaque tube Leighton et transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le milieu collecté à 300 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Maintenant, centrifugez le surnageant à 2 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant obtenu dans un nouveau tube de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette. Centrifugez le tube à 10 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les petits débris cellulaires. À l’aide d’une pipette, transférez le surnageant dans un tube adapté au rotor de l’ultracentrifugeuse. Marquez un côté du tube avec un marqueur. Et placez le tube dans le rotor avec le côté marqué vers le haut. Centrifugez les tubes à 100 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius. Versez rapidement le surnageant et laissez reposer le tube à l’envers pendant une minute. Lavez la pastille avec au moins trois millilitres de PBS pour éliminer les protéines contaminantes. Remettez la pastille en suspension plusieurs fois à l’aide d’une pipette le long de toutes les faces du tube, en vous concentrant sur le côté marqué où la pastille est censée se trouver. Après avoir répété l’ultracentrifugation, remettre le granulé en suspension dans 30 microlitres de PBS. Transférez l’échantillon remis en suspension dans un tube de 1,5 millilitre et congelez les vésicules extracellulaires à moins 80 degrés Celsius pour le stockage. Vaporisez de l’éthanol la souris femelle CF-1 euthanasiée de cinq à huit semaines avant de la placer dans une hotte de culture tissulaire. Placez la souris sur une planche de dissection en position couchée. À l’aide d’une pince et de ciseaux de dissection, faites une incision verticale en T au-dessus de l’urètre et étendez-la horizontalement jusqu’au sommet des membres inférieurs. À l’aide d’une pince, séparez la peau le long des deux membres postérieurs pour exposer les os et les tissus des jambes. Avec les mains, retirez la peau de chaque jambe après avoir poussé de la cheville vers l’abdomen, en tirant la peau vers le côté opposé, laissant les deux jambes libres de peau. Maintenant, retirez soigneusement le fémur et le tibia à l’aide de ciseaux et de pinces, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de casse. Fixez l’extrémité de chaque os avec une pince. Et coupez les tendons pour enlever les fascias musculaires autour des os. Nettoyage complet du tissu musculaire avec des serviettes en papier. Placez chaque os retiré dans un tube stérile de 50 millilitres contenant deux millilitres de milieu RPMI complet supplémenté pour éliminer les débris. Après avoir jeté le milieu, lavez les os deux fois avec de l’éthanol à 70 % pendant cinq minutes à chaque fois. Transférez les os lavés dans une boîte de Pétri stérile et coupez les épiphyses des deux os à l’aide de ciseaux de dissection tranchants pour accéder aux cellules de la moelle osseuse. À l’aide d’une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 20 millilitres contenant un milieu complet, rincez soigneusement les cellules de la moelle osseuse de chacun des quatre os dans une boîte de Pétri stérile. Ensuite, homogénéisez doucement le milieu contenant la moelle éludée par pipetage pour éliminer le tissu conjonctif osseux et les morceaux cellulaires. Transférez l’échantillon dans un tube conique stérile de 50 millilitres, en faisant passer les cellules à travers une crépine stérile en polypropylène de 70 micromètres pour éliminer le tissu conjonctif et les débris osseux. Centrifugez les cellules à 450 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Retirez et jetez soigneusement le surnageant, en vous assurant que la pastille reste collée à la paroi du tube. Après avoir incubé les cellules pendant une minute à température ambiante, mettez-les en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse RBC et neutralisez le tampon de lyse avec trois millilitres de milieu complet. Centrifugez les cellules à 450 g pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu complet. Après avoir filtré l’échantillon comme indiqué, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajoutez 300 nanogrammes par millilitre de ligand tyrosine kinase trois lié à la FMS murine recombinante, ou FLT3L, au milieu de culture. Plaquez les cellules dans une plaque multipuits à une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Incuber les cellules pendant sept jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone. Le troisième jour, retirez un millilitre de milieu de chaque puits sans perturber les cellules, et remplacez-le par un millilitre de milieu complet frais préchauffé, complété par 150 nanogrammes par millilitre de souris recombinante FLT3L. Les vésicules extracellulaires, ou VE, purifiées à partir du stade larvaire d’Echinococcus granulosus étaient principalement de petites VE, d’une taille allant de 50 à 200 nanomètres, confirmées par la diffusion dynamique de la lumière et la microscopie électronique à transmission. Les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse ont montré une différenciation morphologique sur sept jours, passant de petites cellules hématopoïétiques rondes à des cellules en forme d’étoile avec des extensions cytoplasmiques. Après une heure d’incubation, les cellules dendritiques ont capturé de petits VE marqués par fluorescence, qui se sont co-localisés avec les molécules MHCIII dans les compartiments endosomal-lysosomaux, comme l’a confirmé la microscopie confocale.