Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh))RNA Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA Stable

Nous fournissons un protocole pour abattre de façon stable les gènes codant les protéines de matrice extracellulaire (ECM) dans les myoblastes C2C12 à l’aide d’ARN à épingle sh. Ciblant ADAMTSL2 à titre d’exemple, nous décrivons les méthodes de validation de l’efficacité de knockdown sur l’ARNm, la protéine et le niveau cellulaire pendant le myoblaste C2C12 à la différenciation myotube.

Ce protocole est significatif parce qu’il nous permet d’étudier la fonction des protéines, telles que les protéines matricielles extracellulaires, qui sont régulées à des stades ultérieurs de la formation ou de la maturation du myotube. Cette méthode peut être utilisée pour abattre n’importe quel gène d’intérêt pour les cellules C2C12 en utilisant des shARN spécifiques et les outils analytiques respectifs pour le phénotypage. Le principal avantage de cette méthode est que nous avons généré des cellules C2C12 qui peuvent supprimer continuellement nos gènes d’intérêt, même dans les myotubes matures.

L’aspect le plus important de cette procédure est de maintenir les cellules C2C12 dans l’état indifférencié, ce qui signifie à une faible densité cellulaire pendant la culture cellulaire de routine. La veille de la transfection, semer cinq fois 10 à la quatrième cellule C2C12 par millilitre en deux millilitres de DMEM complet par puits dans une plaque de six puits pour atteindre une confluence de 40 à 50 % après incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le lendemain matin, combinez 100 microlitres de chlorure de sodium de 25 millimlaires dans un tube de réaction de 1,5 millilitre par puits de culture avec 25,5 microlitres pei solution stock d’une culture cellulaire C2C12 indifférenciée pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, combinez trois microgrammes d’ADN plasmide avec 100 microlitres de chlorure de sodium de 25 millimlaires par culture bien pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius. À la fin des incubations, combinez l’ensemble du volume de chaque reagent dilué de l’Île-du-Prince-Édouard avec chaque solution plasmide diluée avec un tuyautage doux pour une incubation de 25 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, remplacer les supernatants des cultures cellulaires C2C12 par du DMEM sans antibiotiques ni sérum.

À la fin de l’incubation, ajouter tout le volume de chaque mélange de transfection à chaque puits en gouttelettes, tout en déplaçant continuellement le plat de culture cellulaire. Après six heures dans l’incubateur de culture cellulaire, remplacez le milieu de chaque puits par un DMEM complet. 24 heures après la transfection, remplacer le DMEM complet dans chaque puits par un milieu de sélection complété par cinq microgrammes par millilitre de puromycine, et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 10 à 14 jours ou jusqu’à ce que des cellules C2C12 stables soient observées.

Ensuite, étendre les cellules C2C12 résistantes à la puromycine dans les cultures à faible densité cellulaire en présence de cinq microgrammes par millilitre de puromycine, et cryopréserver six à dix flacons de cellules pour une utilisation future. Pour préparer les cellules C2C12 à la différenciation, semer 1,5 fois 10 à la cinquième cellule stable résistante à la puromycine C2C12 en un millilitre de milieu de sélection par puits dans une plaque de 12 puits, et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cultures soient confluentes à 95 %. Pour induire la différenciation, remplacez le milieu dans chaque puits par du DMEM sans sérum tous les deux jours suivant la formation de myotube sur un microscope à champ lumineux inversé équipé d’une caméra.

Pour l’immunostaining de chaîne lourde de myosine des cellules différenciées, graine cinq fois 10 à la quatrième cellule C2C12 puromycine-résistante dans 500 microlitres de DMEM complet par chambre sur une glissière de chambre de huit puits, et retournent les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent 95% de confluence, remplacer le milieu de sélection dans chaque puits par 500 microlitres de DMEM sans sérum. Aux points de temps expérimentaux appropriés, rincez les cellules différenciantes dans chaque puits trois fois avec 5 millilitres de PBS par lavage avant de fixer les cellules avec 200 microlitres de 4% de paraformaldéhyde dans PBS par puits.

Après 15 minutes, laver les cellules trois fois avec du PBS frais par lavage comme vient de le démontrer suivi de l’incubation avec 200 microlitres de glycine 5 molaires dans PBS par puits pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois avant de perméabiliser les cellules avec 200 microlitres de 1% de surfactant non ionique dans PBS pendant 10 minutes. Ensuite, bloquez les sites non spécifiques de liaison d’anticorps avec 200 microlitres de l’albumine de sérum 5% bovin dans PBS par puits pendant une heure suivie de trois lavages dans PBS.

Après le dernier lavage, étiquetez les cellules avec 200 microlitres d’anticorps à chaîne lourde de myosine pendant deux heures à température ambiante. Après trois lavages PBS, incuber les cellules avec l’anticorps secondaire approprié pendant deux heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. Après trois lavages finaux, aspirez le PBS, et montez les cellules avec une goutte de milieu de montage complétée par DAPI et un coverslip.

Observez ensuite chaque chambre au microscope à fluorescence à l’aide de l’ensemble de filtre approprié. Pour évaluer l’efficacité knockdown dans les cultures cellulaires par ballonnement occidental, première graine trois fois 10 à la cinquième puromycine résistante aux cellules C2C12 en deux millilitres de DMEM complet par puits dans une plaque de six puits. Après 24 heures, rincer les cultures avec PBS, et initier la différenciation des cellules avec deux millilitres de DMEM sans sérum comme démontré.

Pour l’analyse des protéines sécrétées aux points de temps expérimentaux appropriés, recueillir un millilitre de milieu conditionné sans sérum de chaque puits en tubes de réaction individuels de 1,5 millilitre pour centrifugation. Après centrifugation, transférer un millilitre des supernatants moyens conditionnés dans de nouveaux tubes de réaction de 1,5 millilitre, et précipiter les protéines avec 391 microlitres d’acide trichloroacetic dans le surfactant non ionique par tube. Après 30 secondes de vortex, incuber les mélanges sur la glace pendant 10 minutes.

À la fin de l’incubation, pelleter les protéines précipitées par centrifugation, et laver les granulés de protéines trois fois avec de l’acétone fraîche glacé et une centrifugation par lavage. Après le dernier lavage, séchez à l’air les granulés pendant trois à quatre minutes à température ambiante avant de les résuspension dans 50 microlitres de tampon échantillon SDS-PAGE par tube. Faites ensuite bouillir les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius avant l’analyse des taches occidentales selon les protocoles standard.

Pour l’analyse des protéines intracellulaires et membranaires, rincez la couche cellulaire dans chaque puits avec deux millilitres de PBS par puits, et utilisez un grattoir cellulaire pour déloger soigneusement les cellules en volumes d’un millilitre de PBS. Transférer les cellules dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour centrifugation suivie de trois lavages dans un millilitre de PBS par tube par lavage par centrifugation. Après le dernier lavage, resuspendez les granulés cellulaires dans 200 microlitres de tampon de lyse complétés par un réacgage de cocktail inhibiteur de la protéase sans EDTA pour une incubation de 30 minutes sur la glace.

À la fin de l’incubation, ultrasoniquer les échantillons pendant 15 secondes sur la glace avec un réglage de puissance de sortie de 10 à une fréquence de fonctionnement de 23 kilohertz, et enlever les débris cellulaires par centrifugation. Transférez les supernatants dans de nouveaux tubes de réaction de 1,5 millilitre et déterminez les concentrations de protéines selon les protocoles standard. Combinez 100 microgrammes de protéines avec un tampon d’échantillon SDS-PAGE 5X dans un volume total de 60 microlitres par échantillon, et faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Ensuite, analyser les échantillons par ballonnement occidental pour la présence de la protéine cible désirée. La sélection des cellules C2C12 résistantes à la puromycine peut être réalisée dans les 10 à 14 jours suivant la transfection en raison d’une élimination efficace des cellules non résistantes. En règle générale, plus de 80% des cellules C2C12 se détachent du plat de culture cellulaire pendant cette période et sont enlevées pendant l’entretien cellulaire de routine.

Les cellules C2C12 résistantes à la puromycine exprimant le contrôle ou l’ARN SHRNA ADAMTSL2 conservent leur morphologie cellulaire allongée en forme de fuseau à une faible densité cellulaire, ainsi que leur capacité à se différencier en myotubes. La différenciation C2C12 lors du retrait du sérum peut être surveillée par microscopie à champ lumineux et immunostaining pour la chaîne lourde de myotube marker myosin. Des myotubes lourds de chaîne-positifs sont observés entre trois et cinq jours après initiation de différenciation et sont multinucléated, comme observé par la présence de plus d’un noyau DAPI-positif dans les limites de cellules.

Comme le démontrent les données d’expression génétique dans les conditions de prolifération, l’efficacité de knockdown de la transfection est de 40 à 60% l’analyse occidentale de tache peut être exécutée pour confirmer le succès du knockdown dans les lysates de cellules obtenus, par exemple, des cellules C2C12 exprimant stably shRNA qui cible ADAMTSL2 comparé au contrôle shRNA exprimant des cellules. Assurez-vous de maintenir la concentration de puromycine pendant le processus de sélection suffisamment élevée pour éliminer toutes les cellules C2C12 non transfectées, ou les cellules non transfectées peuvent dépasser les cellules transfectées. Cet essai nous permet de déterminer la fonction des protéines de matrice extracellulaire qui sont exprimées plus tard dans le développement musculaire, même si elles sont induites cinq ou dix jours après la différenciation C2C12.

N’oubliez pas que le réavant-extraction de l’ARN et le bêta-mercaptoéthanol doivent être manipulés dans un capot de fumée et pour manipuler l’acide trichloroacetic selon les protocoles de sécurité appropriés. Merci d’avoir regardé, et bonne chance avec votre expérience.