Surveillance de l’assemblage eIF4F en mesurant l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes

La régulation de la signalisation du complexe eIF4F est associée à une traduction accrue des sous-ensembles d’ARNm impliqués dans la prolifération et la survie du cancer. Nous décrivons ici un test d’interaction protéine-protéine basé sur les cellules eIF4E-eIF4G qui nous permet d’évaluer la perturbation induite par les médicaments dans l’intégrité du complexe eIF4F dans les cellules vivantes. Il y a un intérêt croissant pour le développement de modalités qui ciblent efficacement l’interface protéine-protéine.

Nous avons imaginé que nos dosages PPI eIF4E-eIF4G contribueraient à favoriser ces stratégies et à les valider. Ce test fournira un schéma primaire optimal pour conduire à l’optimisation des inhibiteurs d’eIF4E-eIF4G. L’ensemencement correct de la cellule et l’exécution de la transfection de transfert sont les aspects les plus difficiles de ce produit, car ils peuvent avoir une incidence directe sur la suppression du système de déclaration des IPP.

Après la décongélation et le comptage des cellules, ensemencez des plaques de 6 puits avec des cellules HEK 293, en utilisant 2 millilitres de milieu de croissance standard par puits. Le matin du jour 2, pour chaque transfection planifiée, diluer 9 microlitres de solution à base de liposomes dans un tube contenant 125 microlitres de milieu sérique réduit sans rouge de phénol. Pendant que les liposomes dilués incubent à température ambiante pendant 5 minutes, préparez le mélange principal d’ADN en diluant 3 microgrammes de chaque plasmide dans 125 microlitres de milieu sérique réduit pour chaque tube de transfection.

Ajoutez 12 microlitres de réactifs d’amplification au DNA master mix 2, puis mélangez bien. Ajoutez immédiatement ce mélange à chaque tube de liposomes dilués dans un rapport de 1 à 1. Après avoir incubé ce complexe d’ADN lipidique pendant 15 minutes à température ambiante, ajoutez le complexe dans chaque puits des plaques à 6 puits.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le matin du 3e jour, rincez bien chacun avec 1 millilitre de PBS et ajoutez 0,3 millilitre de trypsine. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Après l’incubation, neutralisez la trypsine en ajoutant 2 millilitres dans chaque puits du milieu sérique réduit sans rouge de phénol. Transférez les cellules transfectées dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 290x G pendant 5 minutes.

Aspirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 millilitres de milieu sérique réduit. Ensemencez les cellules HEK 293 transfectées dans des plaques opaques à 96 puits, à une densité de 30 000 cellules par puits dans 90 microlitres de milieu. Pour obtenir 3 répétitions techniques pour 3 composés différents au sein d’une même expérience, amorcez 60 puits.

Excluez les puits sur les bords. Immédiatement après l’ensemencement des cellules transfectées, ajoutez 10 microlitres de solution composée à 10 % de DMSO dans chaque puits. Préparez des solutions mères composées de 1 millimolaire en dissolvant chaque composé d’intérêt dans du DMSO à 100 %.

Afin d’avoir 3 répétitions pour chaque titrage de composé, utilisez 8 microlitres de la solution mère de composé de 1 millimolaire. Effectuez une dilution en série en deux fois de chaque solution mère composée dans 8 puits d’une plaque de PCR à 96 puits en pipetant 4 microlitres de la matrice de 1 millimolaire dans 4 microlitres de 100 % de DMSO pour chaque point de titrage. Jetez les 4 microlitres en excès après le dernier point de la dilution en série en deux fois.

Ajoutez 36 microlitres d’eau stérile de qualité HPLC dans chaque tube pour préparer 40 microlitres de solutions de dilution en série composées 10x dans 10 % de DMSO. Préparez également un contrôle. Solution mère à 10 % DMS uniquement dans de l’eau stérile de qualité HPLC.

Ajoutez 10 microlitres de solutions de travail 10x aux cellules de la plaque opaque à 96 puits afin d’obtenir la concentration finale prévue, avec une concentration résiduelle de DMSO de 1 %Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 3 heures. Après 3 heures, commencez à préparer le réactif de substrat de luciférase en combinant 1 volume de substrat avec 19 volumes de réactif de dilution. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez immédiatement 25 microlitres de réactif de substrat à chaque puits de la plaque à 96 puits contenant les cellules.

Agitez la plaque sur un agitateur orbital à 350 tr/min, pendant 50 minutes à température ambiante. Pour évaluer la luminescence, placez la plaque sur un lecteur de plaques. Réglez le lecteur de miroir sur luminescence et le filtre d’émission sur 455.

Utilisez une hauteur de mesure de 6,5 millimètres avec un temps de mesure de 1 seconde. Pour évaluer la viabilité cellulaire, ajoutez 33 microlitres de réactif de test de viabilité dans chaque puits. Après 15 minutes à température ambiante, évaluez la luminescence avec le lecteur de plaques en réglant le lecteur miroir sur luminescence et le filtre d’émission sur 600.

Utilisez une hauteur de mesure de 6,5 millimètres et un temps de mesure de 1 seconde. Utilisez les données du lecteur de plaques pour déterminer la valeur IC 50 de chaque composé, en ajustant les données à l’équation de la courbe d’ajustement à 4 paramètres décrite dans le manuscrit. Les cellules HEK 293 ont été transfectées avec le système de complémentation eIF4E-eIF4G, puis retirées et traitées avec des inhibiteurs de mTOR.

Lorsque la luminescence a été évaluée 4 heures après le traitement, la PP242 et la rapamycine ont toutes deux produit une inhibition dose-dépendante du signal. Ni PP242 ni la rapamycine n’ont produit de diminution significative de la viabilité cellulaire, ce qui indique que la diminution de la luminescence dans le système de complémentation eIF4E-eIF4G n’est pas due à une mort cellulaire non spécifique, mais plutôt à une perturbation de l’interaction EIF4E-4G. L’analyse par transfert Western, suite à l’expérience de traction m7GTP, a montré que la perturbation médiée par 4EBP1 de l’interaction endogène eIF4E-eIF4G est corrélée avec le signal de dosage eIF4E-eIF4G mesuré.

PP242 était un inhibiteur plus puissant de la phosphorylation totale de 4EBP1 que la rapamycine. Les deux inhibiteurs ont montré un impact normal sur la signalisation mTOR, la rapamycine étant plus active contre les substrats de mTORC1 et PP242 ciblant à la fois mTORC1 et mTORC2. L’aspect le plus critique de ce produit est l’ensemencement des cellules le jour de la transaction, le réensemencement des cellules dans un milieu sans rouge de phénol, l’évaluation de la luminescence de l’essai de complémentation eIF4E-eIF4G et l’exécution de l’essai de viabilité sur la même plaque.

Un test de viabilité secondaire peut être effectué pour évaluer tout médicament ciblé et les effets spécifiques connus.