Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer les premières conséquences des mutations dans les facteurs d’initiation de la traduction sans interférence de l’ARNm nouvellement transcrit ou des problèmes d’efficacité de transfection souvent rencontrés lors des études sur les cellules eucaryotes. Ceci est accompli en synthétisant d’abord le type sauvage mutant et le contrôle, ou ARNm GFP à partir de plasmides correspondants. Ensuite, l’ARN synthétisé est micro-injecté dans les cytes XUS Lavis au stade six, et leur maturation est stimulée par la progestérone.

Ensuite, la maturation cytaire est évaluée par visualisation de la dégradation des vésicules germinales et certains des composants de la cascade de kinases MA dont l’activation dépend de l’expression de la protéine de mousse sont analysés par western blot. Enfin, la polyadénylation de l’ARNm de la mousse et d’autres ARNm nécessaires à la récupération de la myose des cytes XPO est étudiée. En fin de compte, la maturation cinétique des cytes.

Des analyses par transfert Western et par polyadénylation sont utilisées pour montrer un impact potentiel de l’expression des protéines lorsqu’un facteur d’initiation de la traduction est muté. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes ou à un système cellulaire reconstitué extrait à parts égales d’un germe ou d’un réticulocyte de lapin, est que les effets d’une mutation introduite dans un RM. NA sera rapidement observable et facilement étudié dans plusieurs levées xop. Cytes Plus généralement.

Ce modèle présente l’avantage de la simplicité avec ses cellules géantes uniques, et son utilisation conduit à une quantité considérable de matériel pour les expériences biochimiques. Ce processus est également rapide par rapport à la génération stable de lignées cellulaires. Ce miso peut aider à répondre à des questions clés en traductologie, par exemple pour mieux comprendre le rôle de domaines spécifiques de facteurs d’ation ou pour étudier l’épissage de ces facteurs.

Nous ajoutons d’abord l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu étudier l’impact d’un facteur d’initiation de traduction muté sur la synthèse des protéines sans interférence de la transcription. De cette façon, nous évitons les boucles de rétroaction potentielles entre ces deux mécanismes ome. En effet, les transcriptions de matériel sont stockées et mises.

La traduction peut être déclenchée avec de la progestérone Après avoir déféqué, xus lavos cytes et préparé CRN selon le protocole de texte, utilisez 10 vadrouilles et 6,6 % de formaldéhyde pour couler un gel AROS à 1,5 %. Préparez les échantillons dans un tube de 0,2 millilitre avec 8,8 % de formaldéhyde, 60 % pour l’AMIDE, des volumes de 0,1 de 10 x vadrouilles et un microlitre de CRNA, incubez à 70 degrés Celsius pendant trois minutes et placez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Centrifugez les échantillons à 5 000 fois G pendant quelques secondes avant d’ajouter deux microlitres de tampon de chargement de gel.

Faites fonctionner les échantillons à 90 volts pendant 20 minutes pour dédaigner le gel. Faites-le tremper dans de l’eau sans nucléases pendant la nuit. Ensuite, analysez-le pour vérifier la qualité de l’AIC.

Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la concentration de CNA et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius pour effectuer une micro-injection d’ARN. Utilisez un milieu ND 96 pour remplir une boîte de Pétri grattée une à deux heures après la défoliation. Disposez les cytes le long d’une allée grattée dans le plat.

Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette capillaire avec une pointe cassée placée à un angle de 45 degrés. Insérez l’embout capillaire à environ 150 à 200 microns de profondeur dans la zone équatoriale sous la zone animale pigmentée. Injectez 30 nanogrammes d’ARNc dans 60 nanolitres dans le premier ovocyte.

Attendez ensuite cinq à 10 secondes avant de retirer l’embout capillaire pour éviter que l’échantillon ne s’échappe. Pour injecter le cyte suivant Déplacez manuellement le plat. Transférez les cytes injectés dans des plaques de culture de 24 puits remplies de trois millilitres de milieu ND 96 et faites-les chauffer à 19 degrés Celsius pour déclencher la maturation mitotique.

Incuber les ovocytes en ND 96 avec deux microgrammes par millilitre de progestérone ou de PG à 19 degrés Celsius pendant 15 heures. Testez l’effet de traduction des ARNC EIF 4G one de type sauvage sur le phénotype mutant selon le protocole de texte. Déterminer l’étendue de la dégradation des vésicules germinales au microscope stéréoscopique.

Comptez le nombre de cytes matures après stimulation PG par la présence d’une tache blanche au pôle noir de l’animal. Répétez le comptage toutes les heures jusqu’à la 24e heure pour effectuer une analyse de sang occidentale. Utilisez les mouvements de va-et-vient d’une pointe de micro-pipette à quatre degrés Celsius pour homogénéiser 10 cytes dans 200 microlitres du tampon illustré ici.

Centrifugez les échantillons à 10 000 fois G pendant 15 minutes pour extraire la fraction cytoplasmique au milieu. Mettre en phase la fraction supérieure correspondant aux lipides et la partie inférieure aux débris cellulaires. Prélever la fraction cytoplasmique et stocker une aliquote pour déterminer la concentration en protéines.

Combinez le reste dans un rapport de un à un avec un tampon d’échantillon Lamely ou Biss avant d’exécuter la page SDS et le western blot. Selon le protocole de texte. Pour effectuer un test de polyventilation, placez cinq cytes par condition dans des tubes de micro-fuge de 1,5 millilitre avec un millilitre de XPBS sans nucléases pour laver les cytes.

Ensuite, sous la hotte, utilisez un kit d’extraction d’ARN selon les instructions du fabricant pour isoler l’ARN. Après avoir vérifié l’intégrité de l’ARN et déterminé la concentration, préparer deux mélanges de ligature par condition CRNA avec les réactifs suivants pour le premier mélange. Ajouter l’ARN des cytes non stimulés avec du pg et au deuxième mélange.

Ajouter l’ARN des ovocytes stimulés par le PG. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour inactiver l’enzyme à l’aide d’un kit de transcription inverse CD NA.

Pour chaque échantillon, préparez le mélange RT indiqué ici. Ajouter 10 microlitres de la réaction de ligature préalablement préparée et effectuer la RT selon les instructions du fabricant après avoir effectué la PCR, en utilisant le mélange et les conditions de réaction suivants à chaque réaction à quatre microlitres de tampon de charge et analyser 10 microlitres de chaque échantillon sur un gel agros à 3 % à 110 boulons. Enfin, analysez le gel au bout de 10 et 20 minutes pour observer un changement de taille reflétant la longueur de la queue polyA et donc la maturation de l’ARN, qui est un prérequis à leur traduction.

Comme le montre ici, la maturation cinétique des ovocytes micro-injectés dans des conditions de contrôle est similaire à celle du type sauvage, avec un nombre similaire de personnes subissant une GVBD 12 et 24 heures après la stimulation PG, 24 heures après la stimulation PG. Le pourcentage d’ovocytes atteignant la maturité est similaire pour les témoins de type sauvage ainsi que pour les témoins injectés dans l’eau et la GFP, ce qui indique que la micro-injection avec de l’eau ou un contrôle ou un ARNC EIF 4G a eu peu d’effet sur la micro-injection de myose ovocytaire avec le type EIF 4G négatif dominant, cependant, a entraîné une diminution spectaculaire de la GVBD même après stimulation PG. Cette figure montre que le défaut de maturation peut être restauré dans le CRNA de type sauvage à mesure que le rapport entre le type sauvage et le NACR négatif dominant EIF 4G augmente d’un CRNA.

Il en va de même pour le pourcentage de cytes qui subissent une maturation comme prévu. Aucune expression endogène de la mousse n’est détectée en l’absence de stimulation PG et la surexpression de l’EIF 4G : un négatif dominant a peu d’impact sur la mousse endogène, en accord avec les résultats précédents. De plus, Aurora AEEG two, qui agit en amont de l’induction de la mousse, ne montre aucun signe de dérégulation protéique ou de sa forme phosphorylée induite après stimulation PG.

À l’inverse, la phosphorylation d’irk two, qui est induite par la mousse, est inhibée en présence de la phosphorylation négative dominante EIF 4G. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas dépasser 120 nanolitres de CNA avec une concentration inférieure à certains nanogrammes Suite à cette procédure.

Bien que des méthodes telles que l’analyse du profilage des polysomes puissent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la définition de l’ARN qui pourrait être mal ou fortement traduit.