Name: Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse d'image informatisée pour quantifier précisément les métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein. Cette technique réduit les erreurs humaines et accélère les résultats.

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Ces travaux ont été soutenus par le Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine (IA), le Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science Center for Engineered Health (IA) et les National Institutes of Health R21EB028429 (IA).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech et conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L’exécution de ce protocole exige la permission des institutions appropriées et le respect de toutes les lignes directrices appropriées.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Faire des médias culturels complets (RPMI + 10% Sérum bovin fœtal +1% Pen Strep). Raviver les cellules 4T1 selon le protocole ATCC10 et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 dans un flacon T-25 jusqu’au confluent. Changez de média le lendemain de la relance pour éliminer les cellules mortes, et encore une fois si les médias sont dépensés avant que les cellules ne soient suffisamment confluentes pour passer.</li>
	<li>Une fois que le flacon T-25 est confluent, les cellules de passage à un flacon T-75 en jetant les médias, laver la fiole avec 5 mL de 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS), et l’ajout de 500 μL de Trypsin-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.<ol>
<li>Une fois détaché, ajouter 5 mL de culture complète réchauffée aux cellules. Aspirer et transférer les 5 mL dans un flacon T-75 contenant 15 mL de culture complète réchauffée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellules de passage dans les flacons T-75 au moins quatre fois. Faites ceci une fois que le flacon est confluent en lavant avec 8 mL de 1x DPBS, en ajoutant 1 mL de Trypsin-EDTA pour détacher les cellules, en ajoutant 10 mL de médias réchauffés aux cellules, et en diluant 1:6-1:8 dans un nouveau flacon T-75 contenant 20 mL de médias culturels complets réchauffés.</li>
	<li>Cellules de passage jusqu’au nombre approprié de flacons T-150 contenant 40 mL de médias de culture complète réchauffés pour le nombre de souris à injecter. La plupart des études nécessiteront plusieurs flacons T-150 pour assurer suffisamment de cellules pour l’injection.</li>
	<li>Lorsque les souris sont prêtes à être injectées (8 semaines ou pesant plus de 20 g, selon l’IACUC ou les protocoles institutionnels), récoltez les cellules en jetant les supports, en lavant chaque flacon avec 10 mL de DPBS 1x et en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA. Incuber de 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.</li>
	<li>Laver le flacon avec 10 mL de supports complets et transférer tout le contenu (10 mL de médias + 2 mL de mélange de cellules trypsine-EDTA) au flacon suivant. Continuez à laver et à recueillir les cellules de chaque flacon à l’aide des mêmes 10 mL de médias pour éviter d’utiliser une quantité excessive de médias.<ol>
<li>Une fois que tous les flacons ont été collectés, transférer le contenu dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Prélouillez un échantillon de 10 μL pour compter dans un tube de microcentrifugeuse et centrifugez le tube conique de 50 mL à 125 x g pendant 5 minutes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pendant que les cellules sont centrifugées, ajouter 10 μL de bleu Trypan à 10 μL d’échantillon cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois que le nombre total de cellules est déterminé, calculer la concentration de cellules nécessaires pour injecter des souris pour 1,2 x 106 cellules par souris (par 100 μL).</li>
	<li>Après centrifugation, décanter les médias et resuspendre les granulés cellulaires en quantité correcte de 1x DPBS stérile pour 1,2 x 106 cellules par 100 μL. Diviser le mélange cellule/DPBS en tubes de microcentrifugeuse pour faciliter l’accès avec la seringue lors de l’aspiration des cellules pour injection. Gardez les cellules sur la glace et injectez peu de temps après car les cellules commenceront à mourir après avoir été sur la glace pendant de longues périodes de temps.</li>
</ol>2. Injections
<ol><li>Préparer les cellules à l’injection en tapant ou en mélangeant doucement le tube de microcentrifugeuse pour résusquer les cellules, puis aspirer 600 μL dans une seringue de 1 mL. Tournez la seringue vers le haut et tirez le piston vers le bas pour éloigner les cellules de l’ouverture de la seringue. Appuyez sur la seringue pour la débarrasser des bulles d’air.</li>
	<li>Attachez l’aiguille et distribuez les cellules dans le tube de microcentrifugeuse jusqu’à ce qu’il ne reste que 500 μL dans la seringue. Mettre la seringue à plat sur la glace. REMARQUE : Les cellules 4T1 tombent rapidement de suspension. Par conséquent, il est important de mélanger les cellules de nouveau en suspension en tapant fréquemment.</li>
	<li>Anesthésier la souris BALB/c femelle de 8 semaines/>20 g à l’aide d’isoflurane ou d’un autre agent anesthésique approuvé. Surveillez la respiration de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie.</li>
	<li>Une fois que la souris est correctement anesthésiée comme indiqué par manque de réflexe cornéen, placez la souris sur son dos. À l’aide du pouce, du pointeur et du majeur, maintenez doucement la souris. Utilisez le pointeur et les doigts du milieu pour maintenir le haut du corps et le pouce de la souris pour sa jambe gauche arrière. Soyez doux mais ferme.</li>
	<li>Avec le biseau de l’aiguille vers le haut, injectez 100 μL des cellules sous-cutanéement dans la garniture mammaire abdominale gauche de graisse de la souris. Surveillez un bon saignement et toute fuite, et assurez-vous que la souris se réveille et se déplace facilement après l’injection.<ol>
<li>Changer les aiguilles entre chaque souris. REMARQUE : Ne laissez pas l’aiguille pénétrer dans la cavité péritonéale. Cela entraînerait une propagation rapide du cancer et ne serait pas représentatif du modèle. Pour assurer une injection sous-cutanée, tirez doucement vers le haut sur l’aiguille lorsqu’elle est insérée dans la graisse mammaire abdominale gauche. Si l’aiguille est facilement soulevée vers le haut, elle est correctement positionnée sous-cutanée.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Surveillance
<ol><li>Surveillez les souris au moins 3 fois par semaine pour le poids, le score de l’état corporel, la taille de la tumeur, l’état tumoral, la respiration, le niveau d’activité, l’apparence et le mouvement. Une fois que la tumeur atteint 0.7-0.8 cm de diamètre, commencez à surveiller quotidiennement.<ol>
<li>Considérez l’euthanasie quand la taille de tumeur atteint 1.5 cm, ou la perte de poids atteint 20%, ou le déclin clinique grave du score de condition corporelle, de l’état de tumeur, de la respiration, du niveau d’activité, de l’aspect, ou du mouvement sont observés basés sur des directives institutionnelles. NOTE : Le score de condition corporelle est crucial pour surveiller car le poids corporel peut augmenter pendant que la tumeur augmente dans la taille, négationnant la perte de condition corporelle due à la charge de maladie. Les protocoles de surveillance exacts dépendront des protocoles IACUC ou institutionnels approuvés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Nécropsie
<ol><li>Euthanasier la souris à l’aide de CO2 selon les directives institutionnelles.</li>
	<li>Vaporiser la souris de 70 % d’éthanol pour la désinfecter. Faire une incision jusqu’à la ligne médiane ventrale de la souris pour exposer la cavité du corps.</li>
	<li>Enlevez le rein. Continuez à couper la ligne médiane jusqu’à ce que le diaphragme soit visible. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme pour dégonfler les poumons. Coupez le diaphragme pour obtenir un meilleur accès à la cavité.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux contondants pour couper le centre de la cage thoracique. Pin cage thoracique en arrière pour exposer le poumon et le cœur.</li>
	<li>Perfuser le cœur avec 2 mL de 1x DPBS 1x stérile en insérant une aiguille dans l’apex du cœur jusqu’à ce qu’il se fonde dans la cavité abdominale où le rein a été enlevé.</li>
	<li>Pour enlever le cœur et les poumons, utilisez des ciseaux contondants pour couper l’œsophage et la trachée directement au-dessus du cœur. À l’aide de forceps, commencer à tirer le cœur loin du corps et couper à n’importe quel tissu conjonctif le garder attaché. Les poumons sortiront avec le coeur.</li>
	<li>Identifier les poumons multi lobés (droite) et mono lobés (gauche). Gardez le cœur attaché pour la référence, mais une fois que les poumons sont identifiés, couper le cœur loin.</li>
	<li>Étiquetez une plaque de 12 puits contenant 1x Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) dans chaque puits. Chaque souris a besoin de 2 puits. Placez le poumon multi lobé (droit) dans la plaque de 12 puits pour l’évaluation des métastases et continuez sur la glace. Gardez le puits voisin vide pour l’instant. REMARQUE : Il est important d’utiliser le même poumon (multi lobé) de chaque souris pour s’assurer que chaque échantillon est de taille proche. Le poumon mono lobé peut alors être utilisé pour d’autres analyses, comme l’histopathologie. REMARQUE : Les échantillons sont stables sur la glace ou à 4 °C pendant quelques heures.</li>
</ol>5. Traitement des tissus
REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile.
<ol><li>Étiquetez 1 tube conique de 15 mL par souris et ajoutez 2,5 mL de mélange de collagène de type IV et 30 unités d’élaslasase à chaque tube. Pour faire le mélange de collagène de type IV, dissoudre 2 mg de collagène de type IV par mL 1x HBSS et filtre stérile. Celui-ci peut être stocké jusqu’à 12 mois à -20 °C et décongelé en cas de besoin.</li>
	<li>Transférez le poumon au deuxième, nettoyez bien 1x HBSS pour cet échantillon. Tourbillonnez à l’aide de forceps pour enlever le reste du sang. Transférer le poumon propre dans une plaque de culture tissulaire vide de 3,5 cm. Hacher le poumon avec des ciseaux. Rincer la plaque avec 2,5 mL de 1x HBSS, transférer 1x HBSS et morceaux de poumon dans un tube conique de 15 mL contenant déjà du cocktail collagène/élasstase (5 mL au total).</li>
	<li>Incuber pendant 75 minutes à 4 °C. Continuez à mélanger les échantillons pendant ce temps, alors placez les tubes sur un rocker ou une roue rotative. Au cours de cette étape d’incubation, étiquetez les tubes de centrifugeuse de 50 mL et les plaques de culture tissulaire de 10 cm pour chaque souris. Si vous faites une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire de 10 cm pour les dilutions. REMARQUE : Étiquetez le couvercle des plaques de culture tissulaire. Si l’étiquetage de la plaque elle-même, l’écriture interférera avec l’analyse Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Porter le volume de chaque tube jusqu’à 10 mL au total avec 1x HBSS. Verser le contenu sur une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL pour chaque échantillon. Utilisez le piston d’une seringue de 1 mL pour moudre doucement l’échantillon à travers la passoire pour permettre à plus de cellules de filtrer à travers.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 5 minutes à 350 x g à température ambiante (RT). Jetez le supernatant et lavez la pastille avec 10 mL de 1x HBSS. Répétez cette étape deux fois.</li>
	<li>Resuspendez les granulés dans 10 mL de 60 μM 6TG multimédia de culture complet, soit RPMI ou IMDM. Échantillons de plaques dans des plaques de culture cellulaire de 10 cm, à l’aide d’un système de dilution si désiré. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 5 jours. REMARQUE : 1:2, 1:10 et 1:100 sont des dilutions courantes qui devront être déterminées empiriquement en fonction des paramètres de l’étude. ATTENTION: 6TG est toxique. Faire preuve de prudence lors de la manipulation et suivre toutes les directives en matière de santé et de sécurité environnementales pour l’élimination.</li>
</ol>6. Plaques de coloration
<ol><li>Verser les supports de culture des plaques dans un conteneur à déchets approprié. Fixer les cellules en ajoutant 5 mL de méthanol non dilué par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner le méthanol afin qu’il couvre toute la plaque. ATTENTION : Le méthanol est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou sur la peau. Utilisez une hotte de fumée pour cette étape.</li>
	<li>Verser le méthanol des plaques dans un contenant de déchets approprié. Rincer les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette et verser l’eau dans un récipient à déchets approprié. Ajouter 5 mL de 0,03% de bleu méthylène par plaque et incuber pendant 5 minutes à RT, en s’assurant de tourbillonner la solution bleu méthylène afin qu’il couvre toute la plaque.</li>
	<li>Verser le bleu méthylène dans un contenant de déchets approprié. Rincer à nouveau les assiettes avec 5 mL d’eau distillée par assiette. Retourner les assiettes à l’envers et éponger contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Déposer la plaque sur son couvercle et laisser sécher l’air toute la nuit à RT. REMARQUE : Les colonies métastatiques seront bleues. Une fois les assiettes séchées, elles peuvent être conservées à RT indéfiniment.</li>
</ol>7. Analyse d’image
<ol><li>Retirer les couvercles étiquetés des assiettes, en prenant soin d’assurer une identification claire des échantillons. Alignez toutes les plaques pulmonaires tachées sur une surface claire et propre pour prendre une photo de toutes les plaques en une seule image.</li>
	<li>Prenez une photo de la collection de plaques dans une zone bien éclairée, en vous assurant de minimiser les réflexions car les plaques sont très réfléchissantes. Les réflexions dans les plaques influenceront l’analyse d’image et doivent donc être évitées. REMARQUE: Fiji-ImageJ a une limite supérieure de 2 gigapixels. La plupart des téléphones intelligents modernes auront suffisamment de caméras. N’utilisez pas un appareil photo de moins de 8 mégapixels. L’appareil photo utilisé dans cette expérience était un 12,2 mégapixels sur un Pixel 2 de Google.</li>
	<li>Recadrer l’image pour inclure les plaques, mais exclure les couvercles ou toute autre chose à l’arrière-plan de l’image. Téléchargez l’image recadrée dans Fiji-ImageJ.</li>
	<li>Modifiez l’image en noir et blanc à l’aide des commandes suivantes : Image, Ajustement, Seuil de couleur, Méthode de seuil : Par défaut, Couleur seuil : B&W, Espace seuil : Laboratoire. Désélectionner la boîte de fond sombre. L’image doit maintenant être en noir et blanc. Le noir représente le fond clair, et le blanc représente les colonies métastatiques bleues.</li>
	<li>À l’aide de l’outil Cercle sur la barre d’outils Fidji-ImageJ, sélectionnez la zone à analyser. Dessinez un cercle à utiliser pour toutes les plaques pour vous assurer que chaque plaque est analysée pour la même taille. Choisissez une taille qui maximise la surface analysée sur les plaques tout en minimisant le bruit de fond qui apparaît sur le bord des plaques. La taille apparaît dans la barre d’outils au fur et à mesure qu’elle est dessinée, il est donc possible de faire un cercle parfait en surveillant la hauteur et la largeur au fur et à mesure que le cercle est dessiné.</li>
	<li>Analyser le cercle sélectionné pour déterminer quel pourcentage de la zone est blanc, ce qui représente la zone de la plaque qui a des colonies métastatiques bleues. Utilisez les commandes suivantes : Analyser, analyser les particules, taille (pixel2):0-Infinity, Circularité: 0.00-1.00, Afficher: Rien, et coché la case Résumé. Frappe bien.</li>
	<li>Enregistrez le résultat de la zone en %. C’est le pourcentage de la zone sélectionnée qui est blanc, et représente donc le fardeau métastatique. REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer les résultats dans Fiji-ImageJ ou de copier/coller l’intégralité de la page de résultats dans un document distinct. Si les résultats de la zone % sont inattendus ou suspects, il est alors possible de voir si l’une des autres mesures était également suspecte ou si % Area a été enregistré de manière incorrecte.</li>
	<li>Déplacez le cercle, sans altérer sa taille en le saisissant en son centre, vers la plaque suivante de l’image. Répétez les étapes 7.6 et 7.7 pour toutes les plaques de l’image.</li>
	<li>Répétez les étapes 7.1 – 7.8 sur au moins deux images supplémentaires. Une fois que toutes les plaques et images ont été analysées, la moyenne des résultats de zone en % entre les différentes images pour chaque plaque afin d’atténuer les incohérences entre les images.</li>
</ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Facts+%26+Figures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Cancer+Society%22%5BJournal%5D)">Cancer Facts & Figures.</a> American Cancer Society. , (2019).</li>
<li>Yousefi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastasis+of+breast+cancer%3A+molecular+and+cellular+mechanisms+underlying+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis.</a> Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (2018).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20.22 (2001).</li>
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<li>Valkonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+detection+from+whole+slide+images+using+local+features+and+random+forests%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Metastasis detection from whole slide images using local features and random forests.</a> Cytometry A. 91 (6), 555-565 (2017).</li>
<li>Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., Allen, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+VNP20009+and+VNP20009+with+restored+chemotaxis+on+4T1+mouse+mammary+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression.</a> Oncotarget. 8 (20), 33601-33613 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>ATCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.C.C.+4T1+%28ATCC+CRL2539%29+Product+Sheet%5BTitle%5D)+AND+%22ATCC%22%5BJournal%5D)">A.T.C.C. 4T1 (ATCC CRL2539) Product Sheet.</a> ATCC. , (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme démontré, compter manuellement les colonies métastatiques sur chaque plaque pulmonaire peut être une méthode inexacte et imprécise pour quantifier les métastases pulmonaires, démontrant la nécessité d’un meilleur moyen de quantification (figure 2). L’analyse histopathologique différait légèrement du comptage manuel et de l’analyse Fiji-ImageJ(figure 2B et 4D),probablement parce que les diapositives H&E ne sont pas un échantillon représenta...

Une femme sur huit recevra un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie, et pourtant, malgré de multiples options de traitement, le cancer du sein est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmesaméricaines 1. Ces femmes ne meurent pas de la tumeur primaire dans leur sein. Au lieu de cela, la charge métastatique est responsable de la mortalité de cette maladie car elle se propage généralement au poumon, à l’os, au cerveau, au foie, et aux ganglions lymphatiques2. Pour cette raison, les modèles de cancer du sein doivent évaluer les métastases pour contribuer à réduire la mortalité de cette maladie. Le modèle 4T1 murine cancer du sein est un protocole superbe pour y parvenir. La méthode décrite ici offre une amélioration du modèle 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ pour quantifier la métastase pulmonaire, produisant des résultats cohérents et rapides.
Le modèle 4T1 est bien établi, la plupart des laboratoires utilisant des protocoles tels que ceux décrits par Pulaski et Ostrand-Rosenberg en 20013. La lignée cellulaire 4T1 est résistante à la 6-Thioguanine (6TG) et représentative du stade IV, triple cancer du seinnégatif 3,4,5. Il est cliniquement pertinent car il est un modèle orthotopique et métastase spontanément aux mêmes organes que dans le cancer du seinhumain 3,4. Les cellules 4T1 métastasent spontanément à un rythme prévisible basé sur la quantité de cellules injectées3,4. Fait important, les différences génétiques entre les souris utilisées ici ont causé la variabilité inter-individuelle prévue dans la charge métastatique. Pour évaluer la métastase, les tissus sont récoltés pour recueillir et quantifier les cellules cancéreuses dans des sites éloignés à l’aide de la sélection 6TG et de la coloration bleue du méthylène. Le résultat est une collection de plaques de culture tissulaire avec des points bleus représentant des colonies métastatiques. Cependant, le protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg quantifie les colonies métastatiques en les comptant manuellement, et c’est donc le moyen standard d’évaluer les métastases dans ce modèle. Bien que cela soit facile pour les tissus à faible charge métastatique, les tissus comme les poumons sont souvent chargés de métastases. Comme les plaques pulmonaires peuvent être très confluentes, la quantification précise et précise des colonies métastatiques par comptage manuel est difficile et sujette à l’erreur humaine. Pour mieux quantifier le fardeau métastatique, nous décrivons l’utilisation de Fiji-ImageJ pour une solution informatique à l’erreur de comptage humain. L’analyse histopathologique avec la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) est un autre moyen de quantifier les métastases pulmonaires, et il est intéressant de l’améliorer avec le logiciel Fiji-ImageJ6,7. Cependant, parce que l’analyse histopathologique observe une seule tranche du poumon, elle peut être inexacte et non représentative. C’est parce que le modèle 4T1 provoque plusieurs lésions métastatiques dans tout l’organe qui ne sont pas réparties uniformément. Alors que les tendances globales entre l’analyse histopathologique et le comptage manuelpeuvent être similaires 8, les valeurs individuelles peuvent différer et donc l’analyse histopathologique ne doit pas être utilisée comme seul moyen de quantification. Nous démontrons l’avantage par rapport à l’analyse histopathologique et aux incohérences dans le comptage manuel entre les différents compteurs, tout en démontrant la cohérence de l’utilisation de Fiji-ImageJ. En outre, nous montrons que cette méthode peut réduire le temps d’incubation de 10-14 jours à 5 jours, ce qui signifie que les chercheurs peuvent analyser les données de leur étude beaucoup plus tôt que lorsqu’ils s’appuient sur le comptage manuel.
Cette méthode est une collection d’ajustements simples au protocole Pulaski et Ostrand-Rosenberg3. Parce que le modèle 4T1 est largement utilisé, et parce que la métastase pulmonaire est un paramètre critique à mesurer dans les modèles précliniques, nous croyons que cette méthode peut être largement utilisée et est très précieuse pour les chercheurs sur le cancer du sein. Les seules fournitures supplémentaires nécessaires sont une caméra et l’accès à un ordinateur avec Fiji-ImageJ, un logiciel libre fréquemment utilisé dans l’analyse d’images9. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la métastase pulmonaire, mais elle pourrait être utilisée pour d’autres tissus avec une charge métastatique significative.

<table><tbody><tr><td>Chambre d’anesthésie</td><td>Voir les commentaires</td><td>Voir les commentaires</td><td>Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement</td></tr><tr><td>Agent anesthésique</td><td>Voir les commentaires</td><td>Voir</td><td>les commentaires Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement</td></tr><tr><td>BALB/c Souris femelles</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Blunt</td><td>Roboz</td><td>RS-6700</td><td></td></tr><tr><td>Calculatrice</td><td>N’importe</td><td>quel Appareil</td><td></td></tr><tr><td>photo</td><td>N’importe Quel</td><td></td><td>Minimum de 8 mégapixels</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>N’importe quel</td><td></td><td>Doit être capable d’une configuration d’euthanasie de 125 x g et 300 x g</td></tr> de <tr><td>CO2</td><td>Voir les commentaires Voir</td><td>les commentaires</td><td>Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement</td></tr><tr><td>Chambre froide, réfrigérateur, entrepôt frigorifique</td><td>N’importe N’importe quoi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur avec Fiji-ImageJ</td><td>N’importe quel</td><td>Doit</td><td>être capable de fonctionner Fidji-ImageJ Chambre de</td></tr><tr><td>comptage</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux courbes</td><td>Roboz</td><td>RS-5859</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée</td><td>N’importe</td><td>quel Élastase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals</td><td>100617</td><td></td></tr><tr><td>Balance électronique</td><td>N’importe quel N’importe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>R& D Systems</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Voir les commentaires Voir</td><td>les commentaires</td><td>Doit être capable de 5 % de CO2 et 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03978-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>Épingles ou aiguilles</td><td>N’importe</td><td>quel</td><td>Pour immobiliser les souris lors d’une nécropsie</td></tr><tr><td>Étriers en plastique</td><td>VWR</td><td>25729-670</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 Moyen</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Bascule ou roue rotative</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux tranchants</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Filtre jetable stérile avec membrane PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>568-0010</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Bécher triangulaire en plastique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-111F</td><td>Utilisé pour peser les souris</td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire de 3,5 cm</td><td>Nunclon</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL microtubes à centrifuger</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Plaques de culture tissulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>1X Saline tamponnée au phhostphate de Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>1X Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3026802</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1/2 po aiguilles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>4T1 (ATCC&reg ; CRL&timide ; 2539&commerce ;)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube à centrifuger</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>6-Thioguanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4882</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; Filtre à cellules M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Diluer à 70 % avec de l’eau DI</td></tr></tbody></table>

utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4t1 du cancer du sein

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Le cancer du sein est une malignité dévastatrice, représentant 40 000 décès de femmes et 30 % des nouveaux diagnostics de cancer féminin aux États-Unis pour la seule année 2019. La principale cause de décès liés au cancer du sein est la charge métastatique. Par conséquent, les modèles précliniques pour le cancer du sein doivent analyser le fardeau métastatique pour être médicalement pertinents. Le modèle de cancer du sein 4T1 fournit un modèle de souris spontanément métastasante et quantifiable pour le cancer du sein humain de stade IV. Cependant, la plupart des protocoles 4T1 quantifient la charge métastatique en comptant manuellement les colonies tachées sur les plaques de culture tissulaire. Bien que cela soit suffisant pour les tissus ayant une charge métastatique inférieure, l’erreur humaine dans le comptage manuel provoque des résultats incohérents et variables lorsque les plaques sont confluentes et difficiles à compter. Cette méthode offre une solution informatique à l’erreur de comptage humain. Ici, nous évaluons le protocole à l’aide du poumon, un tissu hautement métastatique dans le modèle 4T1. Des images de plaques tachées de méthylène sont acquises et téléchargées pour analyse dans Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ détermine ensuite le pourcentage de la zone sélectionnée de l’image bleue, représentant le pourcentage de la plaque avec charge métastatique. Cette approche informatisée offre des résultats plus cohérents et rapides que le comptage manuel ou l’évaluation histopathologique pour les tissus hautement métastatiques. La cohérence des résultats fiji-imagej dépend de la qualité de l’image. De légères variations de résultats entre les images peuvent se produire, il est donc recommandé que plusieurs images soient prises et que les résultats soient en moyenne. Malgré ses limites minimales, cette méthode est une amélioration de la quantification du fardeau métastatique dans le poumon en offrant des résultats cohérents et rapides.

Cette méthode contient des ajustements simples du protocole4T1 3 de Pulaski et Ostrand-Rosenberg et peut être visualisée dans la figure 1. Lorsque 3 chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques pour 12 plaques pulmonaires (dilution de 1:10), les résultats étaient très incohérents entre les différents compteurs (figure 2A). Tous les chercheurs ont été dirigés pour « compter les colonies métastatiques qui apparais...

Nous décrivons une méthode plus cohérente et expéditieuse pour quantifier la métastase pulmonaire dans le modèle de cancer du sein 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ.

Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

Ce protocole quantifie la métastase pulmonaire, qui est une cause agressive et commune de décès lié au cancer du sein, avec une précision et une efficacité accrues dans un modèle préclinique de cancer du sein. Par rapport à la technique originale, ce protocole donne aux chercheurs des résultats plus rapides et plus cohérents. Il atténue les erreurs de comptage humain grâce à une technologie informatique facile à utiliser.Cette technique peut absolument être étendue à la recherche préclinique étudiant les effets des thérapies de cancer du sein sur la métastase de poumon en permettant aux chercheurs de démontrer le fardeau métastatique diminué suivant le traitement réussi. Commencez par étiqueter un tube conique de 15 millilitres pour l’échantillon de tissu. Ajouter ensuite 2,5 millilitres de type quatre mélange de collagène et 30 unités d’élaslasase au tube.Déplacez le poumon vers un puits 1X HBSS propre et faites-le tourbillonner avec des forceps pour enlever tout sang restant, puis transférez-le à une plaque vide de culture tissulaire de 3,5 centimètres. Hacher le poumon avec des ciseaux, puis rincer l’assiette avec 2,5 millilitres de HBSS et transférer le HBSS avec les morceaux de poumon dans un tube conique préparé de 15 millilitres avec le cocktail de collagène et d’élasstase. Incuber le tube pendant 75 minutes à quatre degrés Celsius sur un rocker ou une roue rotative.Pendant ce temps, étiquetez un tube de centrifugeuse de 50 millilitres et une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres pour chaque souris. Si vous faites une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire pour les dilutions. Amener le volume du tube jusqu’à 10 millilitres avec 1X HBSS, puis verser le contenu sur une passoire cellulaire de 70 micromètres dans le tube conique de 50 millilitres.Utilisez le piston d’une seringue d’un millilitre pour moudre doucement l’échantillon à travers la passoire. Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 350 fois G et jeter le supernatant, puis laver la pastille deux fois avec 10 millilitres de 1X HBSS. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de 60 micromolaires 6-thioguanine médias de culture complète, et plaquez les échantillons dans les plaques de culture cellulaire de 10 centimètres en utilisant un schéma de dilution si désiré.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq jours. Verser les supports de culture des plaques dans le conteneur à déchets approprié. Pour fixer les cellules, ajouter cinq millilitres de méthanol non dilué à chaque plaque et incuber pendant cinq minutes à température ambiante, en s’assurant de tourbillonner le méthanol afin qu’il couvre toute la plaque.Verser le méthanol des assiettes dans le contenant de déchets approprié, puis rincer chaque assiette avec cinq millilitres d’eau distillée. Ajoutez cinq millilitres de bleu méthylène à 0,03 % par plaque et incubez-le pendant cinq minutes à température ambiante, en vous assurant de faire tourbillonner la solution bleu méthylène de sorte qu’elle couvre toute la plaque. Verser le bleu méthylène dans le contenant de déchets approprié et rincer chaque assiette à nouveau avec cinq millilitres d’eau distillée.Retournez la plaque à l’envers et épongez-la contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Placez la plaque sur son couvercle et laissez-la sécher à l’air libre pendant la nuit. Les colonies métastatiques seront bleues.Une fois les plaques séchées, elles peuvent être conservées indéfiniment à température ambiante. Retirez les couvercles étiquetés des plaques, en prenant soin d’assurer une identification claire des échantillons. Alignez toutes les plaques pulmonaires tachées sur une surface propre et légère.Prenez une photo de la collection de plaques dans un endroit bien éclairé, en vous assurant de minimiser les reflets. Les réflexions dans les plaques influenceront l’analyse d’image et devraient être évitées. Portez une attention particulière aux photos prises et prenez plusieurs photos sous plusieurs angles.Après avoir photographié les plaques, recadrer l’image pour exclure les couvercles ou quoi que ce soit en arrière-plan. Ouvrez l’image dans Fiji ImageJ et changez-la en noir et blanc en cliquant sur l’image, ajustez et colorez le seuil. Sélectionnez ensuite par défaut pour la méthode de seuil, noir et blanc pour la couleur de seuil, et laboratoire pour l’espace de couleur.Assurez-vous que la boîte de fond sombre n’est pas sélectionnée. L’image doit maintenant être en noir et blanc. Le noir représente le fond clair, et le blanc représente les colonies métastatiques bleues.Utilisez l’outil cercle pour sélectionner la zone à analyser. Dessinez un cercle à utiliser pour toutes les plaques pour vous assurer que chaque plaque est analysée pour la même zone de taille. Choisissez une taille qui maximise la zone analysée sur les plaques tout en minimisant le bruit de fond qui apparaît sur le bord des plaques.La taille apparaît dans la barre d’outils au fur et à mesure qu’elle est dessinée. Analyser le cercle sélectionné pour déterminer le pourcentage de zone blanche. Cliquez sur analyser et analyser les particules, puis sélectionnez zéro à l’infini pour la taille, zéro à un pour la circularité, et rien pour le spectacle.Cochez la case résumée et frappez bien. Déplacez le cercle vers la plaque suivante dans l’image en l’saisissant au centre et répétez l’analyse. Copiez et coller le résultat dans une feuille de calcul.La zone en pourcentage, qui est le pourcentage de la zone sélectionnée qui est blanche, représente le fardeau métastatique. Une fois que toutes les plaques et images ont été analysées, la moyenne des résultats de la zone pour cent entre les différentes images pour chaque plaque pour atténuer les incohérences entre les images. Fidji ImageJ analyse a été comparée au comptage manuel et l’analyse histopathologique.Lorsque trois chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques, les résultats étaient incohérents entre les compteurs. Les résultats de Fiji ImageJ étaient cohérents entre les compteurs pour chacune des trois images. Les résultats des trois images et des trois compteurs ont été combinés pour chaque plaque pulmonaire.Les résultats ont été en moyenne pour chaque plaque pour tenir compte des variations entre les images, ce qui a fourni des résultats cohérents entre les compteurs. Lors du classement des plaques de la plupart à la moins métastatique, le comptage manuel s’est mis d’accord sur la plaque la plus confluente, mais tous les rangs suivants étaient incohérents. Les rangs des résultats moyens de Fiji ImageJ étaient beaucoup plus cohérents entre les compteurs.Pour démontrer l’importance d’éviter les réflexions dans les images, une image avec le reflet d’une main et son analyse ultérieure fiji ImageJ est montré avec une image de la même plaque sans réflexion. Les imperfections foncées d’une surface de fond sale ou d’un résidu d’échantillon de sang sur les plaques peuvent également avoir un impact négatif sur l’analyse d’ImageJ fidjienne. Cette plaque sanguine n’a que deux colonies métastatiques, mais le résidu sombre a amené Fiji ImageJ à la considérer comme métastatique à 31,6 %.Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas d’examiner attentivement les images pour la réflexion, utilisez le même cercle de taille pour chaque plaque de l’image, et la moyenne des résultats pour chaque plaque entre au moins trois images distinctes.

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Recherche sur le cancer

Ce protocole décrit l'utilisation quantitative PCR en temps réel (QRT-PCR) pour détecter l'ARNm spécifique de cellules tumorales représentant métastase dans le tissu pulmonaire de souris.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Un modèle de tumeur primaire du cancer du sein orthotopique et l'ablation chirurgicale de la tumeur primitive pour prolonger la vie de la souris pour générer des métastases spontanées sont décrites. La croissance et la progression tumorale sont surveillés et quantifiés par imagerie par fluorescence luciférase.

Un modèle de souris orthotopique du sein spontané Cancer Métastase

Nous décrivons ici le modèle et l’approche pour étudier les fonctions des macrophages alvéolaires pulmonaires dans les métastases cancéreuses. Pour démontrer le rôle de ces cellules dans les métastases, le modèle syngénique (4T1) du cancer du sein en conjonction avec la déplétion du macrophage alvéolaire avec des liposomes clodronates a été utilisé.

L&#39;étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

Les auteurs décrivent un protocole précliniques in vivo suivi des métastases cancéreuses. Il est issu d’un reporter de radionucléide-fluorescence combinant le sodium iodure symport, détecté par non invasive [18F] tétrafluoroborate-PET et une protéine fluorescente simplifiée ex vivo de confirmation. La méthode est applicable pour précliniques in vivo la cellule de suivi au-delà de biologie tumorale.

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose tomographie par émission de positons et la tomodensitométrie (18F-FDG TEP/CT) d’imagerie pour mesurer la réponse métabolique de tumeur à la thérapie ciblée MLN0128 dans un  Kras/Lkb1 souris mutante modèle de cancer du poumon et couplée d’imagerie à haute résolution ex vivo autoradiographie et histologie quantitative.

Utilisant l’imagerie 18F-FDG TEP/CT et histologie Quantitative pour mesurer des changements dynamiques dans le métabolisme du Glucose dans des modèles murins de cancer du poumon

Ce travail préséque un protocole avancé pour évaluer avec précision la charge tumorale par la détection de protéines fluorescentes vertes et de signaux de bioluminescence ainsi que l’intégration de la technique quantitative de détection moléculaire.

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Découvrez une méthode d'analyse d'image informatisée pour quantifier précisément les métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein. Cette technique réduit les erreurs humaines et accélère les résultats.

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Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein

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