Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Il est difficile d’évaluer la fonction de sarcomere dans les cardiomyocytes cellule-dérivés de tige pluripotent dus à leur sarcomere sous-développé et désorganisé. En utilisant des protéines sarcomères marquées par fluorescence, nous pouvons maintenant accéder au raccourcissement des sarcomères. Nous pouvons visualiser les sarcomères et évaluer leur fonction in vitro à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches et de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

En utilisant la transduction à base d’AAV, nous pouvons étendre la méthode à toutes les cellules souches pluripotentes induites dérivées du patient. Cette méthode peut être étendue au développement de la thérapie de cardiomyopathie, car elle peut être employée pour évaluer directement le dysfonctionnement sarcomère lié à la maladie in vitro. Cette méthode est utile dans le domaine de la cardiologie, y compris l’étude de cardiologie pédiatrique.

Cependant, il peut également être appliqué à l’étude du dysfonctionnement des muscles squelettiques, tels que la myopathie. Le jour moins quatre de l’induction de différenciation, enrobez une plaque de six puits de 0,5 microgramme par centimètre carré de laminine-511 E8 diluée dans du PBS pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Vers la fin de l’incubation, traiter les cellules souches pluripotentes d’origine humaine avec de la trypsine recombinante pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.

Lorsque les cellules se sont détachées, récolter des cellules à moyen complété avec 10% FBS pour compter, et ressusciter les cellules à un 1.25 fois 10 à la cinquième cellules par deux millilitres de milieu AK02N complété avec la laminine-511 E8 et inhibiteur rock après centrifugation. Ensuite, aspirez la solution de revêtement de chaque puits de la plaque de six puits et ensemencez deux millilitres de cellules dans chaque puits. Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.

Après quatre jours, les cellules atteignent 80% de confluence. Remplacer le surnageant dans chaque puits par deux millilitres de RPMI plus B27 sans milieu insulinique complété par un inhibiteur de GSK-3 par puits pour induire la différenciation. Après deux jours de différenciation, remplacez doucement le milieu par deux millilitres de RPMI plus B27 sans milieu insulinique complété par un inhibiteur de porc-épic par puits.

Les cellules devraient avoir atteint 100% de confluence. Le quatrième jour de différenciation, remplacez doucement les surnageants par deux millilitres de RPMI plus B27 sans insuline par puits. Les cellules doivent rester à une densité élevée, et certaines peuvent avoir commencé à flotter.

Le jour sept et neuf de la différentiation, remplacez le surnageant dans chaque puits par deux millilitres de RPMI plus B27 avec de l’insuline complétée avec de la puromycine pour la culture pluripotente dérivée de cellules souches sélectives de cardiomyocyte. À ce stade, les cellules battantes doivent être observées dans les cultures. Pour mettre en place une culture de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs, utilisez d’abord du ruban adhésif pour enlever toute poussière de la surface d’un tampon PDMS sur mesure, puis plongez brièvement le tampon dans de l’éthanol à 70%.

Utilisez un duster à air pour éliminer l’éthanol de la surface d’estampage et traitez la surface avec cinq à 10 microlitres de polymère MPC à 0,5% et d’éthanol. Lorsque le polymère a complètement séché, placez le tampon sur une lamelle de couverture en polymère dans une parabole d’imagerie de 35 millimètres et placez un poids sur le tampon. Après 10 minutes, utilisez un microscope optique pour confirmer que le motif a été transféré sur la lame de couverture, et lavez la vaisselle et la lamelle deux fois avec du PBS.

Après le deuxième lavage, enrobez la lame de couverture de 0,5 à un microgramme par centimètre carré de laminine-511 E8 diluée dans de la gélatine à 0,1% pour une incubation de deux à quatre heures à température ambiante. Le jour 10 de la différenciation, laver les cellules deux fois avec du PBS, suivi d’un traitement avec un millilitre de trypsine recombinante par puits pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après le comptage, resuspend les cellules à un 2.5 à cinq fois 10 aux cinquièmes cellules par millilitre de RPMI plus B27 avec l’insuline complétée avec la concentration de puromycine, et ensemencez un millilitre de cellules sur la plaque pour une incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, remplacez le surnageant par du RPMI frais plus B27 avec de l’insuline complétée par de la puromycine, et retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire, rafraîchissant le milieu deux à trois fois par semaine jusqu’aux jours 21 à 28 pour l’imagerie. Pour l’imagerie en accéléré du raccourcissement des sarcomères dans les cultures PCCSM, appliquez de l’huile sur la lentille 100 fois objective d’un microscope confocal fluorescent et sélectionnez des conditions d’imagerie en direct dans le logiciel associé. Pour obtenir de bonnes données représentatives, sélectionnez la fréquence d’images la plus élevée, réglez l’obturateur sur ouvrir et appliquez un binning quatre par quatre dans un recadrage de la zone d’acquisition pour obtenir les intervalles les plus courts entre les images pendant l’imagerie time-lapse.

Si le taux de battement des cellules est faible, évoquez les cellules par stimulation du champ électrique et commencez l’enregistrement en accéléré, en prenant soin que le champ cétré reste au point pendant l’imagerie. À la fin de la période d’imagerie, enregistrez les images time-lapse dans un dossier approprié. Pour analyser les images time-lapse, ouvrez une série d’images time-lapse dans ImageJ et ajustez la luminosité et le contraste des images jusqu’à ce que le motif sarcomere puisse être clairement observé.

Dans le menu Autres outils, sélectionnez SarcOptiM et appuyez sur Ctrl Maj P et le bouton d’un micron dans la barre d’outils pour utiliser les instructions pour calibrer le programme. Tracez ensuite une ligne sur la région du sarcomère à utiliser pour mesurer le raccourcissement du sarcomère, puis cliquez sur AVI monocellulaire pour commencer l’analyse du raccourcissement du sarcomère. L’imagerie en accéléré des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes marqués et à motifs sarcomères peut être utilisée pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à différents moments.

Pour surmonter la désorganisation sarcomère généralement observée dans les cultures de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs, des timbres PDMS spécifiques peuvent être utilisés pour la culture de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs dans un motif de bande, ce qui favorise une forme de cellule allongée et un modèle de sarcomère plus organisé par rapport aux cellules cultivées dans une zone sans motif. Les cultures à motifs favorisent également une meilleure contraction cellulaire et fournissent un profil de longueur sarcomère lisse par rapport aux cellules cultivées non à motifs. les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes de modèle AAV-transduced expriment des signaux sarcomériques de GFP le long des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes modelés dès trois jours post-transduction et peuvent également être utilisés pour mesurer des profils de contraction sarcomere.

De plus, l’ajout d’un gène résistant à la blasticidine au cours de la transduction peut également être utilisé pour faciliter la sélection de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs à une pureté de plus de 90% Pour faciliter une analyse d’image plus facile et de meilleure qualité, il est essentiel d’identifier une zone avec des sarcomères qui se déplacent linéairement et d’obtenir des images à la fréquence d’images la plus élevée. En utilisant cette méthode, nous pouvons évaluer le rôle de la maturation dans les protéines de sarcome pour étudier le dysfonctionnement sarcomère dans le cardiomyocyte de laboratoire dérivé des cellules iPS spécifiques à la maladie et dérivées du patient.