Name: Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez le raccourcissement des sarcomères dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l'aide de protéines marquées par fluorescence. Cette méthode permet d'évaluer la fonction sarcomérique in vitro pour la recherche cardiaque.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire de la Division de médecine régénérative de l’Université médicale de Jichi pour la discussion utile et l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par les subventions de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED; JP18bm0704012 et JP20bm0804018), la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS; JP19KK0219), et la Japanese Circulation Society (la subvention pour la recherche fondamentale) à H.U.

<ol><li>Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Cardiovascular+Diseases+and+Risk+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors.</a> Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).</li>
<li>Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy: an overview.</a> American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).</li>
<li>Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Cardiac+Disease+Mechanisms+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%3A+Progress%2C+Promises+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).</li>
<li>Lan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+calcium+handling+properties+underlie+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+pathology+in+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Gramlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense-mediated+exon+skipping%3A+a+therapeutic+strategy+for+titin-based+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunctions+Contribute+to+Hypertrophic+Cardiomyopathy+in+Patient+iPSC-Derived+Cardiomyocytes+with+MT-RNR2+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).</li>
<li>Cho, G. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Transplantation+Confers+Maturation+of+PSC-Derived+Cardiomyocytes+Conducive+to+Modeling+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy.</a> Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tri-iodo-l-thyronine+promotes+the+maturation+of+human+cardiomyocytes-derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Imaging+Method+to+Assay+the+Contractile+Mechanical+Output+of+Micropatterned+Human+iPSC-Derived+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes.</a> Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).</li>
<li>Sewanan, L. R., Campbell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+sarcomeric+cardiomyopathies+with+human+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).</li>
<li>Kopljar, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+drug-induced+effects+on+contractile+motion+properties+and+cardiac+biomarkers+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Gene+Tagging+of+Transcriptionally+Silent+Genes+in+hiPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).</li>
<li>Chanthra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Fluorescent+Reporter+System+Identifies+Laminin-511%2F521+as+Potent+Regulators+of+Cardiomyocyte+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation.</a> Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).</li>
<li>Ribeiro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cardiomyocyte+show+of+force%3A+A+fluorescent+alpha-actinin+reporter+line+sheds+light+on+human+cardiomyocyte+contractility+versus+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).</li>
<li>Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Proliferation+of+Monolayer+Cultures+of+Embryonic+Stem+%28ES%29+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Following+Acute+Loss+of+Retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma.</a> PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).</li>
<li>Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).</li>
<li>Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte-specific+gene+expression+following+systemic+injection+of+AAV%3A+in+vivo+gene+delivery+follows+a+Poisson+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution.</a> Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Arakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+evolution+by+hypermutation+and+selection+in+the+B+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40.</a> Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).</li>
<li>Konno, A., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+whole+brain+transduction+by+systemic+infusion+of+minimally+purified+AAV-PHP.eB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB.</a> Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).</li>
<li>Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzai%2C+T+%22Methods+of+Molecular+Biology%22">Methods of Molecular Biology</a>. Yoshida, Y., et al. , (2020).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brief+Review+of+Current+Maturation+Methods+for+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).</li>
<li>Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact-GFP+alters+F-actin+organization%2C+cellular+morphology+and+biophysical+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).</li>
<li>Sparrow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Myofilament-Localized+Calcium+Dynamics+in+Adult+Cardiomyocytes+and+the+Effect+of+Hypertrophic+Cardiomyopathy+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations.</a> Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).</li>
</ol>

H.U. a déposé un brevet lié à ce manuscrit.

Psc-CMs ont un grand potentiel pour être utilisé comme une plate-forme in vitro pour modéliser les maladies cardiaques et pour tester les effets des médicaments. Néanmoins, il faut d’abord établir une méthode précise et unifiée d’évaluation des fonctions des GC-CFP. La plupart des tests fonctionnels fonctionnent avec PSC-CMs, par exemple, électrophysiologie, calcium transitoire, et métabolisme26, et l’une des premières études psc-cm patient-dérivées était au sujet du syndrome long-QT<sup ...

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde1 et la cardiomyopathie représente la troisième cause de décès liés au cœur2. La cardiomyopathie est un groupe collectif de maladies qui affectent les muscles cardiaques. Les développements récents des cellules souches pluripotentes induites (iPS) et la différenciation dirigée des cellules iPS vers les cardiomyocytes (PSC-CMs) ont ouvert la porte à l’étude des cardiomyocytes avec le génome du patient comme modèle in vitro de cardiomyopathie. Ces cellules peuvent être utilisées pour comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques, pour élucider leurs mécanismes moléculaires, et pour tester différents candidats thérapeutiques3. Il y a une énorme quantité d’intérêt, ainsi, des cellules iPS dérivées du patient ont été générées (par exemple, cardiomyopathie hypertrophique [HCM]4,5,cardiomyopathie ventriculaire droite arythmogène [ARVC]6,cardiomyopathie dilaté [DCM]7,et cardiomyopathies liées aux mitochondries8,9). Puisque l’une des caractéristiques de la cardiomyopathie est le dysfonctionnement et la perturbation des sarcomères, un outil valide qui mesure uniformément la fonction sarcomere est nécessaire.
Le raccourcissement des sarcomères est la technique la plus largement utilisée pour évaluer la fonction des sarcomères et la contractilité des cardiomyocytes adultes dérivés de modèles animaux et d’humains. Pour effectuer le raccourcissement sarcomère, des sarcomères bien développés qui sont visibles sous contraste de phase sont nécessaires. Cependant, psc-CMs cultivé in vitro montrent des sarcomères sous-développés et désorganisés et, par conséquent, ne peuvent pas être utilisés pour mesurer correctement sarcomere raccourcissement10. Cette difficulté à évaluer correctement la contractilité des PSC-GC entrave leur utilisation comme plate-forme pour évaluer les fonctions cardiaques in vitro. Pour évaluer indirectement la contractilité psc-CMs, la microscopie à force atomique, les réseaux de micro-poteaux, la microscopie de force de traction et les mesures d’impédance ont été utilisés pour mesurer les effets du mouvement exercé par ces cellules sur leur environnement11,12,13. Des enregistrements de microscopie vidéo plus sophistiqués et moins invasifs du mouvement cellulaire réel (par exemple, SI8000 de SONY) peuvent être utilisés pour évaluer alternativement leur contractilité, cependant, cette méthode ne mesure pas directement le mouvement sarcomère ou la cinétique de génération de force14.
Pour mesurer directement le mouvement des sarcomères dans les GC-PSC, de nouvelles approches, telles que le marquage fluorescent de la protéine sarcomère, émergent. Par exemple, Lifeact est utilisé pour étiqueter l’actine filamenteuse (F-actine) pour mesurer le mouvement sarcomère15,16. Les cellules iPS génétiquement modifiées sont une autre option pour marquer les protéines sarcomères (par exemple, α-actinine [ACTN2] et myométsine-2 [MYOM2]) par la protéine fluorescente17,18,19.
Dans cet article, nous décrivons comment effectuer l’imagerie time-lapse pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à l’aide de Myom2-TagRFP (cellules souches embryonnaires [ES] de souris) et d’ACTN2-mCherry (cellules iPS humaines). Nous montrons également qu’une culture à motifs facilite l’alignement des sarcomères. En outre, nous décrivons une méthode alternative de étiquetage sarcomere, utilisant les virus adeno-associés (AAVs), qui peuvent être largement appliqués aux cellules patient-dérivées d’iPS.

<table><tbody><tr><td>1-Thioglycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145-25</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol (55mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Polymère de 2-méthacryloyloxyéthylphosphorylcholine (MPC),</td><td>NOF Corp.</td><td>LIPIDURE-CM5206</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique d’imagerie 35 mm avec lamelle en polymère (&micro ;-Dish 35 mm, high)</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>AAVproR Helper Free System (AAV6) (vecteurs ; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)</td><td>Takara</td><td>6651</td><td></td></tr><tr><td>ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs</td><td>N.A.</td><td></td><td>Nous avons inséré une casette résistante à IRES-puromycine à 3' UTR du locus TNNT2 et mCherry autour du codon stop d’ACTN2 dans la ligne hiPSC 610B1, en suivant une méthode décrite ailleurs (Anzai, Methods Mol Biol, in press)</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), sans sérum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, moins insuline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50X), moins Vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (25 U/&micro ; L)</td> <td>Merck Millipore</td><td>70746</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de blasticidine S</td><td>Fujifilm wako</td><td>029-18701</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4, Humain, Recombinant,</td> <td>R & D Systems, Inc.</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-100g</td><td></td></tr><tr><td>C59, Wnt Antagonist (WntC59)</td><td>abcam</td><td>ab142216</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de dessin CAO,</td> <td>Robert McNeel and Associates, WA, USA</td> Unité d’ultrafiltration centrifuge <td>Rhinoceros 6.0</td><td></td></tr><tr><td>(100k MWCO), Vivaspin-20</td><td>Sartorius</td><td>VS2042</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chromium etcant</td><td>Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japon</td><td>Masque au chrome N14B</td><td></td></tr><tr><td>recouvert de AZP1350</td><td>Clean Surface Technology Co., Japon</td><td>CBL2506Bu-AZP</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL de glycogène, 3 M d’acétate de sodium (pH 5,2))Takara</td><td></td> <td>9094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) - glycémie élevée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) - glycémie élevée, sans pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (99.5)</td><td>Fujifilm wako</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Moregate</td><td>59301104</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10, Humain, Recombinant,</td> <td>R& D Systems, Inc.</td><td>345-FG-025</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes (basique), humain, recombinant</td><td>Fujifilm wako</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc</td><td>en poudre Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100g</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154-500</td><td></td></tr><tr><td>PLAQUES DE CULTURE À FOND DE VERRE</td><td>MatTek</td><td>P24G-1.5-13-F/H</td><td></td></tr><tr><td>Ham& rsquo ; s F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-062</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Dulbecco modifié d’Iscove (IMDM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-061</td><td></td></tr><tr><td>L-alanine-L-glutamine (supplément GlutaMAX, 200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de l’acide L(+)-ascorbique</td><td>Fujifilm</td><td>wako 196-01252</td><td></td></tr><tr><td>Fragment de laminine-511 E8 ( LN511-E8, iMatrix-511)</td><td>Nippi</td><td>892012</td><td></td></tr><tr><td>Aligneur de masque</td><td>Union Optical Co., Ltd., Japon</td><td>PEM-800</td><td></td></tr><tr><td>Outil de lithographie sans masque</td><td>NanoSystem Solutions, Inc., Japon</td><td>D-Light DL-1000</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0,45 & micro ; m, PVDF (0,45-&micro ; m filtre)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>Myom2-RFP (SMM18)</td><td>N.A.</td><td></td><td>Développé dans notre article précédent (Chanthra, Sci Rep, 2020)</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 Caméra numérique CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006-10</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sansei medical co. Ltd</td><td>01-004</td><td></td></tr><tr><td>Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (25:24:1)</td><td>Nippon Gene</td><td>311-90151</td><td></td></tr><tr><td>Élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corp., MI, USA</td><td>SILPOT 184</td><td></td></tr><tr><td>polyéthylénimine MAX (MW. 40 000)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Développeur photosensible positif</td><td>Tokyo Ohka Kogyo Co. , Ltd., Japon</td><td>NMD-3</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Takara</td><td>9034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de puromycine</td><td>Fujifilm wako</td><td>166-23153</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Humain/Souris/Rat Activine A Protéine R</td><td>& D Systems, Inc.</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>Protéase recombinante de type trypsine (rTrypsine ; Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Plaquette de silicium</td><td>Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japon</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Mikasa Co., Ltd., Japon</td><td>MS-A100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie confocale spininng</td><td>Oxford Instruments</td><td>Andor Dragonfly Spinning Disk System</td><td></td></tr><tr><td>StemSure LIF, souris, recombinant, solution (10^6U)</td><td>Fujifilm wako</td><td>195-16053</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3010</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA</td><td>SU-8 3010</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 développeur</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, États-Unis</td><td>SU-8 développeur</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Nippon Gene</td><td>314-90021</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-A165 (VEGF), humain, recombinant</td><td>Fujifilm wako</td><td>226-01781</td><td></td></tr></tbody></table>

raccourcissement de sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC-MC) peuvent être produits à partir de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites (ES/iPS). Ces cellules fournissent des sources prometteuses pour la modélisation des maladies cardiaques. Pour les cardiomyopathies, le raccourcissement des sarcomères est l’une des évaluations physiologiques standard qui sont utilisées avec les cardiomyocytes adultes pour examiner leurs phénotypes de la maladie. Cependant, les méthodes disponibles ne sont pas appropriées pour évaluer la contractilité de PSC-CMs, car ces cellules ont des sarcomères sous-développés qui sont invisibles sous la microscopie à contraste de phase. Pour résoudre ce problème et pour effectuer le raccourcissement des sarcomères avec psc-CMs, des protéines sarcomères marquées par fluorescence et une imagerie vivante fluorescente ont été utilisées. Les lignes Z minces et une ligne M résident aux deux extrémités et au centre d’un sarcomere, respectivement. Les protéines de la lignée Z — α-actinine (ACTN2), téléthonine (TCAP) et protéine LIM associée à l’actine (PDLIM3) — et une protéine de la lignée M — myomésine-2 (Myom2) — ont été marquées avec des protéines fluorescentes. Ces protéines marquées peuvent être exprimées à partir d’allèles endogènes sous forme de knock-ins ou de virus adéno-associés (AAV). Ici, nous présentons les méthodes permettant de différencier les cellules souches pluripotentes de souris et d’humains en cardiomyocytes, de produire des AAV et d’effectuer et d’analyser l’imagerie en direct. Nous décrivons également les méthodes pour produire des timbres de polydimethylsiloxane (PDMS) pour une culture modelée de PSC-CMs, qui facilite l’analyse du rapetissement de sarcomere avec des protéines fluorescent-marquées. Pour évaluer le raccourcissement sarcomere, des images de time-lapse des cellules battantes ont été enregistrées à un framerate élevé (50-100 images par seconde) sous la stimulation électrique (0.5-1 hertz). Pour analyser la longueur des sarcomères au cours de la contraction cellulaire, les images time-lapse enregistrées ont été soumises à SarcOptiM, un plug-in pour ImageJ/Fiji. Notre stratégie fournit une plate-forme simple pour étudier les phénotypes des maladies cardiaques dans psc-CMs.

Mesure du raccourcissement sarcomère à l’aide de lignes de rapporteur PSC-CMs knock-in. Des PSC-CMs sarcomere-marqués ont été utilisés pour mesurer le rapetissement sarcomere. Les lignes expriment Myom2-RFP et ACTN2-mCherry à partir de loci endogènes. TagRFP a été inséré dans Myom2, codant des protéines M qui se localisent à la ligne M, tandis que mCherry a été frappé à ACTN2, codant α-Actinine, qui se localise à la ligne Z18...

Cette méthode peut être utilisée pour examiner le raccourcissement des sarcomères à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes avec des protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Il est difficile d’évaluer la fonction de sarcomere dans les cardiomyocytes cellule-dérivés de tige pluripotent dus à leur sarcomere sous-développé et désorganisé. En utilisant des protéines sarcomères marquées par fluorescence, nous pouvons maintenant accéder au raccourcissement des sarcomères. Nous pouvons visualiser les sarcomères et évaluer leur fonction in vitro à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches et de protéines sarcomères marquées par fluorescence.En utilisant la transduction à base d’AAV, nous pouvons étendre la méthode à toutes les cellules souches pluripotentes induites dérivées du patient. Cette méthode peut être étendue au développement de la thérapie de cardiomyopathie, car elle peut être employée pour évaluer directement le dysfonctionnement sarcomère lié à la maladie in vitro. Cette méthode est utile dans le domaine de la cardiologie, y compris l’étude de cardiologie pédiatrique.Cependant, il peut également être appliqué à l’étude du dysfonctionnement des muscles squelettiques, tels que la myopathie. Le jour moins quatre de l’induction de différenciation, enrobez une plaque de six puits de 0,5 microgramme par centimètre carré de laminine-511 E8 diluée dans du PBS pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Vers la fin de l’incubation, traiter les cellules souches pluripotentes d’origine humaine avec de la trypsine recombinante pendant trois minutes à 37 degrés Celsius.Lorsque les cellules se sont détachées, récolter des cellules à moyen complété avec 10% FBS pour compter, et ressusciter les cellules à un 1.25 fois 10 à la cinquième cellules par deux millilitres de milieu AK02N complété avec la laminine-511 E8 et inhibiteur rock après centrifugation. Ensuite, aspirez la solution de revêtement de chaque puits de la plaque de six puits et ensemencez deux millilitres de cellules dans chaque puits. Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.Après quatre jours, les cellules atteignent 80% de confluence. Remplacer le surnageant dans chaque puits par deux millilitres de RPMI plus B27 sans milieu insulinique complété par un inhibiteur de GSK-3 par puits pour induire la différenciation. Après deux jours de différenciation, remplacez doucement le milieu par deux millilitres de RPMI plus B27 sans milieu insulinique complété par un inhibiteur de porc-épic par puits.Les cellules devraient avoir atteint 100% de confluence. Le quatrième jour de différenciation, remplacez doucement les surnageants par deux millilitres de RPMI plus B27 sans insuline par puits. Les cellules doivent rester à une densité élevée, et certaines peuvent avoir commencé à flotter.Le jour sept et neuf de la différentiation, remplacez le surnageant dans chaque puits par deux millilitres de RPMI plus B27 avec de l’insuline complétée avec de la puromycine pour la culture pluripotente dérivée de cellules souches sélectives de cardiomyocyte. À ce stade, les cellules battantes doivent être observées dans les cultures. Pour mettre en place une culture de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs, utilisez d’abord du ruban adhésif pour enlever toute poussière de la surface d’un tampon PDMS sur mesure, puis plongez brièvement le tampon dans de l’éthanol à 70%.Utilisez un duster à air pour éliminer l’éthanol de la surface d’estampage et traitez la surface avec cinq à 10 microlitres de polymère MPC à 0,5% et d’éthanol. Lorsque le polymère a complètement séché, placez le tampon sur une lamelle de couverture en polymère dans une parabole d’imagerie de 35 millimètres et placez un poids sur le tampon. Après 10 minutes, utilisez un microscope optique pour confirmer que le motif a été transféré sur la lame de couverture, et lavez la vaisselle et la lamelle deux fois avec du PBS.Après le deuxième lavage, enrobez la lame de couverture de 0,5 à un microgramme par centimètre carré de laminine-511 E8 diluée dans de la gélatine à 0,1% pour une incubation de deux à quatre heures à température ambiante. Le jour 10 de la différenciation, laver les cellules deux fois avec du PBS, suivi d’un traitement avec un millilitre de trypsine recombinante par puits pendant trois à cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après le comptage, resuspend les cellules à un 2.5 à cinq fois 10 aux cinquièmes cellules par millilitre de RPMI plus B27 avec l’insuline complétée avec la concentration de puromycine, et ensemencez un millilitre de cellules sur la plaque pour une incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain matin, remplacez le surnageant par du RPMI frais plus B27 avec de l’insuline complétée par de la puromycine, et retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire, rafraîchissant le milieu deux à trois fois par semaine jusqu’aux jours 21 à 28 pour l’imagerie. Pour l’imagerie en accéléré du raccourcissement des sarcomères dans les cultures PCCSM, appliquez de l’huile sur la lentille 100 fois objective d’un microscope confocal fluorescent et sélectionnez des conditions d’imagerie en direct dans le logiciel associé. Pour obtenir de bonnes données représentatives, sélectionnez la fréquence d’images la plus élevée, réglez l’obturateur sur ouvrir et appliquez un binning quatre par quatre dans un recadrage de la zone d’acquisition pour obtenir les intervalles les plus courts entre les images pendant l’imagerie time-lapse.Si le taux de battement des cellules est faible, évoquez les cellules par stimulation du champ électrique et commencez l’enregistrement en accéléré, en prenant soin que le champ cétré reste au point pendant l’imagerie. À la fin de la période d’imagerie, enregistrez les images time-lapse dans un dossier approprié. Pour analyser les images time-lapse, ouvrez une série d’images time-lapse dans ImageJ et ajustez la luminosité et le contraste des images jusqu’à ce que le motif sarcomere puisse être clairement observé.Dans le menu Autres outils, sélectionnez SarcOptiM et appuyez sur Ctrl Maj P et le bouton d’un micron dans la barre d’outils pour utiliser les instructions pour calibrer le programme. Tracez ensuite une ligne sur la région du sarcomère à utiliser pour mesurer le raccourcissement du sarcomère, puis cliquez sur AVI monocellulaire pour commencer l’analyse du raccourcissement du sarcomère. L’imagerie en accéléré des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes marqués et à motifs sarcomères peut être utilisée pour mesurer le raccourcissement des sarcomères à différents moments.Pour surmonter la désorganisation sarcomère généralement observée dans les cultures de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs, des timbres PDMS spécifiques peuvent être utilisés pour la culture de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs dans un motif de bande, ce qui favorise une forme de cellule allongée et un modèle de sarcomère plus organisé par rapport aux cellules cultivées dans une zone sans motif. Les cultures à motifs favorisent également une meilleure contraction cellulaire et fournissent un profil de longueur sarcomère lisse par rapport aux cellules cultivées non à motifs. les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes de modèle AAV-transduced expriment des signaux sarcomériques de GFP le long des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes modelés dès trois jours post-transduction et peuvent également être utilisés pour mesurer des profils de contraction sarcomere.De plus, l’ajout d’un gène résistant à la blasticidine au cours de la transduction peut également être utilisé pour faciliter la sélection de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à motifs à une pureté de plus de 90% Pour faciliter une analyse d’image plus facile et de meilleure qualité, il est essentiel d’identifier une zone avec des sarcomères qui se déplacent linéairement et d’obtenir des images à la fréquence d’images la plus élevée. En utilisant cette méthode, nous pouvons évaluer le rôle de la maturation dans les protéines de sarcome pour étudier le dysfonctionnement sarcomère dans le cardiomyocyte de laboratoire dérivé des cellules iPS spécifiques à la maladie et dérivées du patient.

sarcomere-shortening-pluripotent-stem-cell-derived-cardiomyocytes

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Les mutations qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales bénéficient de l’investigation in vivo de la structure cardiaque au cours du développement, mais les études structurelles à haute résolution dans le cœur embryonnaire de souris sont techniquement difficiles. Nous présentons ici une méthode robuste d’immunofluorescence et d’analyse d’images pour évaluer les structures spécifiques aux cardiomyocytes dans le cœur de souris en développement.

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca2 + réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Nous présentons une méthode pour image optiquement les potentiels d’action, plus précisément dans les cardiomyocytes de cellules souches dérivées ventriculaire comme pluripotentes induites. La méthode est basée sur l’expression pilotée par le promoteur d’une protéine fluorescente sensibles au voltage.

Enregistrements de potentiel d’Action optique sous-type spécifique dans l’homme induit pluripotentes cellules souches dérivées des Cardiomyocytes ventriculaires

La formation d’un réseau de sarcomère approprié est importante pour la maturation des cardiomyocytes dérivés d’iPSC. Nous présentons une approche super résolution qui permet l’évaluation quantitative de la maturation structurelle des cardiomyocytes dérivés de cellules souches, afin d’améliorer les conditions de culture favorisant le développement cardiaque.

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ici, une méthode établie est décrite pour effectuer des mesures de contractilité et de calcium dans des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’une plate-forme optique. Cette plateforme permet aux chercheurs d’étudier l’effet des mutations et la réponse à divers stimuli de manière rapide et reproductible.

Mesures en temps réel des paramètres de calcium et de contractilité dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Découvrez le raccourcissement des sarcomères dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l'aide de protéines marquées par fluorescence. Cette méthode permet d'évaluer la fonction sarcomérique in vitro pour la recherche cardiaque.

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence. (Vidéo) | JoVE Journal

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Explorer plus de vidéos