Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

Nous présentons un guide complet sur la préparation des échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie synchrotron en série à la ligne de faisceau Diamond I24.

La cristallographie synchrotron en série, ou SSX, est un domaine relativement nouveau et en développement rapide de MX.Il est très bien adapté aux expériences à faible dose et à température ambiante, mais peut-être plus important encore, il est vraiment bien adapté au suivi de la dynamique. Cela permet de réaliser des films en stop-motion de protéines en action. Chez I24, plusieurs modes de SSX sont disponibles.

Ce protocole se concentre sur SSX à cible fixe, ce qui permet un large éventail d’expériences en série utilisant des quantités limitées d’échantillons. Les puces de silicium peuvent être endommagées lors du chargement et du nettoyage, si vous ne les connaissez pas. En outre, le protocole d’alignement des puces est complètement nouveau pour de nombreux cristallographes, et le traitement des données est légèrement différent de vos données de rotation standard.

Pour préparer un porte-copeaux, coupez deux feuilles de feuille de polyester en carrés d’environ 6 x 6 centimètres et placez les feuilles sur les deux plaques de base. À l’aide de bagues d’étanchéité en métal, fixez les feuilles en place, puis tirez soigneusement sur l’excès de papier d’aluminium pour éliminer les plis. Ensuite, sélectionnez une puce de silicium avec des ouvertures de taille appropriée par rapport à la taille des cristaux à analyser.

Glow décharge la puce pendant 25 secondes à 0,39 millibar, avec un courant de 15 milliampères. Utilisez une pince à épiler pour placer la puce de silicium sur l’étage de chargement de la puce, avec les barres surélevées vers le bas. Ensuite, à l’aide d’une pipette, appliquez 200 microlitres de la boue de microcristal sur le côté plat de la puce, en étalant la boue pour couvrir tous les pâtés de maisons de la puce.

Si la puce est endommagée, couvrez les trous avec un petit morceau de feuille de polyester pour vous assurer qu’un vide uniforme peut être appliqué. Ensuite, appliquez un vide doux pour aspirer tout l’excès de liquide à travers la puce. Retirez la puce de l’étape de chargement de la puce et épongez soigneusement le dessous de la puce avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide.

Placez la puce chargée sur la plus grande moitié du porte-puce entre les marques de guidage, côté plat vers le bas. Placez la petite moitié du porte-puce sur la puce pour la sceller. Les deux moitiés du porte-puce doivent s’enclencher.

Ensuite, à l’aide de boulons hexagonaux, fixez la puce solidement en place. Pour aligner la puce, maintenez le support de puce à un angle de 30 degrés tout en approchant du support. Utilisez ensuite les supports cinématiques pour placer la puce chargée sur l’étage XYZ à la ligne de faisceau.

Lorsque les aimants entrent en contact, laissez le porte-puce tourner parallèlement au flux et cliquez en place. Une fois la puce placée, utilisez le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau et l’interface utilisateur graphique d’alignement de la puce pour localiser la fiduciale supérieure gauche de la puce. Pour vous centrer sur la fiduciale 0 dans X, Y et Z, déplacez-vous vers l’intérieur et la sortie de la mise au point pour aligner Z, de haut en bas pour aligner Y, et à gauche et à droite pour aligner X.Cliquez ensuite sur Définir Fiducial 0"Après avoir aligné la fiducial 1 et 2 avec le faisceau de rayons X de la même manière, cliquez sur Créer un système de coordonnées » pour générer une matrice de coordonnées.

Cliquez ensuite sur Bloquer la vérification pour déplacer l’étape XYZ vers le premier puits de chaque pâté de maisons. Si le réticule à rayons X s’aligne avec les ouvertures, la puce est alignée. Dans cette représentation graphique des résultats de recherche ponctuelle de DIALS, un graphique de taux de réussite mis à jour peut être observé.

Si vous cliquez sur un hit, l’image de diffraction correspondante s’affiche dans la visionneuse d’images DIALS. Dans ce tableau, les taux d’indexation et d’intégration actuels qui se mettent à jour en temps réel au fur et à mesure que les données sont collectées pendant la visite peuvent être visualisés. La visualisation des paramètres de la cellule unitaire peut révéler des polymorphes.

Des diagrammes bidimensionnels de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations dues aux effets de charge ou de déshydratation. Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence ou l’absence d’orientations préférées qui peuvent être réinjectées dans le protocole de chargement. Par exemple, dans cette projection, les effets de la surcharge d’une puce avec des cristaux de lysozyme peuvent être observés.

Lors du chargement de la puce, pipettez lentement et utilisez votre doigt pour reposer la pipette au-dessus de la puce. Cela vous empêche de toucher la puce et de poignarder accidentellement des trous dans le silicium. Lors du traitement des données, utilisez les pipelines automatisés disponibles.

Cela vous donnera une bonne idée de la progression de votre expérience et si vous devez varier quelque chose. Cette méthode peut être appliquée à tout système protéique pouvant être cristallisé en quantités significatives. Et la réaction peut être déclenchée par des rayons X légers ou un mélange rapide.

Des études dynamiques sur une série de structures peuvent fournir un aperçu du fonctionnement des protéines.