Name: Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Découvrez la cristallographie synchrotron série à cible fixe pour la biologie structurale en utilisant des puces de silicium. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des protéines avec des échantillons limités.

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Ce travail a été soutenu par l’iNEXT-Discovery (Grant 871037) financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne.

La collecte de données synchrotron série est une technique relativement nouvelle sur les lignes de faisceau MX, comblant l’écart entre les collectes de données ultra-rapides actuellement effectuées dans les XFEL et les MX traditionnelles basées sur le synchrotron. Ce manuscrit vise à donner un aperçu de la façon de collecter avec succès des données série à cible fixe à la ligne de faisceau I24, à la source de lumière Diamond pour les faibles doses, aux séries de doses et aux expériences résolues dans le temps. Comme pour la cristallographie standard, la préparation de l’échantillon est une solution majeure de goulot d’étranglement dans la structure. SSX n’est pas différent, et la préparation d’une boue cristalline homogène en quantité suffisante n’a pas encore bénéficié de plusieurs décennies d’étude et de raffinement comme la croissance de gros cristaux de protéines simples. Toutefois, la préparation de ces boues n’entre pas dans le cadre du présent document et a été résuméeailleurs 36. L’étape critique de l’approche décrite ici implique l’utilisation prudente de l’échantillon disponible à l’aide d’interfaces graphiques faciles à utiliser (étape 3) et de pipelines de traitement de données automatisés (étape 6) pour informer le chargement de la puce (étape 1) et la façon dont une expérience doit se dérouler.
Le pipeline de rétroaction rapide est un outil puissant qui permet aux utilisateurs d’évaluer les taux de réussite initiaux lors de la collecte de données afin d’informer les protocoles de chargement de puces ultérieurs pour une collecte de données réussie. Lorsqu’ils sont confrontés à un faible taux de réussite (<5 %), les utilisateurs risquent de collecter des données incomplètes et/ou de perdre du temps de faisceau avec des collections supplémentaires. Dans ce cas, l’échantillon pourrait être regroupé, concentré par centrifugation douce, et/ou des volumes plus importants pourraient être chargés à l’étape 1.5. Un taux de réussite plus élevé est généralement favorable, cependant, il existe un point de rendement décroissant où la surcharge conduit à plusieurs cristaux dans le même puits. DIALS est capable de traiter des données de diffraction multi-réseaux50, mais une préoccupation plus grande que l’indexation et l’intégration est l’effet néfaste que le regroupement de cristaux peut avoir sur l’activation uniforme des cristaux par la lumière laser ou le mélange rapide pour des expériences précises résolues dans le temps. Il convient donc de veiller tout particulièrement à éviter de surcharger les cibles fixes pour les expériences résolues dans le temps.
L’étape de traitement de l’indexation et de l’intégration produit un tracé avec la croix centrale représentant la direction du faisceau, chaque point représentant la direction de la réflexion hkl 001 des réseaux individuels et l’anneau extérieur du cercle représentant une rotation de 90 ° de l’axe du faisceau. Cela montrera si vos cristaux ont une orientation préférée, ce qui peut avoir un impact sur l’exhaustivité des données et indiquer la nécessité de collecter plus de données ou de modifier le protocole de chargement. Dans le panneau de gauche de la figure 7c, l’effet de surcharge d’une puce avec des cristaux HEWL est montré. Au fur et à mesure que les ouvertures se remplissent de plus de cristaux, elles collent aux parois inclinées des ouvertures plutôt que de se caler à la base dans une orientation aléatoire. Les deux ellipses orthogonales sont le résultat de cristaux couchés sur les parois internes de la puce qui sont à ~35° par rapport à la direction du faisceau. Cela réduit le volume de cristaux chargés, réduit le taux de frappe et réduit considérablement la fraction de cristaux se trouvant dans ces plans préférés.
Il convient de noter que d’autres approches en série sont disponibles chez I24, telles que les extrudeuses LCP et les puces microfluidiques. Ceux-ci utilisent des interfaces graphiques similaires et les mêmes pipelines de traitement, de sorte qu’une grande partie de ce qui précède restera applicable même si une technique différente est utilisée. Un certain nombre d’approches série existent pour SSX et SFX au-delà de l’approche de cible fixe décrite ici, chacune présente certains avantages par rapport à l’autre en fonction de l’expérience à effectuer et de la ligne de faisceau utilisée pour l’expérience. Comme les approches en série évoluent rapidement, il est conseillé de consulter les pages Web de la ligne de faisceau (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) pour les mises à jour récentes et de parler au personnel de la ligne de faisceau le plus tôt possible lors de la planification du temps de faisceau. L’accès à I24 pour les expériences standard et série est gratuit au point d’utilisation. Pour les utilisateurs du Royaume-Uni et de l’UE, les frais de voyage et d’hébergement sont en partie couverts par iNEXT Discovery.

La cristallographie synchrotron série (SSX) est une méthode émergente de collecte de données qui a été inspirée par les lasers à électrons libres à rayons X (XFEL)1,2,3. Lors d’un XFEL, un seul motif de diffraction est enregistré à partir d’un cristal de protéine généralement très petit, avant que le cristal ne soit détruit par l’impulsion de rayons X extrêmement brillante. Cela signifie, typiquement, qu’un nouveau cristal doit être introduit dans le faisceau de rayons X pour obtenir un autre motif de diffraction4. Ce besoin de reconstituer continuellement les cristaux a conduit au développement de nombreuses techniques de livraison d’échantillons en série5.
Aux synchrotrons, les méthodes classiques (non sérielles) de cristallographie par rotation sont largement appliquées, exploitant un seul grand cristal qui est tourné dans un faisceau de rayons X à l’aide d’un goniomètre pour collecter un ensemble de données complet pour la solution de structure6. Afin d’augmenter la durée de vie des cristaux afin qu’un ensemble de données complet puisse être collecté7,8, et aussi pour faciliter l’expédition et le transfert automatisé des échantillons, les cristaux sont cryorefroidis à ~ 100 K pour la collecte de données. À des lignes de faisceau microfocus intenses, des stratégies multicristallines sont fréquemment utilisées car les dommages causés par le rayonnement peuvent empêcher la collecte d’un ensemble de données complet à partird’unseul cristal9,10,11. Malgré les limites imposées par les dommages causés par les radiations, le nombre de cristaux utilisés reste relativement modeste et l’approche utilisée est essentiellement identique à l’expérience monocristalline.
SSX, d’autre part, utilise la livraison d’échantillons en série pour obtenir des modèles de diffraction fixes uniques à partir de milliers de cristaux orientés aléatoirement afin de générer un ensemble de données complet. Il est à noter que les techniques en série incorporant la rotation des cristaux sont en cours de développement12,13 bien que nous nous concentrions sur des approches à rotation fixe et nulle. Il existe une grande variété de systèmes de distribution d’échantillons avec différents avantages et inconvénients14, allant de la livraison d’un flux de cristaux dans un jet concentré / visqueux15,16,17, puce microfluidique18,19, ou des cristaux sur une cible fixe telle qu’une puce de silicium gravée20,21 . Typiquement, les cristaux sont maintenus à température ambiante, ce qui permet d’observer une plus grande diversité conformationnelle et fournit un environnement physiologiquement plus pertinent22. SSX permet la collecte d’ensembles de données à très faible dose23, car la dose totale de l’ensemble de données équivaut à une seule courte exposition aux rayons X d’un cristal. Un autre avantage majeur fourni par SSX est l’étude de la dynamique des protéines par des méthodes résolues dans le temps, avec des réactions déclenchées parl’expositionà la lumière laser24,25, 26,27ou par le mélange de cristaux et de ligand / substrat28,29. L’utilisation de cristaux plus petits signifie que la lumière laser peut pénétrer dans l’ensemble du cristal, initiant uniformément la réaction sans absorption multiphotonique pour fournir des intermédiaires de réaction bien définis pour les données de diffraction prises à différents points temporels27. L’utilisation de cristaux plus gros et de méthodes de collecte de données basées sur la rotation souffre d’une profondeur de pénétration laser limitée, d’une activation non uniforme ou multiphotonique, de dommages causés par le rayonnement et d’un temps de surcharge mécanique dans les balayages de données, ce qui entraîne un mélange d’intermédiaires de réaction qui peuvent s’avérer difficiles ou impossibles à interpréter à des vitesses de réaction plus rapides. Les cristaux plus petits offrent un avantage similaire dans les expériences de mélange, car les ligands peuvent diffuser rapidement et plus uniformément dans tout le cristal, permettant à nouveau d’enregistrer des intermédiaires de réaction définis à différents délais30,31,32.
Sur la ligne de faisceau microfocus I24 de Diamond, des expériences de rotation conventionnelle et SSX peuvent être effectuées. Ici, un protocole complet pour la préparation et la collecte d’échantillons SSX à l’aide de cibles fixes à I24 et de protocoles pour l’analyse de données en série chez Diamond sont présentés. Bien que le manuscrit et les vidéos qui l’accompagnent devraient permettre aux utilisateurs de mener à bien une expérience SSX à I24, il convient de noter qu’il s’agit d’un domaine en développement rapide et que les approches évoluent continuellement. Il convient également de noter que des méthodes série sont disponibles dans d’autres sources synchrotron, y compris, mais sans s’y limiter, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI et PXII)34et NSLS (FMX)35. Bien que les spécificités de la collecte et du traitement des données en série diffèrent d’une source à l’autre, les principes fondamentaux resteront les mêmes. Les protocoles ci-dessous doivent être considérés comme représentant un point de départ et une voie d’accès au camp de base plutôt que le sommet de ce qui pourrait être réalisé.
Ce protocole suppose que les utilisateurs ont un système de protéines ou de petites molécules cristallines, à partir duquel une boue de microcristaux de l’ordre de 0,5-2,0 mL avec une bonne densité de microcristaux par mL a été produite. Les protocoles d’obtention des boues cristallines ont été décrits précédemment 36. De nombreux types de cibles fixes sont disponibles, les plus couramment utilisés chez I24 utilisent une puce de silicium définie avec précision. Afin de se différencier des autres configurations de puces, ci-dessous et dans l’interface de ligne de faisceau, on parle de « puce Oxford ». Comme décrit précédemment, la disposition de la puce Oxford comprend 8×8 « pâtés de maisons », chacun contenant 20×20 ouvertures pour un total de 25 600 ouvertures20,21.

<table><tbody><tr><td>Porte-puces</td><td>sur mesure</td><td>N/A</td><td>Porte-puces métalliques sur mesure fabriqués en interne composés de 2 plaques de base magnétiques, de 2 anneaux métalliques et d’un support cinématique.</td></tr><tr><td>Entretoises de copeaux sans copeaux</td> Feuilles adhésives <td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>LCP disponibles dans le cadre de la gamme modulaire LCP</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp ; contrôleur/amplificateur multi-axes avec une configuration matérielle personnalisée de source lumineuse en diamant</td></tr><tr><td>Supports cinématiques</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Bases carrées avec 3 aimants disposés en triangle fixés sur des porte-puces.</td></tr><tr><td>Pompe à vide KNF Laboport</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>Pompe à ventre en PTFE solide, vitesse de pompage de 10 l/min.</td></tr><tr><td>Feuilles Mylar 6 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>rouleau de 300 pieds de 6 & micro ; Film XRF mylar d’une épaisseur m par SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>Rouleau de 3 & micro de 300 pi ; Film XRF mylar d’une épaisseur m par SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Un système de décharge luminescente compact et autonome utilisé pour produire des surfaces hydrophiles</td></tr><tr><td>Puces de silicium</td><td>Université de Southampton</td><td>N/A</td><td>Puces de silicium gravées sur mesure avec 25 6000 ouvertures disponibles dans une variété de tailles.</td></tr><tr><td>Les platines</td> d’échantillonnage <td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ sont le fruit d’une conception collaborative réalisée par Diamond Light Source et SmarAct, et construites sur mesure par SmarAct à l’aide de trois étages de translation linéaire de 50 mm, de guidages à rouleaux croisés précis et d’un capteur intégré avec une résolution allant jusqu’à 1 nm</td></tr><tr><td>Humidificateur à ultrasons 1byOne (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Humidificateur à ultrasons de 1,3 litre disponible dans le commerce</td></tr></tbody></table>

collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse diamond

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

La collecte de données en série est une technique relativement nouvelle pour les utilisateurs de synchrotrons. Un manuel d’utilisation pour la collecte de données sur cible fixe chez I24, Diamond Light Source est présenté avec des instructions détaillées étape par étape, des chiffres et des vidéos pour une collecte de données en douceur.

Collecte et séries de données à faible dose Des données sur les faibles doses (étape 5.1 : scénario 1) et les séries de doses (étape 5.2 : scénario 2) ont été recueillies sur les microcristaux de nitrite de cuivre réductase à I24 et ont été publiées précédemment 42. Tous les échantillons ont été préparés comme décrit à l’étape 1, les données recueillies conformément aux étapes 3, 4 et 5 et traitées à l’aide de méthodes à l’étape 6. Dans ce travail, une série de doses rapides a été recueillie avec 20 images de diffraction prises à chaque ouverture (c.-à-d. n= 20 dans l’interface graphique de collecte de données montrée ci-dessus) avant de passer à un nouvel échantillon. À partir de ces données, une distribution bimodale de cellules unitaires dans le groupe spatial P213 a été identifiée (a = b = c = 97,25 Å et a = b = c = 96,38 Å). L’identification et la séparation de ces polymorphes unité-cellule pour le traitement ont montré une nette amélioration des indicateurs de qualité des données et ont révélé deux structures différentes dans une boucle flexible entre les résidus 189-193 au lieu de l’état mixte observé lors du traitement de toutes les données ensemble. L’identification de tels polymorphes pourrait faire toute la différence dans une étude structurelle délicate résolue dans le temps où seuls de petits changements structurels sont attendus. En outre, les séries de doses recueillies ont révélé un changement de cellule unitaire dose-dépendante dans le cristal, avec une dose accrue déplaçant la population en faveur de la plus grande cellule unitaire.
Des travaux similaires ont été effectués par Ebrahim et al (2019)47, où une série de doses (étape 5.2: scénario 2) a été recueillie à partir d’une peroxydase hémique de type colorant de Streptomyces lividans (DtpAa) pour comparer les structures à faible dose de SSX (étape 5.1: scénario 1) avec celles mesurées dans le même système cible fixe à l’aide de SFX. Les données SFX ont été collectées à la ligne de faisceau SACLA BL2 EH3 avec une longueur d’impulsion de 10 femtosecondes et un taux de répétition de 30 Hz. La durée d’impulsion de 10 femtosecondes garantit que les effets dépendants de la dose ne sont pas présents dans les données SFX. Les données SFX ont été comparées aux données SSX recueillies sur la ligne de faisceau I24, où 10 expositions séquentielles de 10 millisecondes ont été mesurées à chaque position de l’échantillon (c.-à-d. n= 10). La migration dose-dépendante d’une molécule d’eau coordonnée par le fer hémique loin du fer a été observée, ainsi qu’un changement conformationnel dans l’un des groupes propionate d’hème de la série de doses SSX. Bien qu’elle ne soit pas exempte de dommages comme la structure SFX, la série de doses a permis d’extrapoler la longueur de liaison Fe-O d’un ensemble de données à dose nulle (hème ferrique), ce qui correspond à une erreur expérimentale à la valeur obtenue à partir de SFX.
Les méthodes de collecte de données de cristallographie en série décrites ici peuvent également être facilement adaptées pour fournir de nouveaux environnements d’échantillonnage pour, par exemple, étudier les structures protéiques anaérobies à température ambiante. Comme indiqué dans Rabe et al 2020 48, le chargement d’un échantillon « feuille sur feuille », ou « puce sans puce », avec différents films d’étanchéité dans une chambre anérobie permet la collecte à température ambiante de données structurelles à partir d’échantillons sensibles au dioxygène.
Sonde de pompe Bien que les résultats représentatifs suivants n’aient pas été recueillis à Diamond Beamline I24, ces méthodes ont été développées en étroite collaboration entre les installations du programme iNEXT pour travailler à des méthodes standard dans le développement de méthodes de cristallographie en série. Beamline I24 propose, ou proposera bientôt, des méthodes de collecte équivalentes à celles décrites ci-dessous pour effectuer de telles expériences en utilisant les méthodes décrites dans les protocoles ci-dessus.
Sonde de pompe: mélange rapide Le mélange rapide SSX a été effectué à la ligne de faisceau T-REXX à PETRA III par Mehrabi et al (2019) 28 à l’aide d’un injecteur de gouttelettes piézo-entraîné pour initier des réactions sur des cibles fixes. Ce travail présente une preuve de principe sur l’expérience de mélange de puces liant GlcNac3à des microcristaux de lysozyme, la liaison se produisant dans les 50 ms d’une goutte de 75 pL appliquée à l’échantillon. Cette étude a été suivie d’une série à 7 structures résolues dans le temps de l’activité de l’isomérase xylose, démontrant une liaison au glucose dans les 15 ms et la formation d’une conformation en anneau ouvert dans la molécule de glucose après un délai de 60 secondes. Une configuration équivalente pour l’injection de gouttelettes est actuellement en cours de développement pour une utilisation sur I24.
Pompe-Sonde: Activation de la lumière Une expérience en série de pompe-sonde activée par la lumière est présentée dans Schulz et al (2018) 49. La fluoroacétate déshydrogénase a été imbibée de fluoroacétate photocaged et pompée avec une lumière laser de 320 à 360 nm pour produire des structures à 4 points temporels (t = 0, 30, 752 et 2 052 ms). La structure de l’état de repos (0 ms) montre un site actif vide, à l’exception de quelques molécules d’eau, et une densité équivalente entre les domaines de la calotte des deux sous-unités protéiques. 30 ms et 752 ms après activation lumineuse, une réduction significative de la densité électronique peut être observée dans le domaine de la calotte de la sous-unité B par rapport à la sous-unité A. La réduction de la densité électronique dans le domaine de la coiffe de la sous-unité B coïncide avec l’apparition du fluoroacétate dans le site actif de la sous-unité A à 752 ms. L’ensemble de données final à 2 052 ms montre un réarrangement structurel supplémentaire du ligand, soupçonné de faciliter la géométrie correcte pour l’attaque SN2, et la formation potentielle d’un état intermédiaire dans la réaction. Sur I24, un système laser Pharos portable réglable de 210 à 2500 nm fournissant des impulsions femtosecondes peut être utilisé pour l’activation de la lumière. Les premières expériences ont montré l’activation réussie d’une photocage en utilisant une excitation de 308 nm avec liaison du ligand libéré à la protéine cible observée. Au moment de la rédaction du présent rapport, l’intégration dans le système de sécurité du personnel de la ligne de faisceau est en cours et des expériences de routine pour les utilisateurs sont prévues au début de 2021. Pour les expériences où des impulsions de lumière moins intenses sont nécessaires, l’activation de la lumière avec des LED contrôlées par TTL a été effectuée avec succès.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figure 1: Équipement de chargement d’échantillons en place à la source lumineuse Diamond. L’installation se compose d’une pompe à vide ( a ),d’uneboîte à gants (b) et d’un humidificateur (c). Dans la boîte à gants, la pression de vide est utilisée pour agir sur une puce chargée de boue cristalline maintenue dans un blocd’échantillon (d)attaché à une fiole büchner(e,flèche verte), via un régulateur de pression(f,flèche jaune) attaché à un robinet d’arrêt(g,flèche bleue). L’air humide est pompé dans la tente via un tube en plastique fixé à l’humidificateur (h), et mesuré à l’aide d’un hygromètre (i). Les composants sont maintenus en place à l’aide de supports de serrage (j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figure 2: Porte-échantillons. Ils utilisent un joint torique métallique ( a ) pour serrerunfilm de polyester sur une moitié supérieure (b) et inférieure (c), la moitié inférieure arborant des supports magnétiques (d) qui sont utilisés pour attacher le porte-échantillon aux étages d’échantillonnage. Le film de polyester (6 μm(e)ou 3 μm(f))ainsi que les joints toriques en caoutchouc (flèches blanches) empêchent une puce chargée en cristal de sécher rapidement dans un porte-échantillon fermé hermétiquement avec des boulons hexagonaux(g). Les copeaux sont nettoyés à l’aide de bains séquentiels de 15 minutes dans dH2O, 1 M HCl et dH2O(h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figure 3: Interface graphique de collecte de données pour lacollecte de données à cible fixe à I24. (a) Montre l’interface principale utilisée pour aligner les puces et définir les paramètres de collecte de données, (b) est l’interface de cartographie légère utilisée pour définir les sous-régions d’une puce pour la collecte de données et (c) est une interface pour définir les paramètres pour l’éclairage laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figure 4: Le processus de montage d’un porte-puce sur les étages comme décrit à l’étape 3, point 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figure 5: Alignement des puces. Une puce est alignée en cliquant sur trois marqueurs fiducial sur la puce indiquée dans (a). Les vues des fiducials 0, 1 et 2 à travers le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau sont présentées aux pointsb),c)etd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figure 6: Affichage des résultats du traitement automatique lancé comme décrit à l’étape 6.1. Un graphique de taux de réussite mis à jour s’affiche (a, encart). Si vous cliquez sur un 'hit' sur l’image de diffraction correspondante, elle s’affiche dans la visionneuse d’images des cadrans. Le taux de réussite pour la collecte de données actuelle est indiqué (29,6 % dans cet exemple). Le panneau (b) montre un exemple de fenêtre montrant les taux actuels d’indexation et d’intégration des données collectées jusqu’à présent lors de la visite qui sont mises à jour en temps réel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figure 7: Analyse plus approfondie des données. La visualisation des paramètres des cellules unitaires peut révéler des polymorphes (a). Les paramètres unitaires moyens des cellules sont calculés; cependant, cela ne s’étend pas encore aux moyennes individuelles pour les polymorphes. La visualisation d’un petit sous-ensemble de données (les données présentées sont un sous-ensemble de 793 cristaux de nitrite de cuivre réductase à partir des données décrites dans Ebrahim et al 2019) est souvent suffisante pour révéler les tendances. Des diagrammes 2D de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations qui surviennent en raison des effets de charge ou de déshydratation qui pourraient être traités pour les prochaines collectes de données (b). Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence, ou l’absence, d’orientations préférées alimentant le protocole de chargement (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons un guide complet sur la préparation des échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie synchrotron en série à la ligne de faisceau Diamond I24.

Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

La cristallographie synchrotron en série, ou SSX, est un domaine relativement nouveau et en développement rapide de MX.Il est très bien adapté aux expériences à faible dose et à température ambiante, mais peut-être plus important encore, il est vraiment bien adapté au suivi de la dynamique. Cela permet de réaliser des films en stop-motion de protéines en action. Chez I24, plusieurs modes de SSX sont disponibles.Ce protocole se concentre sur SSX à cible fixe, ce qui permet un large éventail d’expériences en série utilisant des quantités limitées d’échantillons. Les puces de silicium peuvent être endommagées lors du chargement et du nettoyage, si vous ne les connaissez pas. En outre, le protocole d’alignement des puces est complètement nouveau pour de nombreux cristallographes, et le traitement des données est légèrement différent de vos données de rotation standard.Pour préparer un porte-copeaux, coupez deux feuilles de feuille de polyester en carrés d’environ 6 x 6 centimètres et placez les feuilles sur les deux plaques de base. À l’aide de bagues d’étanchéité en métal, fixez les feuilles en place, puis tirez soigneusement sur l’excès de papier d’aluminium pour éliminer les plis. Ensuite, sélectionnez une puce de silicium avec des ouvertures de taille appropriée par rapport à la taille des cristaux à analyser.Glow décharge la puce pendant 25 secondes à 0,39 millibar, avec un courant de 15 milliampères. Utilisez une pince à épiler pour placer la puce de silicium sur l’étage de chargement de la puce, avec les barres surélevées vers le bas. Ensuite, à l’aide d’une pipette, appliquez 200 microlitres de la boue de microcristal sur le côté plat de la puce, en étalant la boue pour couvrir tous les pâtés de maisons de la puce.Si la puce est endommagée, couvrez les trous avec un petit morceau de feuille de polyester pour vous assurer qu’un vide uniforme peut être appliqué. Ensuite, appliquez un vide doux pour aspirer tout l’excès de liquide à travers la puce. Retirez la puce de l’étape de chargement de la puce et épongez soigneusement le dessous de la puce avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide.Placez la puce chargée sur la plus grande moitié du porte-puce entre les marques de guidage, côté plat vers le bas. Placez la petite moitié du porte-puce sur la puce pour la sceller. Les deux moitiés du porte-puce doivent s’enclencher.Ensuite, à l’aide de boulons hexagonaux, fixez la puce solidement en place. Pour aligner la puce, maintenez le support de puce à un angle de 30 degrés tout en approchant du support. Utilisez ensuite les supports cinématiques pour placer la puce chargée sur l’étage XYZ à la ligne de faisceau.Lorsque les aimants entrent en contact, laissez le porte-puce tourner parallèlement au flux et cliquez en place. Une fois la puce placée, utilisez le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau et l’interface utilisateur graphique d’alignement de la puce pour localiser la fiduciale supérieure gauche de la puce. Pour vous centrer sur la fiduciale 0 dans X, Y et Z, déplacez-vous vers l’intérieur et la sortie de la mise au point pour aligner Z, de haut en bas pour aligner Y, et à gauche et à droite pour aligner X.Cliquez ensuite sur Définir Fiducial 0"Après avoir aligné la fiducial 1 et 2 avec le faisceau de rayons X de la même manière, cliquez sur Créer un système de coordonnées » pour générer une matrice de coordonnées.Cliquez ensuite sur Bloquer la vérification pour déplacer l’étape XYZ vers le premier puits de chaque pâté de maisons. Si le réticule à rayons X s’aligne avec les ouvertures, la puce est alignée. Dans cette représentation graphique des résultats de recherche ponctuelle de DIALS, un graphique de taux de réussite mis à jour peut être observé.Si vous cliquez sur un hit, l’image de diffraction correspondante s’affiche dans la visionneuse d’images DIALS. Dans ce tableau, les taux d’indexation et d’intégration actuels qui se mettent à jour en temps réel au fur et à mesure que les données sont collectées pendant la visite peuvent être visualisés. La visualisation des paramètres de la cellule unitaire peut révéler des polymorphes.Des diagrammes bidimensionnels de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations dues aux effets de charge ou de déshydratation. Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence ou l’absence d’orientations préférées qui peuvent être réinjectées dans le protocole de chargement. Par exemple, dans cette projection, les effets de la surcharge d’une puce avec des cristaux de lysozyme peuvent être observés.Lors du chargement de la puce, pipettez lentement et utilisez votre doigt pour reposer la pipette au-dessus de la puce. Cela vous empêche de toucher la puce et de poignarder accidentellement des trous dans le silicium. Lors du traitement des données, utilisez les pipelines automatisés disponibles.Cela vous donnera une bonne idée de la progression de votre expérience et si vous devez varier quelque chose. Cette méthode peut être appliquée à tout système protéique pouvant être cristallisé en quantités significatives. Et la réaction peut être déclenchée par des rayons X légers ou un mélange rapide.Des études dynamiques sur une série de structures peuvent fournir un aperçu du fonctionnement des protéines.

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Appareils numériques à micromiroirs (DMD) peut générer des modèles complexes dans le temps et l'espace avec lequel contrôler l'excitabilité neuronale. Questions pertinentes pour la conception, la construction et l'exploitation des systèmes DMD sont discutées. Un tel système a permis la démonstration de la non-linéaires intégration à travers des points de ramification distale dendritiques.

Photostimulation motifs avec les périphériques numériques Micromirror chargé d&#39;enquêter sur l&#39;intégration à travers des points dendritiques Direction

Les larves de drosophile sont sensibles à la lumière et réagissent aux changements de la lumière environnante. Cette vidéo décrit un test qui teste leur capacité à éviter la lumière, appelé test de taches lumineuses. Le protocole présenté montre comment configurer le test avec une LED de lumière bleue et montre comment enregistrer le comportement de l'animal en réponse à la rencontre avec la lumière.

Dosage des points lumineux : une méthode pour étudier le comportement phototactique de la drosophile

Dans ce rapport, nous décrivons des procédures détaillées pour la réalisation d'expériences de diffraction de cristal aux rayons X unique avec une cellule à enclume de diamant au GSECARS 13-BM-C ligne de lumière à l'Advanced Photon Source. programmes ATREX et RSV sont utilisés pour analyser les données.

High Pressure Monocristal Diffraction PX ^ 2

Ce protocole introduit un essai de tache de lumière pour étudier le comportement phototactic larvaire de Drosophila. Dans cet analyse, un point lumineux est généré sous forme de stimulation lumineuse, et le processus d'évitement de la lumière larvaire est enregistré par un système d'imagerie infrarouge à base de lumière.

Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

Un protocole est présenté pour l’irradiation automatisée des feuilles d’or minces avec des impulsions laser de haute intensité. Le protocole comprend une description étape par étape du processus de fabrication de la cible de micromachining et un guide détaillé pour la façon dont les cibles sont portées au point du laser à un taux de 0,2 Hz.

Livraison automatisée de cibles microfabriquées pour des expériences intenses d’irradiation laser

Nous présentons ici un protocole pour la préparation d’échantillons cryogéniques et le transfert de cristaux dans la station d’extrémité sous vide sur la ligne de faisceau I23 à Diamond Light Source, pour des expériences de cristallographie macromoléculaire à rayons X de longue longueur d’onde.

Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond

Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.

Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant

Le protocole utilise la microscopie à feuillet de lumière avancée ainsi que des méthodes de nettoyage tissulaire adaptées pour étudier les structures cardiaques complexes dans les cœurs de rongeurs, ce qui présente un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Cet article décrit la méthode expérimentale permettant d’obtenir un piégeage stable et de longue durée et un positionnement précis des grosses particules métalliques dans l’air à l’aide d’un piège photophorétique dynamique en forme de bateau. Ce système permet une manipulation contrôlée adaptée aux études d’interaction plasmonique.

Piéger optiquement de grosses particules métalliques dans l&#39;air à l&#39;aide d&#39;un piège « bateau » avec des parois latérales tirées directement

Nous décrivons des procédures pour la préparation et l’administration de microcristaux de protéines membranaires en phase cubique lipidique pour la cristallographie en série à l’aide de lasers à rayons X à électrons libres et de sources synchrotron. Ces protocoles peuvent également être appliqués pour l’incorporation et l’administration de microcristaux de protéines solubles, ce qui permet de réduire considérablement la consommation d’échantillons par rapport à l’injection de liquide.

Préparation et livraison de microcristaux de protéines dans la phase lipidique cubique pour Serial femtoseconde Cristallographie

Découvrez la cristallographie synchrotron série à cible fixe pour la biologie structurale en utilisant des puces de silicium. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des protéines avec des échantillons limités.

Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond

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