Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond
26 février 2021
Nous présentons un guide complet sur la préparation des échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie synchrotron en série à la ligne de faisceau Diamond I24.
La cristallographie synchrotron en série, ou SSX, est un domaine relativement nouveau et en développement rapide de MX.Il est très bien adapté aux expériences à faible dose et à température ambiante, mais peut-être plus important encore, il est vraiment bien adapté au suivi de la dynamique. Cela permet de réaliser des films en stop-motion de protéines en action. Chez I24, plusieurs modes de SSX sont disponibles.
Ce protocole se concentre sur SSX à cible fixe, ce qui permet un large éventail d’expériences en série utilisant des quantités limitées d’échantillons. Les puces de silicium peuvent être endommagées lors du chargement et du nettoyage, si vous ne les connaissez pas. En outre, le protocole d’alignement des puces est complètement nouveau pour de nombreux cristallographes, et le traitement des données est légèrement différent de vos données de rotation standard.
Pour préparer un porte-copeaux, coupez deux feuilles de feuille de polyester en carrés d’environ 6 x 6 centimètres et placez les feuilles sur les deux plaques de base. À l’aide de bagues d’étanchéité en métal, fixez les feuilles en place, puis tirez soigneusement sur l’excès de papier d’aluminium pour éliminer les plis. Ensuite, sélectionnez une puce de silicium avec des ouvertures de taille appropriée par rapport à la taille des cristaux à analyser.
Glow décharge la puce pendant 25 secondes à 0,39 millibar, avec un courant de 15 milliampères. Utilisez une pince à épiler pour placer la puce de silicium sur l’étage de chargement de la puce, avec les barres surélevées vers le bas. Ensuite, à l’aide d’une pipette, appliquez 200 microlitres de la boue de microcristal sur le côté plat de la puce, en étalant la boue pour couvrir tous les pâtés de maisons de la puce.
Si la puce est endommagée, couvrez les trous avec un petit morceau de feuille de polyester pour vous assurer qu’un vide uniforme peut être appliqué. Ensuite, appliquez un vide doux pour aspirer tout l’excès de liquide à travers la puce. Retirez la puce de l’étape de chargement de la puce et épongez soigneusement le dessous de la puce avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide.
Placez la puce chargée sur la plus grande moitié du porte-puce entre les marques de guidage, côté plat vers le bas. Placez la petite moitié du porte-puce sur la puce pour la sceller. Les deux moitiés du porte-puce doivent s’enclencher.
Ensuite, à l’aide de boulons hexagonaux, fixez la puce solidement en place. Pour aligner la puce, maintenez le support de puce à un angle de 30 degrés tout en approchant du support. Utilisez ensuite les supports cinématiques pour placer la puce chargée sur l’étage XYZ à la ligne de faisceau.
Lorsque les aimants entrent en contact, laissez le porte-puce tourner parallèlement au flux et cliquez en place. Une fois la puce placée, utilisez le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau et l’interface utilisateur graphique d’alignement de la puce pour localiser la fiduciale supérieure gauche de la puce. Pour vous centrer sur la fiduciale 0 dans X, Y et Z, déplacez-vous vers l’intérieur et la sortie de la mise au point pour aligner Z, de haut en bas pour aligner Y, et à gauche et à droite pour aligner X.Cliquez ensuite sur Définir Fiducial 0"Après avoir aligné la fiducial 1 et 2 avec le faisceau de rayons X de la même manière, cliquez sur Créer un système de coordonnées » pour générer une matrice de coordonnées.
Cliquez ensuite sur Bloquer la vérification pour déplacer l’étape XYZ vers le premier puits de chaque pâté de maisons. Si le réticule à rayons X s’aligne avec les ouvertures, la puce est alignée. Dans cette représentation graphique des résultats de recherche ponctuelle de DIALS, un graphique de taux de réussite mis à jour peut être observé.
Si vous cliquez sur un hit, l’image de diffraction correspondante s’affiche dans la visionneuse d’images DIALS. Dans ce tableau, les taux d’indexation et d’intégration actuels qui se mettent à jour en temps réel au fur et à mesure que les données sont collectées pendant la visite peuvent être visualisés. La visualisation des paramètres de la cellule unitaire peut révéler des polymorphes.
Des diagrammes bidimensionnels de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations dues aux effets de charge ou de déshydratation. Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence ou l’absence d’orientations préférées qui peuvent être réinjectées dans le protocole de chargement. Par exemple, dans cette projection, les effets de la surcharge d’une puce avec des cristaux de lysozyme peuvent être observés.
Lors du chargement de la puce, pipettez lentement et utilisez votre doigt pour reposer la pipette au-dessus de la puce. Cela vous empêche de toucher la puce et de poignarder accidentellement des trous dans le silicium. Lors du traitement des données, utilisez les pipelines automatisés disponibles.
Cela vous donnera une bonne idée de la progression de votre expérience et si vous devez varier quelque chose. Cette méthode peut être appliquée à tout système protéique pouvant être cristallisé en quantités significatives. Et la réaction peut être déclenchée par des rayons X légers ou un mélange rapide.
Des études dynamiques sur une série de structures peuvent fournir un aperçu du fonctionnement des protéines.
Aperçu
Cet article fournit un guide complet sur la préparation d'échantillons sur cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie sérielle en synchrotron sur la ligne de lumière I24 de Diamond. Il met l'accent sur la méthodologie permettant de réaliser des expériences avec des quantités limitées d'échantillon tout en préservant l'intégrité de la puce.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie structurale
- Cristallographie
- Dynamique des protéines
Contexte
- La cristallographie sérielle en synchrotron (SSX) est un domaine en développement dans le domaine de la cristallographie macromoléculaire.
- Elle convient aux expériences à faible dose et à température ambiante.
- L'approche SSX permet des études dynamiques des protéines, offrant la possibilité de visualiser leurs actions.
- La SSX à cible fixe peut exploiter efficacement des quantités limitées d'échantillon.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la SSX à cible fixe sur la ligne de lumière I24 de Diamond.
- Garantir une préparation et un alignement adéquats de la puce pour une collecte de données optimale.
- Mettre en évidence les différences dans le traitement des données par rapport aux données de rotation standard.
Méthodes utilisées
- Préparation de puces en silicium à l'aide de feuilles de polyester et de techniques d'étanchéité.
- Application d'une suspension de microcristaux sur les puces et aspiration sous vide.
- Alignement des puces à l'aide d'une interface graphique utilisateur sur la ligne de faisceau.
- Visualisation et traitement en temps réel des données à l'aide de pipelines automatisés.
Résultats principaux
- L'alignement réussi des puces permet une collecte de données précise.
- La surveillance en temps réel des taux d'indexation et d'intégration pendant les expériences.
- La visualisation des paramètres de la maille élémentaire révèle les polymorphes et les effets de chargement.
- Les études dynamiques offrent des aperçus sur la fonctionnalité des protéines.
Conclusions
- Le protocole améliore l'efficacité des expériences SSX à cible fixe.
- Une manipulation et un alignement corrects de la puce sont essentiels pour une collecte de données réussie.
- Les études dynamiques utilisant la SSX peuvent considérablement approfondir notre compréhension du comportement des protéines.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La cristallographie sérielle par synchrotron à cible fixe permet aux biologistes structuraux de mener des études dynamiques des protéines en utilisant des quantités limitées d'échantillon, soutenant ainsi la validation des cibles grâce à des informations structurales à haute résolution. Cette méthode réduit la consommation d'échantillon tout en préservant la qualité des données, ce qui est essentiel lors des phases précoces de découverte où l'expression et la purification des protéines constituent des goulots d'étranglement. En facilitant les expériences à température ambiante et les études résolues en temps, elle améliore la compréhension mécanistique de la fonction protéique, éclairant ainsi les efforts d'optimisation des candidats médicaments et de réduction des risques en développement préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en capturant les conformations protéiques en action, soutenant ainsi la validation fonctionnelle des cibles.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance aux grands volumes cristallins, permettant le criblage de cibles difficiles à travailler lorsque les rendements d'expression sont limités.
- Fiabilité prédictive : Fournit des données structurales qui éclairent la caractérisation des sites de fixation et le mécanisme d'action, améliorant ainsi les décisions de sélection des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des cartes quantitatives de densité électronique à partir de microcristaux, permettant des évaluations précises de la liaison de ligands.
- Valeur opérationnelle : Standardise le montage et l'alignement des échantillons grâce à des systèmes basés sur des puces, améliorant ainsi la reproductibilité entre les campagnes de criblage.
- Préparation au test : Produit en temps réel des taux de succès et des indicateurs d'indexation qui aident à prendre des décisions « poursuivre/interrompre » lors du criblage de fragments ou de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Révèle les formes polymorphes et les changements conformationnels pouvant affecter la liaison du médicament ou sa stabilité, ce qui éclaire les stratégies de formulation.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données structurales résolues en fonction du temps, pouvant être corrélées à des tests fonctionnels, renforçant ainsi l'alignement des biomarqueurs translationnels.
- Atténuation des risques : Détecte précocement les artefacts induits par le chargement ou les effets de déshydratation, réduisant ainsi le risque d'interprétation erronée lors de l'optimisation ultérieure.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La SSX à cible fixe s'intègre au flux de travail de découverte après l'identification de la cible et le développement du test, en fournissant des informations structurales qui orientent l'identification des composés candidats et la validation préclinique. Elle permet des cycles itératifs de conception, synthèse, test et analyse en offrant un retour rapide sur la structure des complexes formés par la liaison du composé et sur la dynamique protéique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en visualisant les changements conformationnels induits par les ligands et les dynamiques protéiques liées au mécanisme d'action.
- Écrans : Permet la préparation d'essais grâce à une préparation et un alignement normalisés des puces, assurant une qualité de données constante lors des criblages de composés.
- Analyse : Fournit des résultats quantitatifs incluant les paramètres de la maille élémentaire, les taux de succès et les métriques d'intégration, permettant une comparaison objective des conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie les observations structurales aux résultats fonctionnels en révélant les dynamiques susceptibles d'influencer la biodisponibilité ou la liaison à la cible.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour le criblage structural sur plusieurs cibles, réduisant les efforts de réétalonnage dans les environnements multi-projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en fournissant des données structurales à haute résolution et résolues temporellement dans des conditions proches des conditions physiologiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à une manipulation normalisée des puces, à des protocoles d'alignement et à des pipelines automatisés de traitement des données.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en réduisant la consommation d'échantillons et en permettant une itération rapide dans les campagnes d'optimisation structurale.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en réduisant l'ambiguïté mécanistique des interactions cible-ligand.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cristallographie macromoléculaire et une familiarité avec les techniques de manipulation d'échantillons basées sur des synchrotrons.
- Dépend de l'accès à une infrastructure de ligne de lumière dotée d'un montage cinématique, d'une observation sur axe et de pipelines automatisés de traitement des données tels que DIALS.
- Implique une standardisation interéquipes des procédures de préparation des puces, d'aspiration sous vide et d'alignement afin d'assurer la cohérence des données.
- Implique des adaptations selon la taille des cristaux et les groupes spatiaux, nécessitant un ajustement du choix de l'ouverture et des techniques d'étalage.
- Comprend des limites pratiques telles que la fragilité des puces lors du chargement et du nettoyage, ainsi que la sensibilité aux effets de déshydratation pouvant altérer la qualité des cristaux au fil du temps.
