Collecte de données série à cible fixe à la source lumineuse Diamond
February 26th, 2021
Nous présentons un guide complet sur la préparation des échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie synchrotron en série à la ligne de faisceau Diamond I24.
La cristallographie synchrotron en série, ou SSX, est un domaine relativement nouveau et en développement rapide de MX.Il est très bien adapté aux expériences à faible dose et à température ambiante, mais peut-être plus important encore, il est vraiment bien adapté au suivi de la dynamique. Cela permet de réaliser des films en stop-motion de protéines en action. Chez I24, plusieurs modes de SSX sont disponibles.
Ce protocole se concentre sur SSX à cible fixe, ce qui permet un large éventail d’expériences en série utilisant des quantités limitées d’échantillons. Les puces de silicium peuvent être endommagées lors du chargement et du nettoyage, si vous ne les connaissez pas. En outre, le protocole d’alignement des puces est complètement nouveau pour de nombreux cristallographes, et le traitement des données est légèrement différent de vos données de rotation standard.
Pour préparer un porte-copeaux, coupez deux feuilles de feuille de polyester en carrés d’environ 6 x 6 centimètres et placez les feuilles sur les deux plaques de base. À l’aide de bagues d’étanchéité en métal, fixez les feuilles en place, puis tirez soigneusement sur l’excès de papier d’aluminium pour éliminer les plis. Ensuite, sélectionnez une puce de silicium avec des ouvertures de taille appropriée par rapport à la taille des cristaux à analyser.
Glow décharge la puce pendant 25 secondes à 0,39 millibar, avec un courant de 15 milliampères. Utilisez une pince à épiler pour placer la puce de silicium sur l’étage de chargement de la puce, avec les barres surélevées vers le bas. Ensuite, à l’aide d’une pipette, appliquez 200 microlitres de la boue de microcristal sur le côté plat de la puce, en étalant la boue pour couvrir tous les pâtés de maisons de la puce.
Si la puce est endommagée, couvrez les trous avec un petit morceau de feuille de polyester pour vous assurer qu’un vide uniforme peut être appliqué. Ensuite, appliquez un vide doux pour aspirer tout l’excès de liquide à travers la puce. Retirez la puce de l’étape de chargement de la puce et épongez soigneusement le dessous de la puce avec du papier filtre pour éliminer l’excès de liquide.
Placez la puce chargée sur la plus grande moitié du porte-puce entre les marques de guidage, côté plat vers le bas. Placez la petite moitié du porte-puce sur la puce pour la sceller. Les deux moitiés du porte-puce doivent s’enclencher.
Ensuite, à l’aide de boulons hexagonaux, fixez la puce solidement en place. Pour aligner la puce, maintenez le support de puce à un angle de 30 degrés tout en approchant du support. Utilisez ensuite les supports cinématiques pour placer la puce chargée sur l’étage XYZ à la ligne de faisceau.
Lorsque les aimants entrent en contact, laissez le porte-puce tourner parallèlement au flux et cliquez en place. Une fois la puce placée, utilisez le système de visualisation sur axe de la ligne de faisceau et l’interface utilisateur graphique d’alignement de la puce pour localiser la fiduciale supérieure gauche de la puce. Pour vous centrer sur la fiduciale 0 dans X, Y et Z, déplacez-vous vers l’intérieur et la sortie de la mise au point pour aligner Z, de haut en bas pour aligner Y, et à gauche et à droite pour aligner X.Cliquez ensuite sur Définir Fiducial 0"Après avoir aligné la fiducial 1 et 2 avec le faisceau de rayons X de la même manière, cliquez sur Créer un système de coordonnées » pour générer une matrice de coordonnées.
Cliquez ensuite sur Bloquer la vérification pour déplacer l’étape XYZ vers le premier puits de chaque pâté de maisons. Si le réticule à rayons X s’aligne avec les ouvertures, la puce est alignée. Dans cette représentation graphique des résultats de recherche ponctuelle de DIALS, un graphique de taux de réussite mis à jour peut être observé.
Si vous cliquez sur un hit, l’image de diffraction correspondante s’affiche dans la visionneuse d’images DIALS. Dans ce tableau, les taux d’indexation et d’intégration actuels qui se mettent à jour en temps réel au fur et à mesure que les données sont collectées pendant la visite peuvent être visualisés. La visualisation des paramètres de la cellule unitaire peut révéler des polymorphes.
Des diagrammes bidimensionnels de paramètres utiles peuvent également être produits pour révéler les variations dues aux effets de charge ou de déshydratation. Les projections stéréographiques peuvent révéler la présence ou l’absence d’orientations préférées qui peuvent être réinjectées dans le protocole de chargement. Par exemple, dans cette projection, les effets de la surcharge d’une puce avec des cristaux de lysozyme peuvent être observés.
Lors du chargement de la puce, pipettez lentement et utilisez votre doigt pour reposer la pipette au-dessus de la puce. Cela vous empêche de toucher la puce et de poignarder accidentellement des trous dans le silicium. Lors du traitement des données, utilisez les pipelines automatisés disponibles.
Cela vous donnera une bonne idée de la progression de votre expérience et si vous devez varier quelque chose. Cette méthode peut être appliquée à tout système protéique pouvant être cristallisé en quantités significatives. Et la réaction peut être déclenchée par des rayons X légers ou un mélange rapide.
Des études dynamiques sur une série de structures peuvent fournir un aperçu du fonctionnement des protéines.
Aperçu
Cet article fournit un guide complet pour la préparation d'échantillons à cible fixe, la collecte de données et le traitement des données pour la cristallographie de série au synchrotron sur la ligne de faisceau I24 de Diamond. Il met l'accent sur la méthodologie pour mener des expériences avec des quantités d'échantillon limitées tout en assurant l'intégrité des puces.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie structurale
- Cristallographie
- Dynamique des protéines
Contexte
- La cristallographie de série au synchrotron (SSX) est un domaine en développement dans la cristallographie macromoléculaire.
- Elle convient aux expériences à faible dose et à température ambiante.
- La SSX permet des études dynamiques des protéines, permettant la visualisation de leurs actions.
- La SSX à cible fixe peut utiliser efficacement des quantités d'échantillon limitées.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la SSX à cible fixe sur la ligne de faisceau I24 de Diamond.
- Assurer une préparation et un alignement corrects des puces pour une collecte de données optimale.
- Mettre en évidence les différences dans le traitement des données par rapport aux données de rotation standard.
Méthodes utilisées
- Préparation de puces de silicium utilisant des techniques de film polyester et de scellage.
- Application de bouillie de microcristaux sur les puces et aspiration sous vide.
- Alignement des puces à l'aide d'une interface graphique utilisateur sur la ligne de faisceau.
- Visualisation et traitement des données en temps réel à l'aide de pipelines automatisés.
Résultats principaux
- Un alignement réussi des puces conduit à une collecte de données précise.
- Surveillance en temps réel des taux d'indexation et d'intégration pendant les expériences.
- La visualisation des paramètres de la maille unitaire révèle les polymorphes et les effets de chargement.
- Les études dynamiques fournissent des informations sur la fonctionnalité des protéines.
Conclusions
- Le protocole améliore l'efficacité des expériences de SSX à cible fixe.
- La manipulation et l'alignement corrects des puces sont essentiels pour une collecte de données réussie.
- Les études dynamiques utilisant la SSX peuvent considérablement faire progresser notre compréhension du comportement des protéines.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
