Agroinoculation directe de plants de maïs par injection avec le virus recombinant de la mosaïque de la queue de renard et le virus de la mosaïque de la canne à sucre Clones infectieux

Un protocole d’injection (agroinjection) à base d’Agrobacterium est présenté pour l’inoculation du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre dans les semis de maïs. L’inoculation de cette manière conduit à une infection virale, à un silençage génique induit par le virus des gènes marqueurs et à une surexpression virale de GFP.

Ce protocole permet l’inoculation de vecteurs viraux directement dans les plants de maïs qui peuvent être facilement appliqués dans la plupart des laboratoires sans avoir besoin d’équipement spécialisé coûteux. L’inoculation directe élimine l’utilisation d’un hôte alternatif comme source d’inoculum, ce qui permet d’économiser du temps et des ressources. Cette méthode pourrait être appliquée à d’autres vecteurs viraux, lignées de maïs et potentiellement à d’autres espèces monocotylédones.

Commencez par planter 1 à 2 graines de maïs dans le milieu de culture à base de tourbe dans de petits inserts placés à l’intérieur de plateaux. Placez les plateaux dans une chambre de croissance sous 16 heures par jour à 25 degrés Celsius et 8 heures par nuit à 22 à 25 degrés Celsius, ou dans une serre à 22 à 25 degrés Celsius avec des journées de 16 heures et des nuits de 8 heures. Arrosez régulièrement les plantes et fertilisez une fois par semaine avec 15-5-15 engrais liquides à une concentration de 330 parties par million.

Préparer agrobacterium pour injection en inoculant la souche agrobacterium contenant la construction virale souhaitée dans les milieux LB avec des antibiotiques. Ensuite, incubez la fiole ou les tubes à 28 degrés Celsius tout en agitant à 225 tr / min pendant 24 heures. Le lendemain, pastillez les bactéries par centrification à 4 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et jetez le surnageant.

Ensuite, lavez la pastille avec un millilitre d’eau désionisée. Remettez la pastille dans un millilitre de solution de sulfate de magnésium de 10 millimolaires et mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Ensuite, ajustez-le à 1.0.

Utilisez des plants de maïs âgés de 4 à 7 jours pour injecter agrobacterium. Assemblez la seringue et l’aiguille. Injectez doucement la suspension bactérienne à 2-3 millimètres au-dessus du nœud coléoptilulaire jusqu’à ce qu’elle remplisse le coléoptile ou soit visible dans la verticille, en attendant le stade de croissance des plantes.

Injectez tous les semis et changez la seringue et les aiguilles pour injecter chaque construction. Confirmez l’infection phénotypique en observant les lésions dues au silence des gènes témoins, de l’imitation de la lésion 22 ou de la phytoène désaturase sur les feuilles. Utilisez un dispositif d’imagerie par fluorescence pour un dépistage rapide des plantes et la microscopie à fluorescence pour détecter la présence de l’expression de GFP.

Effectuer une analyse de l’expression génique pour la détection moléculaire de l’infection. Extraire l’ARN total des feuilles des plantes infectées 14 à 21 jours après l’infection et synthétiser l’ADNc du premier brin comme décrit dans le manuscrit du texte. Effectuer une PCR par transcriptase inverse pour confirmer l’infection et déterminer l’intégrité du gène ou le fragment de gène d’intérêt à l’aide d’amorces spécifiques conçues pour différentes constructions virales.

Visualisez le produit PCR sur un gel d’agarose à 1% contenant une coloration d’acide nucléique pour déterminer la présence ou l’absence de virus et de gène ou de fragment de gène. Ce protocole a été utilisé pour insérer des virus recombinants conçus pour le gène dans les semis de maïs. Environ 12 jours après l’injection, des phénotypes silencieux ont été observés sur les feuilles sous forme de nécrose et de photoblanchiment.

La présence de construction dans les feuilles après l’infection a été détectée en observant l’expression de la protéine fluorescente verte sous une fluorescence à l’aide d’un filtre GFP différent. L’expression de la protéine fluorescente verte dans les feuilles infectées par le virus de la mosaïque de la queue de renard a été visualisée comme de petites zones ponctuées de fluorescence réparties sur les feuilles et comme de grandes plaques dans les feuilles infectées par le virus de la mosaïque de la canne à sucre. À l’aide de l’analyse de l’expression génique, l’infection systémique par le virus de la mosaïque de la queue de renard a été confirmée et un silençage génique ou une suppression de la phytoène désaturase et de la lésion imitant 22 a été observé.

La construction utilisée a également influencé l’efficacité de l’infection. Dans le cas de l’infection par le virus de la mosaïque de la queue de renard, le vecteur vide du virus de la mosaïque de la queue de renard et la lésion du virus de la mosaïque de la queue de renard imitant 22 avaient généralement les taux d’efficacité d’infection les plus élevés, soit 53 % et 54 % respectivement. Virus de la mosaïque de la queue de renard phytoène désaturase à une efficacité légèrement inférieure à 39% et virus de la mosaïque de la queue de renard protéine fluorescente verte, à l’efficacité la plus faible à 16%Pendant ce temps, l’efficacité de l’infection de la protéine fluorescente verte du virus de la mosaïque de la canne à sucre était de 8%Le moment et les symptômes seront basés sur le vecteur viral et la lignée de maïs utilisés.

L’absence d’un phénotype visuel peut ne pas signifier un manque de silence ou d’expression. Cette méthode peut également être appliquée aux technologies d’édition de gènes en améliorant les méthodes d’administration des ARN guides.