Name: À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Découvrez une méthode innovante de livraison de protéines in situ dans les tissus du maïs en utilisant Ustilago maydis comme cheval de Troie. Cette approche permet d'étudier la progression de l'infection et la fonction des protéines avec une haute résolution spatiale et temporelle.

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Les auteurs aimeraient remercier Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella et Armin Hildebrand pour la fourniture de matériel de laboratoire espace et. Le œuvre originale sur la méthode de cheval de Troie était soutenue par une bourse post-doc de Leopoldina et projet NSF IOS13-39229. Le travail présenté dans cet article a été soutenu par SFB924 (projets A14 et B14) de la DFG.

1. construction d’un cheval de Troie maydis U.
Remarque : Voir la Figure 1.
<ol><li>Amplifier un gène d’intérêt de maïs cDNA utilisant des amorces spécifiques de gènes et une relecture ADN polymérase. Cloner le principal produit PCR et transformer la construction de e. coli en suivant les instructions du fournisseur plasmide. Vérifiez le gène correct de la séquence d’intérêt par avant séquençage Sanger à utiliser pour les prochaines étapes de clonage. Remarque : Spécifications de PCR doivent être optimisées en raison des amorces séquence spécificités et conditions optimales ADN polymérase de la réaction.</li>
	<li>Conception des amorces pour amplifier le gène d’intérêt de maïs sans la séquence codant pour un peptide signal (SP).</li>
	<li>Étendre l’extrémité 5´ du primer inverse avec le motif RSIATA et un sous-officierje coupe site (tableau 1).</li>
	<li>Amplifier le gène d’intérêt de maïs avec une relecture ADN polymérase utilisant la PCR construction générée en 1.1 comme le modèle de la PCR.</li>
	<li>Double-digest du produit PCR et le plasmide de transformation U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, avec XbaI et Nco I. purifier le produit PCR digéré et les plasmide.</li>
	<li>Ligaturer le produit PCR digéré dans le p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha modèle à l’aide de T4 DNA ligase suivant les instructions de manufacturer´s. Transformer le produit de ligation dans e. coli et vérifier le gène correct de la séquence d’intérêt par Sanger séquençage.</li>
	<li>Linéariser la p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -gène d’intérêt-mCherry-Ha avec l’enzyme de restriction SspI et transformation ADN dans la de solopathogenic U. maydis souche SG20016. Isoler U. maydis transformants par sélection carboxin et confirmez isolés transformants par Southern blot analyse16. Remarque : Pour chaque protéine d’intérêt, au moins trois indépendants U. maydis transformants devraient être isolés et analysés pour estimer les effets du phénotype des mutations aléatoires fond.</li>
</ol>2. les milieux de Culture
<ol><li>Préparer YEPSlight liquide moyen16: extrait de levure 1,0 % (p/v), 0,4 % (p/v) Bacto-Peptone et 0,4 % (p/v) de sucrose. Dissoudre tous les composants de ddH2O et stériliser à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.</li>
	<li>Préparer les pommes de terre-dextrose-agar (PD-agar)20: gélose dextrosée à la pomme de terre de 3,9 % (p/v) et 1,0 % (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (c.f. 0,01 M). Mélanger tous les composants directement dans la bouteille pour l’autoclavage et ajouter ddH2O, plus une barre magnétique remuer. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.</li>
	<li>Préparer les PD-fusain agar20: gélose dextrosée de 3,9 % (p/v) de pommes de terre, charbon de bois de 1 % (p/v) et 1,0 % (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (c.f. 0,01 M). Mélanger tous les composants directement dans la bouteille pour l’autoclavage et ajouter ddH2O, plus une barre magnétique remuer. Autoclave à 121 ° C pendant 15 min ; autoclave à une température plus élevée, pour une plus longue période de temps ou à plusieurs reprises réduirait la qualité du milieu.</li>
</ol>3. Infection des plantes
<ol><li>Effectuer une analyse de maïs la division cellulaire en réponse à un cheval de Troie livré des protéines (p. ex., axée sur la microscopie cellulaire compter) au préalable. U. maydisinduite par la prolifération des cellules de maïs et de la formation de tumeurs ultérieures commence autour de 4-5 jours après l’infection. Les évaluations quantitatives de la maladie dépendent du tissu et doivent être effectuées de 6 à 14 jours après l’infection. Remarque : Des cultivars de maïs distinctes montrent différents niveaux de sensibilité à l’infection d’u. maydis . Maïs cvs W23, A188, silex de Gaspé, Early Golden Bantam ou Va35 montrent une sensibilité envers ce pathogène et sont donc des cultivars adaptés pour les études de cheval de Troie.</li>
	<li>Préparation de l’inoculum maydis U.
	<ol>
<li>Inclure la souche progénitrices SG200 comme témoin négatif dans toutes les expériences de cheval de Troie afin d’estimer les effets secondaires sur l’infection par la souche transgénique. Ici, utilisez une souche U. maydis exprimant une version non-sécrétée de la protéine d’intérêt comme témoin négatif. Toutefois, pour des raisons de praticabilité (p. ex., des projections plus grandes), la souche de l’ancêtre peut être le choix plus facile du contrôle.</li>
		<li>Avant de commencer l’expérience, estimer ce qui revient de la culture de l’infection est nécessaires. N’oubliez pas que l’infection de chaque plante nécessite 1 à 1,5 mL de suspension d’u. maydis dépendant du type de tissus de maïs. Remarque : Environ 1 mL d’une culture d’une nuit ne suffit pas pour la dilution à une OD600 de 0,2 à 20 mL de milieu delumière d’Yep, et 25 mL d’une culture de l’u. maydis avec un OD600 de 0,8 à 1,0 ne suffisent pas pour l’infection des plantes 13-16.</li>
		<li>Gratter U. maydis d’une gélose de PD sur plaque à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, ensemencer dans 5 mL de milieu delumière d’Yep et laisser la culture pousser à 28 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 16 h.</li>
		<li>Avant l’infection, examiner la culture de l’inoculation d’u. maydis par microscopie optique standard pour une bonne croissance et contamination bactérienne à un grossissement de X 400. Remarque : Dans une culture adéquate, seulement le champignon en forme de cigare est visible (Figure 2).</li>
		<li>Mélanger 900 µL d’Yep fraîchelumière avec 100µl de la culture au jour le jour et mesurer l' OD600 utilisant Yeplumière milieu comme un vide dans l’analyse du spectrophotomètre.</li>
		<li>Diluer la culture au jour le jour avec un milieu frais Yeplumière à une OD600 de 0,2 et laisser la culture pousser à 28 ° C sous agitation constante à 200 tr/min jusqu'à atteindre la phase de croissance logarithmique indiquée par une OD600 nm de 0,8 à 1,0. Remarque : U. maydis cellules dupliquer toutes les 2 h dans ces conditions, donc le désiré de l’OD600 est atteint après 4-5 h de culture.</li>
		<li>Récolter les cellules à OD600 de 0,8 à 1,0 par rotation à 3 000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Laver le culot cellulaire une fois avec les ddH2O. Pour cela, ajouter un volume de culture de ddH2O, spin avec 3000 x g pendant 10 min et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre le culot cellulaire soigneusement dans ddH2O à l’aide d’une pipette de verre de 20 mL, ajustant ainsi la finale de l’OD600 à 3.0 (pour un dosage de cheval de Troie) ou 1.0 (pour la notation de la maladie).</li>
	</ol></li>
	<li>Vérification le cheval de Troie : planta la sécrétion de la protéine de fusion maïs
	<ol>
<li>Infecter les jeunes plants de maïs avec un cheval de Troie souche17.</li>
		<li>Effectuer une imagerie microscopique des plantules infectées à 2 ou 3 jours après l’infection à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. À cette fin, l’accise un morceau rectangulaire de la feuille 1 cm en dessous du point d’injection, placez l’échantillon sur une lame de microscope et ajouter une goutte de ddH2O. Pour visualiser la protéine de fusion mCherry, exciter le spécimen à λ = 561 nm et l’émission record à λ = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Infection des feuilles de maïs adultes
	<ol>
<li>Cultiver des plants de maïs au stade des feuilles adultes (quelle feuille d’au moins 7 se développe au sein de la tige). Remarque : Ce stade est atteint après quatre semaines après semis en serre de 28 ° C jour/10 h, 14 h, rythme de nuit de 22 ° C à l’aide de CV W23. Durée peut varier selon les conditions maïs du cultivar et à effet de serre.</li>
		<li>Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.</li>
		<li>Appuyer sur la tige avec précaution pour localiser le tissu méristématique dans la tige. La base du méristème se distingue par une transition de tige plus difficile pour les tissus plus doux.</li>
		<li>Marquer le méristème sur la tige à l’aide d’un stylo.</li>
		<li>Injecter 1,5 mL de la culture U. maydis 1 cm au-dessus du méristème caulinaire ou le méristème de l’inflorescence.</li>
		<li>Le taux de symptômes de la maladie à 6 et 12 jours après l’infection.</li>
	</ol></li>
	<li>Infection des glands
	<ol>
<li>Cultiver les plants de maïs jusqu'à atteindre le stade de gland. Remarque : Une chronologie détaillée du développement anthère et gland en maïs CV W23 a été précédemment décrit1819. Glands contenant pré méiotiques anthères sont très vulnérables à l’infection d’u. maydis ; dans le CV de maïs W23 glands sont la taille de 4 à 7 cm.</li>
		<li>Appuyer sur la tige avec précaution pour localiser le gland à la tige.</li>
		<li>Marquer la pointe et la base de la frange sur la tige à l’aide d’un stylo.</li>
		<li>Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.</li>
		<li>Injecter 1,5 mL de l’inoculum autour du gland. Afin d’assurer une distribution uniforme de l’inoculum, lentement verser 0,5 mL de chaque à la pointe, la partie centrale et la base de la panicule marquée avec le stylo.</li>
		<li>Taux de symptômes de la maladie à 10 jours après l’infection.</li>
	</ol></li>
	<li>Infection des oreilles Remarque : développement des tissus de l’oreille est différente dans les différents cultivars de maïs et de conditions de serre et doit être soigneusement observé avant l’inoculation. Oreilles commençant à dépasser les soies sont très sensibles à l’infection par U. maydis .<ol>
<li>Transférer la culture U. maydis (voir 3.2.9) dans une seringue de 3 mL avec une seringue hypodermique 20 x 1.</li>
		<li>Injecter l’aiguille de l’inoculation dans l’espace entre les feuilles de balle aussi profondément que possible sans blesser l’oreille.</li>
		<li>Communiqué de 1,5 mL de l’inoculum autour de l’oreille.</li>
		<li>Retirer la seringue et l’aiguille et masser soigneusement la cob pour distribuer la solution U. maydis également.</li>
		<li>Taux de symptômes de la maladie à 14 jours après l’infection.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmer la viabilité de l’inoculum maydis U.
	<ol>
<li>Déposer 10 µL de l’inoculum sur une gélose au fusain de PD et incuber à température ambiante pendant 2 jours. Remarque : Si le respectifs la culture U. maydis est capable de forment des filaments, mycélium blanc moelleux devient visible (Figure 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Recherche sur les cultures modernes exige des protocoles pour l’analyse moléculaire sur la génétique et des niveaux de protéine. L’accessibilité génétique par transformation n’est pas disponible ou inefficaces et fastidieuse pour la plupart des espèces de cultures telles que le maïs. En outre, des outils génétiques fiables tels que les systèmes de journaliste promoteur sont rares, ce qui rend difficile d’étudier la fonction des protéines in situ avec une haute résolution spatio-temporelle à sites tissulaires dis...

Le pathogène biotrophe Ustilago maydis est l’agent causal du maïs charbon maladie1. Il infecte tous les parties aériennes de maïs ayant pour résultat les grosses tumeurs qui renferment des spores mélanisées, noir. Au niveau mondial, U. maydis est estime susceptible de causer une perte annuelle d’environ 2 % du rendement du maïs, tandis que les tumeurs sont appréciés comme un délice gastronomique au Mexique. Infection des plantes est initiée par un appressorium qui sécrète des enzymes lyse de la paroi cellulaire pour pénétrer dans la première couche de cellules épidermiques de maïs. Partir d’un site d’infection primaire, U. maydis se développe dans les cellules et entre les cellules, envahir les cellules d’une à deux couches chaque jour1,2. Résultats infection réussie dans l’hypertrophie de plante qui se transforme en tumeurs visibles sur cinq jours après l’infection1,3,4. Durant tous les stades de l’infection, les hyphes fongiques invaginent la membrane de cytoplasme de plante sans aucun contact direct au cytoplasme hôte1,2. L’espace apoplasme serré entre les hyphes infectant et la membrane plasmique de la plante est réputé être le site interactif de l’hôte/pathogène, appelé la zone d’interaction biotrophe. Afin de surmonter le système immunitaire inné de plante, U. maydis sécrète un tableau des protéines effectrices dans biotrophe interaction zone1. Certains effecteurs sont absorbés par les cellules végétales, tandis que d’autres restent dans l’interaction biotrophe zone5,6,7,8. Un effecteur apoplastique est UmPit2, qui interagit avec des protéases apoplastique maïs pour éviter la sortie de la signalisation du peptide ZmZIP1 de ZmPROZIP par apoplastique protéase activité9,10.
Au cours des dernières décennies, U. maydis est devenu non seulement un modèle pour la génétique des champignons dans l’interaction plante-pathogène, mais aussi un outil précieux en matière de biotechnologie en raison d’un cycle de vie bien compris, facilité d’accès génétique et expression hétérologue de sécrétée protéines11,12,13. Signaux pour la sécrétion de ces deux protéines conventionnelles et non conventionnelles ont été déterminées en permettant le contrôle des modifications post-traductionnelles14. Récemment, U. maydis a été employée comme un outil de cheval de Troie pour étudier petit, sécrétée protéines de maïs en situ15. L’approche d’un cheval de Troie a été utilisé avec succès pour analyser la fonction de la protéine de petite, sécrétée ZmMAC1 qui est impliqué dans le développement de l’anthère. ZmMAC1 induit la division Péricline de cellules pluripotentes et la spécification des cellules nouvellement formé15sort des cellules. Selon la même méthode, la fonction biologique du peptide associés aux dommages maïs ZmZIP1 a été révélée. U. maydis sécrétant le maïs que zmzip1 entraîné avec facultés affaiblies tumeur formation10. Ainsi, le cheval de Troie approche représente un itinéraire alternatif précieux à la protéine de situ études à haute résolution spatio-temporelle qui ne fait ni exiger génération de lignes de transformation de maïs stable ni infiltration des tissus avec façon hétérologue protéines exprimées et purifiées. En particulier, la stratégie du cheval de Troie permet la sécrétion d’une protéine hétérologue dans l’apoplaste maïs et une comparaison directe des infectés contre les cellules végétales non infectés dans le même tissu.
Ce protocole illustre les principales étapes pour générer une souche de cheval de Troie d’u. maydis afin d’étudier une protéine d’intérêt. Il comprend également des informations précises sur les procédures de l’infection de trois types de différents tissus de maïs (les feuilles adultes, les glands et les oreilles) avec U. maydis, qui est une condition sine qua non pour l’étude de la fonction spatio-temporelle de l’infection de progression et de protéines dans ces tissus de cible. Aucune précisions ne sont donnée sur maïs amplification génique et microscopiques imaging techniques, étant donné que ces étapes sont spécifiques à la cible et instrument-dépendante. Ainsi, le présent protocole s’adresse aux utilisateurs expérimentés des techniques standard de biologie moléculaire.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 2 ml&nbsp ;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 aiguille hypodermique</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp ;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>ADNc du maïs</td><td></td><td></td><td>du tissu de maïs exprimant le gène de l’intervalle</td></tr><tr><td>Charbon de bois</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> confocal à balayage laser <td>Utilisation de l’équipement disponible localement</td></tr><tr><td>Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur-agitateur réglé à 28 &deg ; C, 200 tr/min</td><td></td><td></td><td>utiliser l’équipement disponible localement</td></tr><tr><td>Microscope optique avec grossissement</td><td></td><td></td> de 400x <td>Utiliser l’équipement disponible localement</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>veuillez contacter l’auteur correspondant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur (verre, pointe longue)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>peut être remplacée par d’autres vecteurs de clonage de base comme pENTR ou pJET</td></tr><tr><td>Potato Dextrose Agar&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie pen</td><td></td><td></td><td>Utilisation d’un équipement disponible localement</td></tr><tr>Utilisation <td>d’un</td> <td>spectrophotomètre</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure&nbsp ;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

À l’aide d’ustilago maydis comme un cheval de troie pour la livraison de la protéine maïs in situ

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspiré par le mythe de cheval Troie Homer´s, nous avons conçu le pathogène maïs Ustilago maydis pour fournir des protéines sécrétées dans l’apoplaste maïs permettant une analyse phénotypique in vivo. Cette méthode ne s’appuie pas sur la transformation de maïs, mais exploite la génétique microbienne et des capacités sécrétoires des agents pathogènes. Il permet aux présentes, inspection in vivo livré des protéines sécrétées à haute résolution spatio-temporelle à différents types de tissus et de sites d’infection. La stratégie du cheval de Troie peut être utilisée en complément transitoirement maïs phénotypes de perte de fonction, afin de caractériser sur le plan fonctionnel des domaines protéiques, pour analyser les effets de la protéine hors cible, ou d’étudier un surdosage onside protéine, ce qui en fait un outil puissant études de protéine dans le système de récolte de maïs. Cet ouvrage contient un protocole précis sur la façon de générer une souche de cheval de Troie suivie de protocoles normalisés de l’infection à appliquer cette méthode à trois types de différents tissus de maïs.

Des constructions pour des expériences de cheval de Troie U. maydis sont clonées dans le plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gène d’intérêt-mCherry-Ha. Le maïs gène d’intérêt est fusionné à un journaliste de fluorescence mCherry et un épitope HA-tag. L’expression de la protéine de fusion est sous contrôle du promoteurpit2 U. maydis mu qui est spécifiquement acti...

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

L’étude des processus sur les niveaux génétiques et protéiques est cruciale dans la recherche sur les cultures. Notre approche permet l’inspection des protéines de labyrinthe sécrétées avec la résolution temporelle spatiale la plus élevée à différents côtés et tissus d’infection. La méthode cheval de Troie explore des capacités de sécrétion automates utiles.Il contourne les transformations de labyrinthe longues et difficiles, et facilite des études détaillées sur les protéines sécrétées dans l’appelplatz labyrinthe. Informations détaillées sur l’infection appropriée des feuilles de labyrinthe ajoutées, glands et oreille. Et montre l’étude réussie de la progression de l’infection et la fonction protéique dans le tissu cible.Isabell Fiedler, étudiante diplômée du laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer l’expérience, grattez Eumadous à partir d’une plaque de pediatr à l’aide d’une pipette pasteur stérile. Inoculer 5 millilitres de YEPS Light Medium avec Eumadous.Cultivez la culture à 28 degrés Celsius, avec des secousses constantes à 200 rpm pendant 16 heures. Le lendemain, mélangez 900 microlitres de lumière YEPS fraîche avec 100 microlitres de la culture nocturne. Mesurez l’OD-600 à l’aide du milieu lumineux YEPS comme blanc dans l’analyse du spectrophotomètre.Diluer la culture de nuit avec frais YEPS Light Medium à un OD-600 de 2. Laissez la culture croître à 28 degrés Celsius avec des secousses constantes à 200 rpm, jusqu’à ce qu’elle atteigne la phase de croissance du rondin moyen, indiquée par un OD-600 de 8 à 1,0. Après l’incubation, récolter les cellules en les faisant tourner à 3000 fois chi pendant 10 minutes.Jeter le surnatant. Ensuite, lavez la pilette cellulaire une fois avec 1 volume de culture de DDH2O. Faire tourner les cellules à 3000 chi temps pendant 10 minutes et jeter le supernatant.Ensuite, suspendez soigneusement la pilette cellulaire dans DDH2O, à l’aide d’une pipette en verre de 20 millilitres. Ajustant ainsi l’OD-600 final à 3.0 pour un essai de cheval de Troie ou 1.0 pour l’évaluation de la maladie. Cultivez les plantes du labyrinthe à un stade de feuilles adultes, où au moins la feuille 7 pousse dans la tige.Ensuite, transférez la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille bi une hypodermique de calibre 20. Appuyez soigneusement sur la tige pour localiser le tissu de tige miroir. La base de la tige miroir peut être distinguée par une transition de la tige plus dure aux tissus plus mous.Marquez la tige miroir sur la tige à l’aide d’un stylo. Injectez 1,5 millilitres de culture Eumadous 1 centimètre au-dessus de la tige du miroir shoot ou de la tige miroir d’inflorescence. Une fois que les plantes du labyrinthe atteignent le stade du gland, appuyez soigneusement sur la tige pour localiser le gland dans la tige.Marquez la pointe et la base du gland sur la tige à l’aide d’un stylo. Transférer la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille hypodermique bi une de calibre 20 pour injecter un total de 1,5 millilitres de l’inoculum autour du gland. Pour assurer une répartition égale de l’inoculum, placez lentement 5 millilitres à la pointe, au milieu et à la base du gland marqué du stylo.Transférer la culture eumadous dans une seringue de 3 millilitres avec une aiguille hypodermique bi une de calibre 20. Injecter l’aiguille d’inoculation dans l’espace entre les feuilles d’enveloppe aussi profondément que possible sans blesser l’oreille, puis libérer 1,5 millilitres de l’inoculum autour de l’oreille. Ensuite, retirez la seringue et l’aiguille et massez soigneusement l’épi pour distribuer la solution Eumadous également.Déposer 10 microlitres d’inoculum sur une plaque d’auger au charbon de bois. Puis incuber à température ambiante pendant 2 jours. Hyphae sécrétant ZM Mach1 sont entourés de signal fluorescent et cerise.En revanche, les hyphes nonsecreting montrent seulement le signal fluorescent dans le cytoplasme fongique. Une localisation inappropriée du gland ou une répartition inégale de l’inoculum peut entraîner une infection non infectée du gland ou seulement une infection partielle du gland par rapport à la distribution uniforme. La souche solo pathogène Trojan Horse Progenester SG-200, cultivé sur la tarière de charbon de bois, forme des filaments de peluches blanches sur la plaque comme indiqué.Alors que la souche eumadous FB1 nécessite un accouplement avant la formation de filaments infectieux. Après l’infection, la réponse possible des signes de la protéine hépatique cheval de Troie peut être analysée en utilisant diverses méthodes, y compris les cotes de la maladie ou l’imagerie microscopique. Pour de nombreux agents pathogènes, la transformation et la sécrétion sont bien comprises et peuvent être explorées de la même manière.Par conséquent, ils permettent l’étude de l’hôte, qui ne sont pas sensibles à la transformation.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Source : Beernink, B. M. et al. Agroinoculation directe des semis de maïs par injection avec des clones infectieux du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre. J. Vis. Exp. (2021)Cette vidéo montre la délivrance médiée par Agrobacterium de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour la mise en silence génétique. Il décrit le processus d’infection à Agrobacterium , la propagation systémique du virus et les changements phénotypiques liés...

Délivrance médiée par Agrobactérie de clones viraux recombinants dans les semis de maïs pour le silence génétique

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite.  La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Les gènes morphogènes végétaux peuvent être utilisés pour améliorer la transformation génétique des génotypes récalcitrants. Décrit ici est un protocole de transformation génétique Agrobacterium-négocié(QuickCorn) pour trois lignées de maïs de maïs public importants consanguins.

Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

Un protocole d’injection (agroinjection) à base d’Agrobacterium est présenté pour l’inoculation du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre dans les semis de maïs. L’inoculation de cette manière conduit à une infection virale, à un silençage génique induit par le virus des gènes marqueurs et à une surexpression virale de GFP.

Agroinoculation directe de plants de maïs par injection avec le virus recombinant de la mosaïque de la queue de renard et le virus de la mosaïque de la canne à sucre Clones infectieux

Ici, nous présentons un protocole à haut débit pour transfecter transitoirement des millions de protoplastes de maïs afin de tester de grandes banques de plasmides dans des cellules mésophylles de maïs.

Transfection évolutive de protoplastes mésophylles de maïs

séquençage cellulaire unique est un outil de plus en plus populaire et accessible pour aborder les changements génomiques à haute résolution. Nous fournissons un protocole qui utilise le séquençage d'une cellule unique pour identifier des altérations du nombre de copies dans des cellules individuelles.

Détection de Copy Number Transformations Utilisation unique cellule de séquençage

Une stratégie pour générer des mutations dans les gènes d’histones à leur emplacement endogène chez Saccharomyces cerevisiae est présentée.

Targeted<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenèse de Histone gènes dans la levure bourgeonnante

Nous décrivons ici la livraison des micro-ARN, à l’aide d’un sérotype de virus adeno-associé recombinant 9 dans un modèle murin d’une maladie neuromusculaire. Une seule administration périphérique chez les souris a entraîné surexpression de miRNA soutenue dans les muscles et les neurones moteurs, fournissant l’occasion de l’étude miRNA fonction et thérapeutiques potentiels in vivo.

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

Découvrez une méthode innovante de livraison de protéines in situ dans les tissus du maïs en utilisant Ustilago maydis comme cheval de Troie. Cette approche permet d'étudier la progression de l'infection et la fonction des protéines avec une haute résolution spatiale et temporelle.

À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

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