Un essai de liaison à haut débit CMH II pour l'analyse quantitative du peptide épitopes

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la liaison de peptides courts avec deux protéines immunitaires du CMH humain à l’aide d’un test à haut débit de 3 à 84 puits. Pour ce faire, il effectue d’abord des tests de liaison de compétition en phase de solution avec les peptides d’intérêt. Dans la deuxième étape, les deux complexes peptidiques équilibrés du CMH sont capturés à l’aide d’un anticorps anti-CMH deux immobilisés sur des plaques ELIZA à haute liaison.

Ensuite, les complexes capturés sont incubés avec la streptavidine marquée à l’opium, puis la streptavidine non liée est emportée et l’opium capturé est activé. En fin de compte, la fluorométrie résolue en temps peut être utilisée pour quantifier les niveaux de peptide de contrôle du CMH à deux. Cette méthode peut fournir des informations préliminaires sur le potentiel immunogène des protéines cibles.

Il est particulièrement utile pour valider la sortie des prédicteurs in silico, Commencez la procédure en ajoutant 25 microlitres de solution d’anticorps L 2 43 fraîchement diluée dans chaque puits d’un 3 84. Une plaque ELIZA blanche à haute reliure a scellé la plaque avec un film de polyester et l’a incubée pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, en commençant par un stock de 10 millimolaires de chaque test.

Le peptide et le DMSO fabriquent les séries de dilution suivantes et le tampon phosphate de citrate à l’aide de 3 plaques de polypropylène à 84 puits. Notez qu’une plaque de polypropylène complète de 3 à 84 puits nécessite trois plaques EIA distinctes, comme illustré. Ensuite, diluez les deux solutions mères du CMH sélectionnées à une concentration de 101 nanomolaires dans un tampon de réaction à l’aide d’un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, diluez le peptide de contrôle de 20 micromolaires à un rapport de un à 100 dans le mélange maître MHC deux fraîchement préparé et ajoutez 21,5 microlitres du mélange maître CMH deux avec peptide témoin au témoin positif. Bien de la plaque de polypropylène à 3 84 puits, ajoutez le mélange maître CMH à deux contenant le peptide de contrôle à chacune des dilutions de peptides d’essai dans un rapport de un à un pour créer la réaction de liaison à ce moment également. Enfin, scellez la réaction de liaison avec un film de polyester et incubez la plaque pendant 12 à 24 heures dans un incubateur non contrôlé par dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius sans secouer.

Le lendemain, diluez les puits de réaction de liaison dans le 3 84. Plaque de puits à un rapport de un pour un avec tampon de neutralisation. Ensuite, lavez la plaque Eliza trois fois avec 60 microlitres par puits de PBS 0,05 % entre 20 transfert suivant, 25 microlitres de chaque solution de réaction de liaison neutralisée de la plaque de 3 84 puits en triple exemplaire jusqu’à l’anticorps enrobé 3 84.

Eh bien, la plaque Eliza incube ensuite la plaque ELIZA recouverte d’un film polyester à quatre degrés Celsius pendant la nuit après l’incubation. Lavez la plaque ELIZA trois fois comme nous venons de le démontrer, puis ajoutez 25 microlitres d’opium streptocoque fraîchement dilué à chacune. Bien incuber la plaque recouverte d’un film polyester dans l’obscurité à température ambiante pendant une heure.

Pendant l’incubation, amenez 10 millilitres de solution d’enrichissement par plaque à température ambiante également dans l’obscurité après une heure, lavez la plaque ELIZA comme indiqué, puis ajoutez 25 microlitres de solution d’enrichissement dans chaque puits et incubez la plaque recouverte d’un film polyester pendant 10 à 15 minutes dans l’obscurité. Enfin, lisez la fluorescence avec un lecteur de plaques fluorescentes à résolution temporelle avec réglages d’opium. Dans cette expérience représentative, une séquence peptidique mature de l’entérobactérie Cloe Cloe P neuf neuf bêta-lactamase a été analysée pour détecter des liants peptidiques présumés à l’allèle deux du CMH.

DRB un quinze oh cent dix-sept non ou peptides ont été identifiés avec un résidu d’ancrage P un obligatoire à la première position qui est requis pour la liaison du CMH deux à un seuil de 5 % seulement. Les peptides dont l’indice est supérieur ou égal à 2,6 sont probablement des liants. Ainsi, au seuil de 5 %, seuls les 11 premiers peptides sont censés se lier au CMH deux, DRB 1, 15, 0, 1.

Un panel représentatif d’épitopes prédits a été sélectionné pour l’analyse dans cet essai de liaison au CMH deux. Des fragments de peptides bêta-lactamases de ces 15 résidus ont été synthétisés chimiquement, de sorte que deux épitopes présumés du CMH nonamère étaient intégrés dans leurs fragments de protéines synthétiques. La capacité de ces peptides synthétiques à concurrencer un peptide de contrôle de la protéine B basique de la myéline biotinylée pour la liaison au CMH deux DRB 1 15 0 1 a ensuite été analysée comme nous venons de le démontrer.

Les courbes de liaison compétitives pour les peptides synthétiques sont illustrées ici. Les valeurs IC 50 ont été calculées en ajustant les données de transformation logarithmique à l’aide de la fonction d’ajustement non linéaire de liaison compétitive d’un seul site du prisme. Comme le montre le tableau comme le montre le graphique, les peptides se répartissent naturellement en trois groupes, les liants forts avec une IC 50 inférieure à une micromolaire, les liants modérés avec une IC 50 supérieure ou égale à une micromolaire, mais inférieure à 100 micromolaires, et les liants faibles avec une IC 50 supérieure ou égale à 100 micromolaires après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de l’immunologie moléculaire et de la conception biothérapeutique pour explorer plus en profondeur les principaux événements de reconnaissance moléculaire qui sous-tendent les réponses immunitaires antiprotéiques chez les patients humains.