Name: Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Découvrez l'isolement de champignons entomopathogènes à partir d'échantillons de sol en utilisant Tenebrio molitor comme appât. Cette méthode combine criblage de pathogénicité, thermotolérance et production de conidies pour sélectionner des isolats fongiques à haute virulence destinés au contrôle biologique des ravageurs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été soutenue par la subvention 109-2313-B-005 -048 -MY3 du ministère de la Science et de la Technologie (MOST).

REMARQUE : L’organigramme complet est illustré à la figure 1.
1. Isolement et sélection des champignons entomopathogènes potentiels (FPE)
<ol><li>Prélever l’échantillon de sol<ol>
<li>Retirez 1 cm du sol de surface, puis recueillez le sol à une profondeur de 5 à 10 cm à l’aide d’une pelle de chaque site d’échantillonnage. NOTE : Les sites d’échantillonnage seraient des montagnes, des forêts ou des zones peu peuplées afin d’éviter la contamination des souches de FPE pulvérisées artificiellement. Assurez-vous que les zones de collecte des échantillons de sol sont recouvertes de mauvaises herbes à la surface. Un sol sec ou humide ne convient pas à cette expérience.</li>
		<li>Consignez les détails de chaque site d’échantillonnage, y compris le GPS, l’altitude, le type de champ, la température annuelle, les précipitations annuelles, la période de collecte (saison), le type de sol et la valeur du pH.</li>
		<li>Prélever 100 g de l’échantillon de sol dans un sac en plastique et le maintenir à température ambiante s’il est soumis au protocole d’isolement fongique en laboratoire dans les 3 heures. REMARQUE: Si l’échantillon ne peut pas être utilisé dans les 3 heures, stocker le sol à température ambiante dans des conditions sombres. Si l’expérience n’est pas effectuée immédiatement, l’échantillon de sol peut être conservé à 4 °C pendant 1 semaine jusqu’au début du protocole18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Appâter et isoler l’EPF avec le ver de farine (Tenebrio molitor)<ol>
<li>Placez 100 g de l’échantillon de sol dans un gobelet en plastique (diamètre du bouchon = 8,5 cm, hauteur = 12,5 cm), puis placez 5 vers de farine à la surface du sol à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 semaines. REMARQUE: D’autres types de récipients en plastique peuvent également être utilisés. Si les sols sont trop secs (fissurés ou sablonneux), vaporisez du ddH2O stérilisé (environ 5-10 mL) sur les sols. La longueur du corps d’environ 2,5 cm (14e stade) des larves de T. molitor aide à isoler les champignons20.</li>
		<li>Observer et enregistrer quotidiennement les larves pour la mortalité et la mycose; garder les larves mortes dans la tasse jusqu’à 2 semaines pour l’isolement fongique. REMARQUE: La spore de conidies fongiques dans les échantillons de sol se fixera aux larves de vers de farine au cours du processus ci-dessus. La mycose fongique sera observée à mesure que les hyphes se développent à partir de la membrane intersegmentale, puis tout le corps sera recouvert de mycélium. La sporulation commencera après 7 jours et la couleur de l’infection fongique changera en couleur de la masse de conidies.</li>
		<li>Transférez les insectes morts sur un banc propre et utilisez un cure-dent stérile pour recueillir les conidies. Stroyez-les sur une plaque de milieu de gélose au dextrose Sabouraud (1/4 SDA) (55 mm) en laboratoire21. Incuber la plaque de culture à 25 °C pendant 7 jours pour obtenir la culture primaire de champignons. NOTE: La plaque 1/4 SDA est préparée comme suit: Mélanger 1,5 g de bouillon de dextrose Sabouraud et 3 g de gélose dans 200 mL de H2O, puis stériliser pendant 20 min. Aliquote 1/4 SDA dans chaque boîte de Petri de 55 mm avant solidification. Les plaques SDA 1/4 solidifiées sont conservées à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
		<li>Retracez chaque champignon de culture primaire sur une plaque SDA de 55 mm 1/4 dans un écoulement laminaire et incubez la plaque de culture à 25 °C pendant 7 jours pour obtenir des colonies uniques de champignons.</li>
		<li>Répétez ce ré-isolement ~ 2-3 fois et observez en microscopie optique pour obtenir des colonies fongiques morphologiques uniques et pures. REMARQUE: Isolez tout EPF à l’aide de T. molitor-bait et conservez comme décrit dans la section suivante. La séparation, la conservation, la culture pure et les stries doivent être effectuées dans un flux laminaire dans les sections suivantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Stocker les isolats EPF<ol>
<li>Coupez 3 des blocs de gélose de 5 mm au bord de chaque plaque de culture fongique pure isolée avec un foreur de liège et placez-les dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL comme réplique. REMARQUE: Trois répliques pour chaque isolat fongique sont recommandées pour le stockage des souches EPF après le 2e test de virulence. L’identification moléculaire est également recommandée si l’espace de stockage est limité.</li>
		<li>Ajouter 250 μL de solution tensioactive à 0,03 % (table des matériaux) et 250 μL de glycérol à 60 % dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une micropipette; puis, vortex pendant 10 s.</li>
		<li>Scellez le tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec un film de paraffine et prérefroidissez-le dans un réfrigérateur à -20 °C pendant 24 h. Ensuite, transférez les stocks fongiques prérefroidis dans un réfrigérateur à -80 °C pour la cryoconservation. NOTE: Des plaques de culture fongique extra pures (à l’exception des échantillons cryoconservés) ont été utilisées à la section 1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>1er dépistage de pathogénicité pour les isolats fongiques<ol>
<li>Placer cinq larves de T. molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure à 25 °C.</li>
		<li>Observez et enregistrez la mycose et la mortalité pendant 10 jours. Sélectionnez l’isolat fongique pour une analyse plus approfondie. REMARQUE: Les isolats fongiques causant une mortalité de 100% sont sélectionnés pour le 2ème test de virulence afin de confirmer leur virulence aux larves de T. molitor . Alternativement, le chercheur peut ajuster les critères selon sa propre étude.</li>
	</ol></li>
	<li>2ème test de virulence des isolats fongiques REMARQUE: Sur la base du 1er crible de pathogénicité, récupérer les isolats fongiques sélectionnés à partir de -80 °C pour le 2ème test de virulence. Le but du 2ème test de virulence est de quantifier la pathogénicité des isolats fongiques sélectionnés après le 1er tour de dépistage.<ol>
<li>Récoltez les conidies de chaque isolat fongique en vortexant pendant 1 min et comptez le nombre de conidies à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
		<li>Ajuster la suspension de conidies à une concentration de 1 x 107 conidies/mL dans une solution de tensioactif à 0,03 % (tableau des matériaux).</li>
		<li>Étaler 10 μL de la suspension fongique sur des plaques SDA de 55 mm 1/4 et croître pendant 7 jours à 25 °C dans l’obscurité.</li>
		<li>Placer cinq larves de T. molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure (environ 6 x 107 conidies). Sceller les plaques avec un film de paraffine et incuber à 25 °C dans l’obscurité.</li>
		<li>Observez et enregistrez la mycose et la mortalité pendant 10 jours.</li>
		<li>Répétez le test (de l’étape 1.51 à l’étape 1.5.5) en trois exemplaires pour chaque isolat fongique. REMARQUE: Les isolats fongiques causant une mortalité de 100% sont sélectionnés pour le 3ème test de virulence afin de confirmer leur virulence à cibler le ravageur.</li>
	</ol></li>
	<li>3ème test de virulence d’isolats fongiques pour ravageur cible (Spodoptera litura à titre d’exemple)<ol>
<li>Répétez les étapes 1.5.2 à 1.5.6 avec des isolats sélectionnés de la 2e virulence pour tester la virulence contre les ravageurs cibles.</li>
		<li>Calculer le LT50 de chaque isolat fongique22. REMARQUE: Le LT50 de chaque isolat fongique a été calculé à l’aide de modèles linéaires généralisés (GLM) à l’aide de R studio (version 3.4.1); la distribution d’erreur quasi-concriomiale et une fonction de liaison de journal peuvent être utilisées pour tenir compte de la surdispersion.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Identification moléculaire de l’EPF
<ol><li>Extraction de l’ADN génomique fongique<ol>
<li>Collectez environ 1 cm2 d’EPF de la plaque 1/4 SDA de 7 jours.</li>
		<li>Extrayez l’ADN génomique fongique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique fongique conformément aux instructions du fabricant23 (Table des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplification par PCR et séquençage de l’ADN<ol>
<li>Amplifier la région ITS fongique par PCR de l’échantillon d’ADN21 à l’aide du PCR Master Mix (2x), de l’ensemble d’amorces ITS1F/ITS4R24 (Tableau 1) avec le programme pcR suivant : 94 °C pendant 1 min, puis 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 1 min, suivi d’une extension finale de 7 min à 72 °C. REMARQUE: L’ensemble d’amorces ITS1F/ITS4R est destiné à l’identification au niveau du genre.</li>
		<li>Séquencer la PCR par service de séquençage commercial.</li>
		<li>Utilisez la recherche NCBI BLAST pour des champignons similaires dans la base de données NCBI et sélectionnez les espèces de type fongique relatif pour l’analyse phylogénétique. REMARQUE: Les espèces fongiques appartenant au genre Metarhizium ou Beauveria doivent être identifiées plus en détail au niveau de l’espèce avec l’ensemble d’amorces tef-983F/tef-2218R25 (répétez les étapes 2.1.1 à 2.2.3). Pour les champignons qui n’appartiennent pas aux genres Metarhizium ou Beauveria, d’autres marqueurs moléculaires peuvent être utilisés pour identifier l’espèce, notamment l’ADN lyase (APN2), la tubuline bêta (BTUB), la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (RPB1), la deuxième plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (RPB2) et la partie 3' du facteur d’allongement de traduction 1 alpha (TEF)25,26 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse phylogénétique<ol>
<li>Utilisez ClustalX 2.1 software27 pour aligner les séquences multiples des étapes 2.2.2 et 2.2.3. Découpez manuellement la région des séquences conservées avec GeneDoc28.</li>
		<li>Effectuez l’analyse phylogénétique par MEGA7 software29 sur la base des méthodes d’évolution minimale (ME), de voisinage (NJ) et de probabilité maximale (ML). REMARQUE: L’exécution des trois méthodes peut aider à confirmer et à conclure avec précision l’état de la classification. Les isolats fongiques criblés par le 1er crible de pathogénicité sont utilisés pour l’identification moléculaire au niveau du genre. Les isolats fongiques examinés par le 2ème test de virulence sont utilisés pour l’identification moléculaire et morphologique au niveau de l’espèce.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identification morphologique du FPE
<ol><li>Observation de la morphologie de la colonie fongique<ol>
<li>Utilisez un appareil photo pour capturer la croissance de la colonie de culture fongique pendant 7 jours et enregistrez la croissance, la forme (moelleuse, ferme) et la couleur des colonies.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observation des conidies et des conidiophores<ol>
<li>Gratter les conidies de la colonie fongique de culture pure avec une boucle d’inoculation et transférer les spores dans une lame de verre avec une solution Tween 80 à 0,1%. Ensuite, couvrez avec un couvercle pour l’observation microscopique légère des conidies.</li>
		<li>Utilisez un scalpel pour couper un bloc de gélose de 5 mm2 du brin hyphale au bord de la colonie fongique, puis transférez le bloc de gélose sur une lame de verre.</li>
		<li>Effectuez le nettoyage comme suit: Ajouter la solution Tween 80 à 0,1% sur le bloc de gélose avec un compte-gouttes en plastique et laver la plupart des conidies en excès à l’aide d’une pince à épiler. Ensuite, recouvrez-le d’un couvercle pour l’observation microscopique à la lumière. REMARQUE: 0,1% Tween 80 peut être remplacé par un autre tensioactif plus puissant (Table des matériaux) en fonction des espèces fongiques et de l’hydrophobicité.</li>
		<li>Mesurez et enregistrez la largeur et la longueur des conidies et des conidiophores pour comparer les différences entre différents isolats fongiques.</li>
		<li>Utilisez le test ANOVA de Welch et le test Games-Howell (test post-hoc) pour analyser la largeur et la longueur conidiales de chaque souche à l’aide de R studio (version 3.4.1). REMARQUE: L’analyse des données des caractères morphologiques peut être ajustée par cas. Les isolats fongiques criblés avec le 3ème test de virulence sont utilisés pour la caractérisation physiologique et le classement ECN dans les sections 4 et 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Étude de la productivité condescendante et de la thermotolérante
<ol><li>Essai de production conique<ol>
<li>Cultiver l’isolat fongique sélectionné sur un milieu 1/4 SDA à 25 ± 1 °C dans l’obscurité pendant 10 jours.</li>
		<li>Préparer 1 mL de la suspension conidiale de l’isolat fongique dans une solution de tensioactif à 0,03 % et ajuster à 1 x 107 conidies/mL comme décrit ci-dessus.</li>
		<li>Laisser tomber trois gouttelettes de 10 μL de suspension conidiale sur 1/4 de SDA et incuber à 25 °C dans l’obscurité pendant 7, 10 et 14 jours pour compter la sporulation des champignons. REMARQUE: 10 μL est le meilleur volume pour collecter le bloc de 5 mm avec une sporulation fongique uniforme après la croissance fongique pendant 7 à 14 jours.</li>
		<li>Utilisez l’agrile du liège pour détacher un bloc de gélose de 5 mm du centre de la colonie et transférez-le dans 1 mL de solution tensioactive à 0,03 % (table des matériaux) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à chaque point temporel.</li>
		<li>Vortex le tube à 3 000 tr/min à température ambiante pendant 15 min et utiliser un hémocytomètre pour compter le nombre de conidies. REMARQUE: La formule utilisée pour le comptage est le nombre de conidies par 25 carrés de la plus petite cellule (taille = 0,025 mm2; profondeur de la chambre = 0,1 mm): Nombre total de conidies en 5 carrés ÷ 80 × (4 × 106)</li>
		<li>Répétez trois fois pour chaque isolat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dosage de thermotolérance<ol>
<li>Cultiver l’isolat fongique sélectionné sur un milieu 1/4 SDA à 25 ± 1 °C dans l’obscurité pendant 10 jours.</li>
		<li>Préparer 1 mL de la suspension conidiale d’isolat fongique dans une solution de tensioactif à 0,03 % et ajuster à 1 x 107 conidies/mL comme décrit ci-dessus.</li>
		<li>Vortex la suspension conidiale et chauffez-la dans un bain sec à 45 °C pendant 0, 30, 60, 90 et 120 min. Déposer trois gouttelettes de 5 μL de la suspension conidiale sur un milieu de 55 mm 1/4 SDA à chaque point temporel après l’exposition à la chaleur et incuber à 25 ± 1 °C pendant 18 h. REMARQUE: Évitez de répandre les gouttelettes fongiques pour pouvoir mieux vous concentrer sur la zone.</li>
		<li>Comptez le nombre de spores de conidies germées avec cinq champs choisis au hasard sous microscopie optique 200x pour déterminer le taux de germination.</li>
		<li>Effectuez trois réplications pour chaque isolat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Classement du nombre effectif de conidies (ECN)
<ol><li>Calcul ecN NOTE: Obtenir les données de production cidiosiale et de thermotolérance de chaque souche fongique potentielle avant de calculer le ECN21 total.<ol>
<li>Calculer le changement de pli (FC) de la production conique à chaque point temporel : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq01.jpg"> où, x = point temporel pour la collecte des données; ncp = nombre de conidies après chaque jour de croissance; et I = nombre initial de conidies ensemencées.</li>
		<li>Calculer le nombre de conidies sous le traitement de contrainte à chaque point temporel en utilisant la formule suivante: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq02.jpg"> Où, y = l’ECN du point temporel sous traitement; TT0 = le taux de germination des conidies ne subissant pas de stress thermique (= taux de germination de 0 min de traitement thermique); TTz = coefficient de contrainte est le taux de germination des conidies à différents moments du traitement thermique (z).</li>
		<li>Calculez l’ECN total à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62882/62882eq03.jpg">
</li>
		<li>Comparez l’ECN de chaque souche fongique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse en composantes principales (ACP) des souches fongiques NOTE:L’analyse PCA confirme le classement de l’ECN et aide à comprendre la corrélation entre les valeurs de caractère physiologique. Comparez les valeurs ECN et sélectionnez les isolats EPF ayant des valeurs ECN plus élevées.</li>
	<li>Utilisez le logiciel R pour créer un PCA en codant : #Input fichier de données PCA a = read.table(« PCA.csv »,sep=',',header=T)<ol>
<li># Traitement des exemples de données row.names(a) &lt;- c(« NCHU-9 »,"NCHU-11 », « NCHU-64 », « NCHU-69 », « NCHU-95 », « NCHU-113 ») X=row.names(a) df&lt;- a[2:11]</li>
		<li>#PCA calcul pca &lt;- prcomp(df, centre = VRAI, échelle = VRAI) vars &lt;- (pca$sdev)^2 pc1_percent = vars[1] / sum(vars) pc2_percent = vars[2] / sum(vars) valeur = pca$x</li>
		<li>#Output fichier de visualisation PCA png(file = 'pca.png', hauteur = 2000, largeur = 2000, res = 300) REMARQUE: Utilisez une production condescendante de 7 à 14 jours et toutes les données de thermotolérance pour effectuer l’analyse en composantes principales (APC) afin de confirmer le classement ECN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les souches fongiques les plus performantes en fonction de l’ECN ou de l’APC et effectuez le test de virulence des parasites cibles pour des recherches ultérieures.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts impliqué dans ce travail.

Les champignons entomopathogènes (EPF) ont été utilisés pour la lutte contre les insectes. Il existe plusieurs méthodes pour isoler, sélectionner et identifier les FPE30,31,32. En comparant les différents types de méthodes d’appâts à insectes, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae ont été couramment trouvés dans les appâts à insectes6,12,13,14.<s...

Actuellement, les champignons entomopathogènes (FPE) sont largement utilisés dans la lutte microbienne contre les ravageurs agricoles, forestiers et horticoles. Les avantages de l’EPF sont ses larges gammes d’hôtes, sa bonne adaptabilité environnementale, sa nature écologique et le fait qu’il peut être utilisé avec d’autres produits chimiques pour montrer l’effet synergique de la lutte intégrée contre les ravageurs1,2. Pour l’application en tant qu’agent antiparasitaire, il est nécessaire d’isoler un grand nombre d’EPF des insectes malades ou de l’environnement naturel.
L’échantillonnage de ces organismes à partir de leurs hôtes aide à comprendre la répartition géographique et le taux de prévalence de la FPE chez les hôtes naturels3,4,5. Cependant, la collecte d’insectes infectés par des champignons est généralement limitée par des facteurs environnementaux et des populations d’insectes sur le terrain4. Étant donné que les insectes hôtes meurent après une infection par le FPE et tombent ensuite dans le sol, l’isolement du FPE à partir d’échantillons de sol pourrait être une ressource stable3,6. Par exemple, les saprophytes sont connus pour utiliser l’hôte mort comme ressource pour la croissance. Les systèmes d’appâts de sol et de milieux sélectifs ont été largement utilisés pour détecter et isoler les FPE du sol3,4,7,8,9,10.
Dans la méthode du milieu sélectif, la solution de sol diluée est plaquée sur un milieu contenant des antibiotiques à large spectre (p. ex. chloramphénicol, tétracycline ou streptomycine) pour inhiber la croissance des bactéries2,3,9,11. Cependant, il a été rapporté que cette méthode peut déformer la diversité et la densité de la souche et peut provoquer une surestimation ou une sous-estimation de nombreuses communautés microbiennes6. De plus, les souches isolées sont moins pathogènes et rivalisent avec les saprophytes pendant l’isolement. Il est difficile d’isoler le PEF de la solution de sol diluée3. Au lieu d’utiliser un milieu sélectif, la méthode d’appât du sol isole l’EPF des insectes morts infectés, qui peuvent être stockés pendant 2-3 semaines, fournissant ainsi une méthode de séparation EPF plus efficace et standard3,4,7,6. Parce que la méthode est facile à utiliser, on peut isoler une variété de souches pathogènes à faible coût4. Par conséquent, il est largement utilisé par de nombreux chercheurs.
En comparant les différents types de systèmes d’appâts à insectes, Beauveria bassiana et Metarhizium anisopliae sont les espèces d’EPF les plus courantes que l’on trouve chez les insectes appartenant aux hémiptères, aux lépidoptères, aux blattella et aux coléoptères6,12,13,14. Parmi ces appâts d’insectes, Galleria mellonella (ordre des lépidoptères) et Tenebrio molitor (ordre des coléoptères) montrent des taux de récupération plus élevés de Beauveria et de Metarhizium spp., par rapport à d’autres insectes. Par conséquent, G. mellonella et T. molitor sont couramment utilisés pour l’appâtage des insectes. Au fil des ans, le Département de l’Agriculture des États-Unis (USDA) a créé une bibliothèque EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) qui contient une grande variété d’espèces, dont 4081 espèces de Beauveria spp., 18 espèces de Clonostachys spp., 878 espèces de Cordyceps spp., 2473 espèces de Metarhizium spp., 226 espèces de Purpureocillium spp., et 13 espèces de Pochonia spp. entre autres15. Une autre bibliothèque EPF a été construite par le Laboratoire de recherche en entomologie (ERL) de l’Université du Vermont aux États-Unis pendant environ 30 ans. Il comprend 1345 souches d’EPF en provenance des États-Unis, d’Europe, d’Asie, d’Afrique et du Moyen-Orient16.
Pour lutter contre les ravageurs locaux ou d’invasion à Taïwan, l’isolement et la sélection des FPE indigènes sont nécessaires. Par conséquent, dans ce protocole, nous avons modifié et décrit la procédure de la méthode d’appât du sol et l’avons combinée avec le système d’appât d’insecte (ver de farine, Mouebrio molitor)17. Sur la base de ce protocole, une bibliothèque EPF a été créée. Deux cycles de dépistage (quantification de l’inoculation) ont été effectués pour les isolats préliminaires de FPE. Les isolats d’EPF ont montré une pathogénicité pour les insectes. Les souches potentielles ont été soumises à des identifications morphologiques et moléculaires et analysées plus avant par le test de thermotolérance et de production conique. En outre, un concept de nombre de conidies effectives (ECN) a également été proposé. À l’aide de la formule ECN et de l’analyse en composantes principales (APC), les souches potentielles ont été analysées sous pression environnementale simulée pour compléter le processus d’établissement et de criblage de la bibliothèque EPF. Par la suite, la pathogénicité des souches prometteuses de FPE a été testée pour le ravageur cible (p. ex., Spodoptera litura). Le protocole actuel intègre les données de thermotolérance et de production conique dans la formule ECN et l’analyse PCA, qui peuvent être utilisées comme système de classement standard pour la recherche liée à l’EPF.

<table><tbody><tr><td>Gélose de qualité bactériologique</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGR001</td><td>Convient à la plupart des applications de culture cellulaire/moléculaire, de biologie.</td></tr><tr><td>AGAROSE, qualité biotechnologie</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGA001</td><td>Pour l’électrophorèse de l’ADN.</td></tr><tr><td>BioGreen Safe DNA Gel Buffer</td><td>BIOMAN</td><td>SDB001T</td><td></td></tr><tr><td>Perceur de liège en laiton</td><td>Dogger</td><td>D89A-44001</td><td></td></tr><tr><td>Canon kiss x2</td><td>Canon</td><td>EOS 450D</td><td>Pour une morphologie de colonie de souche record</td></tr><tr><td>Incubateur à température constante</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-509RD</td><td>Élevage de champignons.</td></tr><tr><td>cubee Mini-centrifugeuse</td><td>GeneReach</td><td>MC-CUBEE</td><td></td></tr><tr><td>DigiGel 10 Système d’image numérique sur gel</td><td>TOPBIO</td><td>DGIS-12S</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 0.2 à 2 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642010</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 1 à 10 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642030</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 10 à 100 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 100 à 1000 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 2 à 20 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 20 à 200 & micro ; L Pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>4342718</td><td></td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR</td><td>Kit Geneaid</td><td>DFH100</td><td></td></tr><tr><td>Genius Dry Bath Incubator</td><td>Major Science</td><td>MD-01N</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué Custom A 100mL</td><td>SIBATA</td><td>SABP-1195906</td><td>Mesurez le volume des réactifs.</td></tr><tr><td>Compteur de pointage manuel</td><td>SDI</td><td>NO.1055</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>bioman</td><td>AP-0650010</td><td>Calculer le nombre de spores</td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation</td><td>Dogger</td><td>D8GA-23000</td><td></td></tr><tr><td>couvercle</td><td>IDEAHOUSE</td><td>RS92004</td><td></td></tr><tr><td>Micro verre de couverture</td><td>MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD</td><td>24241</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie microscope</td><td>SAGE VISION CO.,LTD</td><td>SGHD-3.6C</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>DOGGER</td><td>DG75001-07105</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus Électrophorèse sur gel d’ADN</td><td>ADVANCE</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique Nikon</td><td>SAGE VISION CO.,LTD</td><td>Eclipse CI-L</td><td></td></tr><tr><td>Gobelet en plastique</td><td>IDEAHOUSE</td><td>CS60016</td><td></td></tr><tr><td>Presto Mini gDNA Kit de levure</td><td>Geneaid</td><td>GYBY300</td><td>Kit d’extraction d’ADN génomique fongique</td></tr><tr><td>Bouillon de dextrose Sabouraud (Sabouraud Liquid Medium)</td><td>HiMedia Leading BioSciences</td><td>Company M033</td><td>Utilisé pour la culture de levures, de moisissures et de micro-organismes aciduriques.</td></tr><tr><td>Lame de scalpel n°23</td><td>Swann-Morton</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel n°4</td><td>AGARWAL SURGICALS</td><td>SSS -FOR-01-91</td><td></td></tr><tr><td>Pelle</td><td>Save & Sûr</td><td>A&nbsp ;-1580242&nbsp ;-00</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>bioman(phytotech)</td><td>S7777</td><td>Tensioactif</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Micro 17 Microcentrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler en acier</td><td>SIPEL ELECTRONIC SA</td><td>GG-SA</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri stérile</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>1621</td><td>Récipients cylindriques peu profonds avec couvercles ajustés, spécialement conçus pour la microbiologie ou la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>ThermoCell MixingBlock</td><td>BIOER</td><td>MB-101</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>164-21775</td><td></td></tr><tr><td>TwinGuard ULT Congélateur</td><td>Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.</td><td>MDF-DU302VX-80</td><td>&deg ; C stocké.</td></tr><tr><td>Armoire à plancher vertical</td><td>Chih Chin</td><td>BSC-3</td><td>Opération fongique de culture.</td></tr><tr><td>Vortex Genie II</td><td>Scientific</td><td>SIG560</td><td></td></tr><tr><td>Sacs de rangement à fermeture éclair</td><td>Save & Sûr</td><td>A&nbsp ;-1248915&nbsp ;-00</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Échelle d’ADN</td><td>Geneaid</td><td>DL007-20</td><td></td></tr><tr><td>&deg ; C Congélateur</td><td>FRIGIDAIRE</td><td>Frigidaire</td> <td>FFFU21M1QW-20° ; C et réactifs expérimentaux stockés.</td></tr><tr><td>2X SuperRed PCR Master Mix</td><td>TOOLS</td><td>TE-SR01</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE Buffer</td><td>BIOMAN</td><td>TAE501000</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Les champignons entomopathogènes (FPE) sont l’un des agents de lutte microbienne pour la lutte intégrée contre les ravageurs. Pour lutter contre les ravageurs locaux ou envahissants, il est important d’isoler et de sélectionner les FPE indigènes. Par conséquent, la méthode de l’appât du sol combinée au système d’appât d’insecte (ver de farine, mouoliteur Tenebrio) a été utilisée dans cette étude avec quelques modifications. Les EPF isolés ont ensuite été soumis au test de virulence contre le ravageur agricole Spodoptera litura. De plus, les souches EPF potentielles ont été soumises à des identifications morphologiques et moléculaires. En outre, la production de conidies et le test de thermotolérance ont été effectués pour les souches EPF prometteuses et comparés; ces données ont ensuite été substituées dans la formule du nombre de conidies effectives (ECN) pour le classement en laboratoire. Le système appât-ver de farine du sol et la formule ECN peuvent être améliorés en remplaçant les espèces d’insectes et en intégrant plus de facteurs de stress pour l’évaluation de la commercialisation et l’application sur le terrain. Ce protocole fournit une approche rapide et efficace pour la sélection des FPE et améliorera la recherche sur les agents de lutte biologique.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes potentiels (EPF) En utilisant la méthode de construction de la bibliothèque de champignons entomopathogènes à médiation molitoreuse (EPF) de Tenebrio, le nombre de champignons sans activité de destruction d’insectes serait exclu; ainsi, l’efficacité de l’isolement et la sélection du FPE pourraient être largement augmentées. Au cours de l’application de cette méthode, les informations sur les sites d’échan...

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

La méthode d’isolement des champignons entomopathogènes est importante pour le développement d’agents de contrôle microbien. Ce protocole peut être utilisé pour isoler et sélectionner des isolats fongiques entomopathogènes à haute virulence à partir des échantillons de sol. Cette technique comprend trois volets de dépistage de la pathogénicité et combine le test de thermotolérant et de production de conidies pour obtenir le classement efficace du nombre de conidies.La méthode peut aider à sélectionner de nouveaux isolats fongiques entomopathogènes à haute virulence et prometteurs pour la commercialisation. Ce protocole se concentre sur la lutte biologique, il pourrait également être utilisé pour découvrir les isolats fongiques entomopathogènes afin d’étudier l’interaction entre les ravageurs et les champignons entomopathogènes. Yao-Chia Liu et Nian-Tong Ni, étudiant en master de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Commencez par la collecte de l’échantillon de sol en enlevant un centimètre du sol de surface, puis en recueillant le sol à une profondeur de cinq à 10 centimètres de chaque site d’échantillonnage à l’aide d’une pelle. Après avoir enregistré les détails de chaque site d’échantillonnage, prélevez et conservez 100 grammes d’échantillon de sol dans un sac en plastique à température ambiante pour effectuer le protocole d’isolement fongique dans les trois heures. Pour isoler les champignons entomopathogènes potentiels, ou EPF, ajoutez 100 grammes de l’échantillon de sol dans un gobelet en plastique et placez cinq vers tenebrio molitor à la surface du sol à température ambiante dans l’obscurité pendant deux semaines en observant et en enregistrant quotidiennement la mortalité des larves et la mycose.Gardez la larve morte dans la tasse jusqu’à deux semaines pour l’isolement fongique. Après deux semaines, transférez les insectes morts sur un banc propre et utilisez un cure-dent stérile pour recueillir les conidies. Pour obtenir la culture primaire de champignons, strier les conidies collectées sur un milieu d’agar au dextrose Sabouraud ou SDA d’un quart de force dans une plaque de 55 millimètres pour incuber à 25 degrés Celsius pendant sept jours.Le huitième jour, restrecez chaque champignon de culture primaire sur une plaque SDA de 55 millimètres dans une hotte à écoulement laminaire avant d’incuber la culture à 25 degrés Celsius pendant sept jours pour obtenir des colonies uniques de champignons. Lors du premier dépistage de la pathogénicité, placez cinq larves de Tenebrio molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure à 25 degrés Celsius. Après avoir observé et enregistré la mycose et la mortalité pendant 10 jours, sélectionnez les isolats fongiques pour une analyse plus approfondie.Pour effectuer le deuxième test de virulence, récoltez les conidies de chaque isolat fongique en vortexant pendant une minute et comptez le nombre de conidies à l’aide d’un hémocytomètre. Lorsque cela est fait, ajustez la suspension de conidies à une concentration d’une fois 10 à 1/7 de conidie par millilitre dans une solution de tensioactif à 0,03% avant d’étaler 10 microlitres de suspension fongique sur une plaque SDA de 55 millimètres pour croître pendant sept jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Le huitième jour, placez cinq larves de Tenebrio molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure et scellez les plaques avec un film Parafilm pour incuber tout en observant la mycose et la mortalité décrites précédemment.Après avoir répété le deuxième test de virulence en triple exemplaire pour chaque isolat fongique, sélectionnez les isolats pour effectuer le troisième test de virulence pour le ravageur cible comme Spodoptera litura. Collectez environ un EPF d’un millimètre carré de la plaque SDA de sept jours pour extraire l’ADN génomique fongique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique fongique. Ensuite, amplifier l’espaceur transcrit interne fongique ou la région ITS par PCR de l’échantillon d’ADN suivant le programme de PCR décrit dans le manuscrit textuel.Après avoir séquencé le produit amplifié par PCR par un service de séquençage commercial, utilisez le NCBI BLAST pour rechercher des champignons similaires dans la base de données NCBI et sélectionner les espèces fongiques relatives pour l’analyse phylogénétique. Alignez les séquences multiples et découpez manuellement la région de séquence conservée avec GeneDoc. Effectuez l’analyse phylogénétique en fonction de l’évolution minimale, de la jointure des voisins et des méthodes de probabilité maximale.Pour étudier la morphologie des champignons, capturez la croissance de la colonie de culture fongique pendant sept jours avec une caméra et enregistrez la croissance, la forme: moelleuse ou ferme et la couleur des colonies. Pour observer les conidies chez les conidiophores, grattez les conidies de la colonie fongique de culture pure avec une boucle d’inoculation et transférez les spores sur une lame de verre contenant 0,1% de solution Tween 80. Utilisez un scalpel pour couper un bloc d’agar de la colonie fongique, puis transférez le bloc de gélose sur une lame de verre et ajoutez la solution Tween 80 à 0,1% pour laver la plupart des conidies en excès sur la gélose.Ensuite, couvrez la diapositive avec un couvercle pour l’observation microscopique légère des conidies. Mesurez et enregistrez la largeur et la longueur des conidies et des conidiophores pour comparer la différence entre différents isolats fongiques. Organisez un test de production conique en cultivant l’isolat fongique sélectionné sur un milieu SDA à quart de force à environ 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 10 jours.Préparez ensuite une suspension conidiale millilitre de l’isolat fongique dans une solution de tensioactif à 0,03%, puis ajustez la concentration à une fois 10 aux 1/7 de conidies par millilitre comme décrit précédemment. Après avoir ajouté trois gouttelettes de 10 microlitres de suspension conidiale sur une plaque SDA d’un quart de force, incuber la culture à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant sept, 10 et 14 jours pour compter la sporulation des champignons. À chaque point temporel, détachez un bloc de gélose de cinq millimètres du centre de la colonie avec un foreur de liège et transférez le bloc dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de solution de tensioactif à 0,03%.Après avoir vortexé le tube à 3 000 rotations par minute à température ambiante pendant 15 minutes, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de conidies. Pour le dosage de thermotolérance, cultiver l’isolat fongique sélectionné et préparer une fois 10 à la 1/7 de conidie par millilitre de suspension comme illustré précédemment. Après le vortex, chauffer la suspension conidiale dans un bain sec à 45 degrés Celsius pendant différents intervalles de temps.Après l’exposition à la chaleur, ajoutez trois gouttelettes de cinq microlitres de suspension conidiale sur une plaque SDA de 55 millimètres à chaque point temporel, puis incubez les plaques à environ 25 degrés Celsius pendant 18 heures. Pour déterminer la vitesse de germination, comptez le nombre de spores de conidies germées avec cinq champs choisis au hasard au microscope optique à un grossissement de 200 fois. Calculez le nombre total de conidies effectives ou ECN à l’aide de la formule, puis calculez l’analyse des composantes principales ou PCA des souches fongiques comme décrit dans le manuscrit.Sélectionnez les souches fongiques les plus performantes en fonction de l’ECN ou de l’APC pour effectuer le test de virulence des ravageurs cibles. Dans le deuxième test de virulence, la virulence des 26 isolats fongiques contre les vers de farine Tenebrio molitor a été évaluée. 12 isolats fongiques à haute pathogénicité ont été sélectionnés pour le test de virulence contre Spodoptera litura.Pour mieux comprendre les positions taxonomiques fongiques, 26 isolats issus du premier dépistage de la pathogénicité ont été soumis à une analyse moléculaire basée sur la région ITS. Grâce à la méthode de nettoyage des observations morphologiques des champignons, les structures des conidiophores ont pu être clairement vues avec une solution de 0,1% Tween 80. La couleur, la forme et la disposition des conidies ont été étudiées par des observations microscopiques de la colonie de conidies.L’ECN combine les données de production de conidies et de thermotolérant de chaque EPF. La viabilité élevée d’une souche fongique a été observée lorsque la valeur ECN était élevée. En outre, une grande coordination entre l’APC et le REC a été révélée, ce qui suggère que le REC pourrait être utilisé pour évaluer la hiérarchie des paramètres liés à la viabilité.Le dépistage de la pathogénicité en extrayant l’ADN fongique et en cultivant l’isolat fongique est important dans la procédure. En utilisant la formule de calcul ECN, les champignons pathogènes internes idéaux peuvent être sélectionnés. La combinaison de différentes espèces d’insectes, telles que la teigne de la cire et le ver de farine ensemble pour appâter les champignons entomopathogènes à partir des échantillons de sol pourrait augmenter la diversité des champignons entomopathogènes.La diversité micro-organisme du sol est un sujet très intéressant lors du fonctionnement de ce protocole. Il pourrait également faire l’objet d’une enquête plus approfondie à l’avenir via ce protocole.

isolation-selection-entomopathogenic-fungi-from-soil-samples

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les nématodes entomopathogènes sont des vers ronds terricoles qui parasitent une grande variété d'insectes. Nous démontrons méthodes d'échantillonnage utilisées pour l'isolement de ces nématodes dans le sol au moyen de deux techniques: l'appâtage des insectes et le piège blanc modifié, pour la récupération des nématodes à partir d'échantillons de sol et de cadavres d'insectes infectés, respectivement.

L&#39;échantillonnage du sol et isolement de nématodes entomopathogènes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Ici, nous signalons les différentes étapes impliquées dans le développement fondé sur la connaissance d'un mycoinsecticide efficace, y compris l'isolement, l'identification, le dépistage et la sélection du champignon entomopathogène "meilleur ajustement", Metarhizium anisopliae , pour le contrôle des insectes nuisibles en agriculture .

Développement de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; En tant que myco-insecticide: de l&#39;isolement au rendement sur le terrain

Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des champignons entomopathogènes à partir d’un foreur de bois forestier et une manière substitutive d’évaluer leurs activités entomopathogènes à l’aide d’un insecte modèle coléoptère. Cette méthode est efficace et pratique pour explorer les ressources fongiques entomopathogènes des insectes xylophages ravageurs dans les forêts naturelles.

Isolement, identification comportementale et évaluation de la pathogénicité des champignons entomopathogènes d’un xylophage forestier

Cette vidéo montre une procédure permettant d'isoler des protoplastes intacts les tissus à partir de 14 jours d'âge des plants d'Arabidopsis. Étant donné que les protoplastes isolés restent intacts pendant au moins 96h et sont isolées de plants au lieu d'un mois, les plantes matures, cette procédure accélère les essais nécessitant protoplastes intacts.

Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d&#39;âge des plantules Arabidopsis thaliana</em

Les problèmes de traitement des échantillons biologiques pour l’observation en microscopie électronique à balayage comprennent l’effondrement cellulaire, le traitement d’échantillons provenant de microenvironnements humides et la destruction cellulaire. Des protocoles peu coûteux et relativement rapides adaptés à la préparation d’échantillons difficiles tels que les méristèmes floraux, les kystes d’oomycètes et les champignons (Agaricales) sont compilés et détaillés ici.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Ce rapport décrit un protocole de préparation d’échantillons et des conditions d’imagerie spécifiques pour effectuer la tomographie électronique à transmission à balayage d’échantillons biologiques épais.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

Ce protocole de marquage immunofluorescent des protéines virales végétales et des protéines d’insectes vecteurs dans les intestins d’insectes excisés peut être utilisé pour étudier les interactions entre les insectes virus et vecteurs, les fonctions des protéines d’insectes et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transmission du virus.

Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Les champignons entomopathogènes ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. Dans cette étude, la production en masse d’un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de Metarhizium robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles a été menée avec succès en utilisant des produits céréaliers agricoles.

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

Ce protocole est une méthode efficace et rapide de culture des levures et de la moisissure Aspergillus fumigatus à partir de grands ensembles d’échantillons de sol en aussi peu que 7 jours. Les méthodes peuvent être facilement modifiées pour s’adapter à une gamme de milieux d’incubation et de températures au besoin pour les expériences.

Isolement des levures et des moisissures cultivables des sols pour étudier la structure de la population fongique

Découvrez l'isolement de champignons entomopathogènes à partir d'échantillons de sol en utilisant Tenebrio molitor comme appât. Cette méthode combine criblage de pathogénicité, thermotolérance et production de conidies pour sélectionner des isolats fongiques à haute virulence destinés au contrôle biologique des ravageurs.

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Explorer plus de vidéos