Isolement et sélection de champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol et évaluation de la virulence fongique contre les insectes nuisibles

Nous présentons ici un protocole basé sur le système d’appât du ver de farine (Tenebrio molitor) qui a été utilisé pour isoler et sélectionner les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Une formule de nombre de conidies efficaces (ECN) est utilisée pour sélectionner un EPF à haute tolérance au stress en fonction des caractéristiques physiologiques de la lutte microbienne des ravageurs sur le terrain.

La méthode d’isolement des champignons entomopathogènes est importante pour le développement d’agents de contrôle microbien. Ce protocole peut être utilisé pour isoler et sélectionner des isolats fongiques entomopathogènes à haute virulence à partir des échantillons de sol. Cette technique comprend trois volets de dépistage de la pathogénicité et combine le test de thermotolérant et de production de conidies pour obtenir le classement efficace du nombre de conidies.

La méthode peut aider à sélectionner de nouveaux isolats fongiques entomopathogènes à haute virulence et prometteurs pour la commercialisation. Ce protocole se concentre sur la lutte biologique, il pourrait également être utilisé pour découvrir les isolats fongiques entomopathogènes afin d’étudier l’interaction entre les ravageurs et les champignons entomopathogènes. Yao-Chia Liu et Nian-Tong Ni, étudiant en master de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par la collecte de l’échantillon de sol en enlevant un centimètre du sol de surface, puis en recueillant le sol à une profondeur de cinq à 10 centimètres de chaque site d’échantillonnage à l’aide d’une pelle. Après avoir enregistré les détails de chaque site d’échantillonnage, prélevez et conservez 100 grammes d’échantillon de sol dans un sac en plastique à température ambiante pour effectuer le protocole d’isolement fongique dans les trois heures. Pour isoler les champignons entomopathogènes potentiels, ou EPF, ajoutez 100 grammes de l’échantillon de sol dans un gobelet en plastique et placez cinq vers tenebrio molitor à la surface du sol à température ambiante dans l’obscurité pendant deux semaines en observant et en enregistrant quotidiennement la mortalité des larves et la mycose.

Gardez la larve morte dans la tasse jusqu’à deux semaines pour l’isolement fongique. Après deux semaines, transférez les insectes morts sur un banc propre et utilisez un cure-dent stérile pour recueillir les conidies. Pour obtenir la culture primaire de champignons, strier les conidies collectées sur un milieu d’agar au dextrose Sabouraud ou SDA d’un quart de force dans une plaque de 55 millimètres pour incuber à 25 degrés Celsius pendant sept jours.

Le huitième jour, restrecez chaque champignon de culture primaire sur une plaque SDA de 55 millimètres dans une hotte à écoulement laminaire avant d’incuber la culture à 25 degrés Celsius pendant sept jours pour obtenir des colonies uniques de champignons. Lors du premier dépistage de la pathogénicité, placez cinq larves de Tenebrio molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure à 25 degrés Celsius. Après avoir observé et enregistré la mycose et la mortalité pendant 10 jours, sélectionnez les isolats fongiques pour une analyse plus approfondie.

Pour effectuer le deuxième test de virulence, récoltez les conidies de chaque isolat fongique en vortexant pendant une minute et comptez le nombre de conidies à l’aide d’un hémocytomètre. Lorsque cela est fait, ajustez la suspension de conidies à une concentration d’une fois 10 à 1/7 de conidie par millilitre dans une solution de tensioactif à 0,03% avant d’étaler 10 microlitres de suspension fongique sur une plaque SDA de 55 millimètres pour croître pendant sept jours à 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Le huitième jour, placez cinq larves de Tenebrio molitor directement à la surface de chaque plaque de culture fongique pure et scellez les plaques avec un film Parafilm pour incuber tout en observant la mycose et la mortalité décrites précédemment.

Après avoir répété le deuxième test de virulence en triple exemplaire pour chaque isolat fongique, sélectionnez les isolats pour effectuer le troisième test de virulence pour le ravageur cible comme Spodoptera litura. Collectez environ un EPF d’un millimètre carré de la plaque SDA de sept jours pour extraire l’ADN génomique fongique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique fongique. Ensuite, amplifier l’espaceur transcrit interne fongique ou la région ITS par PCR de l’échantillon d’ADN suivant le programme de PCR décrit dans le manuscrit textuel.

Après avoir séquencé le produit amplifié par PCR par un service de séquençage commercial, utilisez le NCBI BLAST pour rechercher des champignons similaires dans la base de données NCBI et sélectionner les espèces fongiques relatives pour l’analyse phylogénétique. Alignez les séquences multiples et découpez manuellement la région de séquence conservée avec GeneDoc. Effectuez l’analyse phylogénétique en fonction de l’évolution minimale, de la jointure des voisins et des méthodes de probabilité maximale.

Pour étudier la morphologie des champignons, capturez la croissance de la colonie de culture fongique pendant sept jours avec une caméra et enregistrez la croissance, la forme: moelleuse ou ferme et la couleur des colonies. Pour observer les conidies chez les conidiophores, grattez les conidies de la colonie fongique de culture pure avec une boucle d’inoculation et transférez les spores sur une lame de verre contenant 0,1% de solution Tween 80. Utilisez un scalpel pour couper un bloc d’agar de la colonie fongique, puis transférez le bloc de gélose sur une lame de verre et ajoutez la solution Tween 80 à 0,1% pour laver la plupart des conidies en excès sur la gélose.

Ensuite, couvrez la diapositive avec un couvercle pour l’observation microscopique légère des conidies. Mesurez et enregistrez la largeur et la longueur des conidies et des conidiophores pour comparer la différence entre différents isolats fongiques. Organisez un test de production conique en cultivant l’isolat fongique sélectionné sur un milieu SDA à quart de force à environ 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 10 jours.

Préparez ensuite une suspension conidiale millilitre de l’isolat fongique dans une solution de tensioactif à 0,03%, puis ajustez la concentration à une fois 10 aux 1/7 de conidies par millilitre comme décrit précédemment. Après avoir ajouté trois gouttelettes de 10 microlitres de suspension conidiale sur une plaque SDA d’un quart de force, incuber la culture à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant sept, 10 et 14 jours pour compter la sporulation des champignons. À chaque point temporel, détachez un bloc de gélose de cinq millimètres du centre de la colonie avec un foreur de liège et transférez le bloc dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de solution de tensioactif à 0,03%.

Après avoir vortexé le tube à 3 000 rotations par minute à température ambiante pendant 15 minutes, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de conidies. Pour le dosage de thermotolérance, cultiver l’isolat fongique sélectionné et préparer une fois 10 à la 1/7 de conidie par millilitre de suspension comme illustré précédemment. Après le vortex, chauffer la suspension conidiale dans un bain sec à 45 degrés Celsius pendant différents intervalles de temps.

Après l’exposition à la chaleur, ajoutez trois gouttelettes de cinq microlitres de suspension conidiale sur une plaque SDA de 55 millimètres à chaque point temporel, puis incubez les plaques à environ 25 degrés Celsius pendant 18 heures. Pour déterminer la vitesse de germination, comptez le nombre de spores de conidies germées avec cinq champs choisis au hasard au microscope optique à un grossissement de 200 fois. Calculez le nombre total de conidies effectives ou ECN à l’aide de la formule, puis calculez l’analyse des composantes principales ou PCA des souches fongiques comme décrit dans le manuscrit.

Sélectionnez les souches fongiques les plus performantes en fonction de l’ECN ou de l’APC pour effectuer le test de virulence des ravageurs cibles. Dans le deuxième test de virulence, la virulence des 26 isolats fongiques contre les vers de farine Tenebrio molitor a été évaluée. 12 isolats fongiques à haute pathogénicité ont été sélectionnés pour le test de virulence contre Spodoptera litura.

Pour mieux comprendre les positions taxonomiques fongiques, 26 isolats issus du premier dépistage de la pathogénicité ont été soumis à une analyse moléculaire basée sur la région ITS. Grâce à la méthode de nettoyage des observations morphologiques des champignons, les structures des conidiophores ont pu être clairement vues avec une solution de 0,1% Tween 80. La couleur, la forme et la disposition des conidies ont été étudiées par des observations microscopiques de la colonie de conidies.

L’ECN combine les données de production de conidies et de thermotolérant de chaque EPF. La viabilité élevée d’une souche fongique a été observée lorsque la valeur ECN était élevée. En outre, une grande coordination entre l’APC et le REC a été révélée, ce qui suggère que le REC pourrait être utilisé pour évaluer la hiérarchie des paramètres liés à la viabilité.

Le dépistage de la pathogénicité en extrayant l’ADN fongique et en cultivant l’isolat fongique est important dans la procédure. En utilisant la formule de calcul ECN, les champignons pathogènes internes idéaux peuvent être sélectionnés. La combinaison de différentes espèces d’insectes, telles que la teigne de la cire et le ver de farine ensemble pour appâter les champignons entomopathogènes à partir des échantillons de sol pourrait augmenter la diversité des champignons entomopathogènes.

La diversité micro-organisme du sol est un sujet très intéressant lors du fonctionnement de ce protocole. Il pourrait également faire l’objet d’une enquête plus approfondie à l’avenir via ce protocole.