Ex Utero Culture d’embryons de souris de la prégestrulation à l’organogenèse avancée

Cette méthode sera fondamentale pour comprendre la gastrulation le long d’une formation chez les mammifères. En permettant l’expérimentation d’embryons vivants au cours de stades embryonnaires qui ont longtemps été cachés à l’intérieur de l’utérus maternel. Il permet, continue la croissance efficace et appropriée des embryons de souris en dehors de l’utérus pendant une période prolongée allant jusqu’à 6 jours.

Une dissection embryonnaire rapide et adéquate et une prégestrulation de la concentration et de la pression des gaz sont les étapes les plus critiques pour une croissance embryonnaire réussie. Pour commencer à cultiver des embryons de souris âgés de 7,5 jours ou plus, allumez le rotateur et l’unité de chauffage du système d’incubateur de culture à rouleaux pendant au moins 1 heure avant la dissection de l’embryon. Ajoutez également de l’eau d’autoclave à la bouteille d’entrée de gaz et au tube à essai de sortie.

Ensuite, allumez le module régulateur de gaz en appuyant sur l’interrupteur principal, puis utilisez les contrôleurs respectifs pour régler les valeurs d’oxygène et de dioxyde de carbone à 5% Ouvrez le régulateur de gaz et déplacez l’interrupteur de tension dans le transmetteur de pression pour régler la pression de gaz à environ 6,5 à 7 livres par pouce carré. Confirmez la valeur de la pression du gaz à l’aide d’un manomètre numérique. Surveillez le débit de gaz en vérifiant le taux de bulles créées à l’intérieur du tube à essai rempli d’eau de sortie alloué à l’intérieur de l’incubateur de précision.

Réglez le taux de bulles approprié en fermant ou en ouvrant la vanne de débit de gaz sur le couvercle de la bouteille d’eau. Assurez-vous que le flux de gaz permet la formation de bulles à un rythme de 2 à 4 bulles par seconde ou réglez le flux de bulles au premier point où le bouillonnement sort dans le tube de sortie rempli d’eau. Ensuite, remplissez les bouteilles de culture avec 2 millilitres de milieu de culture.

Utilisez les bouchons de silicium évidés pour sceller les bouteilles et les brancher dans le tambour rotatif évidé pour un pré-équilibrage pendant 1 heure. Gardez les espaces vides dans le tambour rotatif scellés à l’aide des bondes solides. Ensuite, disséquez les embryons d’une souris femelle gestante euthanasiée.

Nettoyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70% et coupez la peau et la paroi abdominale à l’aide de ciseaux. Localisez une extrémité de l’utérus et coupez à l’intersection entre l’ovaire et l’utérus. Continuez à couper le long de l’utérus jusqu’à l’autre extrémité et transférez-la dans une boîte de Petri de 100 millimètres remplie de DPBS.

Lavez rapidement les conceptus en DPBS et coupez-les par paires pour faciliter la manipulation des embryons. Déplacez toutes les paires de conceptus sur un milieu de dissection prééquilibré dans une boîte de Petri de 60 millimètres, puis coupez-les dans les conceptus individuels. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces grossières, enlevez la paroi utérine des conceptus en déchirant le tissu utérin, puis en utilisant de fines pinces microchirurgicales, coupez la pointe de la décidua en forme de poire.

Insérez la pince à côté de l’embryon parallèlement à son long axe et ouvrez la pince pour diviser la décidua en deux. Enfin, à l’aide de pinces fines, saisissez l’embryon de la décidua et pelez le sac de jaune pariétal de l’embryon, en laissant le cône ectoplacentaire intact attaché au cylindre d’œuf. Sélectionnez les embryons dans la plaque neurale, ou au stade précoce du pli de la tête, qui ne montrent aucun dommage dans l’épiblaste.

Transférer 5 à 6 embryons sélectionnés par flacon dans les flacons de culture en verre prééquilibrés et placer les flacons dans le système de culture rotatif à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère de 5% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone. Pour cultiver des embryons et des plaques statiques de prégastrulation et de gastrulation précoce, ajouter 250 microlitres de milieu de culture embryonnaire ex utero fraîchement préparé à chaque puits d’une plaque de 8 puits. Placez les plaques à l’intérieur d’un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pour le pré-équilibrage.

Après avoir disséqué les embryons hors de l’utérus comme démontré précédemment, transférez les embryons individuels dans chaque puits de la plaque de 8 puits à l’aide d’une micro pipette et placez la plaque à l’intérieur de l’incubateur avec 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Imagez les embryons au stéréomicroscope et sélectionnez pour la culture uniquement ceux avec une cavité amniotique bien formée sans dommages évidents et sans membrane de Reichert. Les conditions de culture à rouleaux décrites dans ce protocole pour les embryons de 7,5 jours favorisent une croissance embryonnaire constante et normale avec une efficacité moyenne proche de 75% après 4 jours de culture.

L’efficacité du développement embryonnaire varie selon divers antécédents génétiques de souris, mais elle est toujours robuste. La supplémentation en HBS au lieu de HCS donne une efficacité d’environ 68% après 4 jours de culture. Le développement de 6,5 embryons et plaques statiques est correctement récapitulé avec une efficacité de plus de 90% en utilisant un milieu de culture embryonnaire ex-utéro avec HCS et HBS.

Les cultures à partir d’embryons prégaztrulés montrent une efficacité de 46% du développement approprié jusqu’au stade précoce de la somite et près de 17% des embryons complètent leur développement approprié après 6 jours de culture. La morphogenèse et le développement tissulaire se déroulent correctement jusqu’à 42 somites. Les anomalies de développement représentatives observées chez les embryons pour les cultures initiées à partir des jours embryonnaires 7.5, 6.5 et 5.5 sont montrées ici.

Les embryons présentant des dommages mineurs à l’épiblaste ou les embryons conservant la membrane de Reichert doivent être jetés. Les embryons précoces ne se développeront pas correctement ou présenteront de graves retards de développement, tandis que la fixation de l’épiblaste embryonnaire à la surface de la plaque entraînera l’échec du développement ultérieur de l’embryon. Les principales anomalies observées chez les embryons défectueux sont le développement de la région postérieure à l’extérieur du sac vitellin ou des défauts dans la croissance des plis neuronaux.

Dans les cultures développées à partir d’embryons âgés de 5,5 jours, on observe fréquemment un défaut de développement est la présence d’une petite épiblaste sous-développée. En utilisant cette méthode, les chercheurs sont en mesure d’effectuer une variété de manipulations physiques ou chimiques dans le développement d’embryons post-implantés. Par exemple, la manipulation, la transplantation cellulaire ou le traçage de lignée.

Cette méthode ouvre non seulement la voie à l’étude détaillée du développement post-implantation de souris, mais également à la mise en œuvre de méthodes de culture similaires dans des embryons d’autres espèces, telles que l’homme.