Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

L’analyse de couplage de l’imagerie à une seule moucheture et de la force de traction microscopique peut analyser les machines moléculaires pour l’avancement et la navigation du cône de croissance. Comme les techniques utilisent des matériaux disponibles dans le commerce et des microscopes standard. Les chercheurs peuvent littéralement s’adapter aux techniques de leurs études.

Commencez par traiter les neurones avec de la tétraméthyl-rhodamine ou du ligand TMR à une dilution de un à 2000 dans un milieu de culture le jour in vitro 3. Ensuite, maintenez les neurones à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Après l’incubation, lavez le ligand TMR trois fois avec du PBS préchauffé.

Retirez le PBS avant d’ajouter 0,5 millilitre de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé dans les neurones. Maintenez les neurones à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, allumez un microscope à épifluorescence et réglez l’incubateur supérieur de l’État à 37 degrés Celsius.

Placez ensuite les neurones traités par ligand TMR dans la boîte inférieure en verre de l’incubateur supérieur chauffé. Réglez les paramètres d’acquisition d’image tels que le temps d’exposition à 500 millisecondes pour un canal de fluorescence Lifeact et HaloTag-actine et binning comme 0,065 micron par 0,065 micron par pixel à un intervalle de temps de trois secondes pour 50 images. Après avoir sélectionné un cône de croissance qui exprime fortement Lifeact et exprime chaque semaine HaloTag-actine.

Fermez le champ sur le diaphragme pour éclairer une zone minimale qui comprend le cône de croissance et acquérir des images en accéléré. Le jour in vitro 3, remplacez le milieu de culture par 0,5 millilitre de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé et maintenez les neurones pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pour la microscopie à force de traction, allumez un microscope confocal à balayage laser et réglez l’incubateur supérieur de la scène à 37 degrés Celsius.

Placez les neurones sur la boîte inférieure en verre de l’incubateur supérieur pré-averti. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme décrit dans le script de menu et sélectionnez un cône de croissance qui exprime fortement la protéine de fluorescence verte améliorée ou EGFP. Concentrez-vous sur la surface du gel et acquérez des images time-lapse.

Lorsque vous avez terminé, utilisez un logiciel de traitement d’image pour produire des piles d’images RVB time-lapses à canal unique. Enregistrez ensuite les images en tant que fichiers tiff. Ensuite, appliquez 100 microlitres de dodécylsulfate de sodium ou de FDS dissous dans de l’eau distillée de 10% en poids de volume pour détendre le substrat du gel en libérant les neurones du substrat.

Ensuite, incubez le plat dans l’incubateur supérieur de la scène pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour stabiliser la température. Dans le microscope confocal à balayage laser, concentrez-vous sur la surface du gel pour acquérir une image des perles dans le substrat non contraint. Produisez une image RVB monocanal des perles dans le substrat non contraint et enregistrez cette image sous forme de fichier tiff.

Téléchargez le code d’analyse de la force de traction TFM2021 et ouvrez TFM2021 dans MATLAB. Ouvrir le main. m dans TFM2021 et exécutez-le.

Lorsqu’une interface utilisateur graphique apparaît à l’écran. Cliquez sur charger l’image du substrat non entraîné et sélectionnez l’image de perle corrigée de la position X-Y dans le substrat non entraîné. Allez charger des images de perles fluorescentes et sélectionnez la pile de perles d’image en accéléré.

Cliquez ensuite sur charger des images en champ lumineux pour choisir l’image de pile time-lapse de champ lumineux et utilisez charger des images GFP pour sélectionner l’image de pile time-lapse d’EGFP. Dans la liste déroulante de l’interface utilisateur graphique, sélectionnez GFP avant de cliquer sur ROI pour spécifier la région rectangulaire d’intérêt, y compris le cône de croissance, en cliquant sur deux points sur l’image de cellule affichée. Une fois cela fait, cliquez sur le bouton Enregistrer de l’interface utilisateur graphique pour enregistrer les images de pile sélectionnées avec le retour sur investissement dans un fichier mat.

Ensuite, cliquez sur détection ponctuelle et entrez une valeur souhaitée dans la boîte de dialogue pour déterminer un seuil de détection de perles. Appuyez sur OK pour commencer le calcul. Une fois le calcul terminé, cliquez sur la piste de tracé pour agrandir la région sélectionnée précédemment et afficher les perles détectées sous forme de points blancs.

Utilisez des perles sélectionnées pour délimiter une région polygonale qui inclut les points corrects sous le cône de croissance. Ensuite, en appuyant sur Entrée sur le clavier, les points blancs dans la région polygonale passeront au rouge. Cliquez sur estimer la force dans l’interface utilisateur graphique.

Entrez ensuite des valeurs pour la taille des pixels et le module de Young comme expliqué dans le manuscrit. Mettez la valeur du ratio de Poisson à 0,3 et exécutez la force d’estimation pour lancer le calcul. Le logiciel enregistrera les résultats de calcul dans un fichier au format feuille de calcul.

Les images de fluorescence d’un cône de croissance neuronale ont montré une expression Lifeact élevée permettant la visualisation de la morphologie du cône de croissance sous un diaphragme entièrement ouvert et étroit. Les niveaux d’expression de HaloTag-actine étaient très faibles avec des signaux faibles. Lorsque le diaphragme est correctement rétréci, les signaux de fond diminuent et un seul acte en mouchetures apparaît dans le cône de croissance.

Les chercheurs qui réalisent correctement toutes les étapes observeront l’écoulement rétrograde de la F-actine dans le cône de croissance. La rigidité du gel de polyacrylamide a été déterminée en calculant la profondeur d’indentation causée par le poids de la microsphère. Un microscope confocal à balayage laser a été utilisé pour capturer des images de la surface du gel et du fond de la microsphère.

Les signaux des billes fluorescentes n’étaient pas visibles à la surface du gel dans la région en retrait. Les images de fluorescence des perles incorporées dans le gel de polyacrylamide et le cône de croissance neurale ont montré les perles dans leur origine et leurs positions déplacées. Le signal EGFP du cône de croissance a également été observé.

Les kymographes affichaient les mouvements de la perle par rapport à une perle de référence. Lors de l’exécution d’une seule imagerie de mouchetures, il est important de sélectionner un neurone qui exprime chaque semaine comment agir sous deux une zone minimale. Lors de la microscopie à force de traction, l’imagerie à fort grossissement est importante pour une concentration précise de la force de traction.