Expression bactérienne et purification de la métalloprotéinase-3 à matrice humaine par chromatographie d’affinité
30 mars 2022
La purification, la dialyse et l’activation de son étiquette sont utilisées pour augmenter les rendements de l’expression des protéines solubles du domaine catalytique de la métalloprotéinase-3 à matrice active chez les bactéries. Les fractions protéiques sont analysées via des gels SDS-PAGE.
Ce protocole détaillé décrit une méthode très efficace et rentable d’expression bactérienne pour le domaine catalytique recombinant MMP-3 chez E.Coli, qui peut être appliquée à d’autres cibles thérapeutiques MMP. E. coli manque d’un système complexe de repliement des protéines et de traitement post-traductionnel. Cette méthode utilise la souche cellulaire R2DP pour améliorer l’expression de la protéine eucaryote dans E. coli.
La surproduction de MMP spécifiques conduit à plusieurs maladies comme le cancer, les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Les MMP solubles actifs sont nécessaires au développement de thérapies inhibitrices de la MMP. Inoculer une seule colonie isolée de pET His-tag pro MMP-3 catalytique transformant à partir d’une plaque résistante au chloramphénicol d’ampicilline LB dans cinq millilitres de milieu résistant au chloramphénicol d’ampicilline LB à 37 degrés Celsius.
Conservez les aliquotes de chaque culture et préparez des stocks de glycérol à 40%. Inoculer une fiole d’un litre contenant 500 millilitres de LB ampicilline chloramphénicol résistant à une densité optique de 0,05 à 0,1 à 600 nanomètres avec la culture de nuit. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres à plusieurs moments, généralement pendant trois à quatre heures jusqu’à ce qu’elle tombe entre 0,4 et 0,6.
Induire les cultures avec un stock IPTG molaire à une concentration finale d’un millimolaire. Incuber dans le shaker à 37 degrés pendant trois à quatre heures supplémentaires. Centrifugez les cellules dans des bouteilles coniques de 250 millilitres à 13 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, en répétant jusqu’à ce que les cultures soient entièrement granulées.
Ajouter trois millilitres de tampon de lyse par gramme de granulé et remettre en suspension le granulé par vortex ou pipetage. Ajouter 1,25 millilitre de désoxycholate de sodium de 10 % en poids par volume par litre de culture. Ajouter 10 microlitres de DNase I par litre de culture.
Agiter à température ambiante pendant 30 minutes à 150 tr/min. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant.
Remettez en suspension la pastille dans une culture de 100 millilitres par litre de tampon corporel d’inclusion en pipetant de haut en bas. Conservez les échantillons sur la glace pendant la sonication pour éviter la surchauffe. Soniquez chaque échantillon pendant six cycles de 15 secondes, une sortie de cinq et une impulsion de 50%.
Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius. Vérifiez la pastille. Si la pastille est compacte, jetez le surnageant.
Remettez en suspension chaque granulé d’une culture d’un litre et cinq millilitres de tampon de solubilisation. Incuber pendant au moins 30 minutes sur de la glace pour permettre aux protéines de se solubiliser. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 13 000 fois G à quatre degrés Celsius.
Si la pastille se forme après centrifugation, versez le surnageant dans un tube conique séparé de 50 millilitres. Resuspendez la pastille dans cinq millilitres supplémentaires de tampon de solubilisation par litre de culture en pipetant de haut en bas. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius.
Ensuite, tirez les surnageants. Jetez la pastille ou conservez-la à moins 80 degrés Celsius pour une sonication supplémentaire. Videz contre le tampon de lavage HT et enregistrez l’A280 de la première fraction de lavage.
Répétez l’opération avec d’autres fractions jusqu’à ce que A280 se rapproche de la ligne de base. Éluez immédiatement les protéines marquées His en ajoutant cinq millilitres de tampon d’élution HT. Recueillir l’écoulement à des fractions de 0,5 à un millilitre dans des tubes de microfuge marqués d’élution HT.
Mesurer l’A280 de la fraction d’élution. Si l’A280 est supérieur à 0,3 milligramme par millilitre, diluer la fraction avec un tampon d’équilibrage HT. Immergez les fractions MMP éluées dans un tube de dialyse dans un litre de tampon de dialyse et remuez le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius.
Transférer dans un litre de tampon de dialyse deux et remuer le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférer dans un litre de tampon de dialyse trois et remuer le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius. Transférez l’échantillon dans un récipient approprié et étiquetez-le comme MMP composé.
Examinez le tube à la recherche de tout précipité. Par aliquote millilitre d’un milligramme par millilitre MMP, ajouter 50 microlitres d’APMA de 20 millimolaires pour atteindre une concentration apMA finale d’un millimolaire. Si un précipité se forme, centrifugez-le à la vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Conservez le surnageant dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre étiqueté MMP activé. Jeter le précipité dans un récipient marqué pour les déchets APMA. SDS-PAGE a été exécuté pour comparer les fractions d’élution de purification His-tag du domaine catalytique His-tag pro MMP-3 à partir de cellules BL21 DE3 dans les cellules R2DP.
Les huit premières fractions d’élution du domaine catalytique MMP marqué His et des cellules BL21 DE3 ont montré moins de protéines que celles du domaine catalytique MMP marqué His dans les cellules R2DP. Les fractions induites, repliées, concentrées, activées et dessalées des cellules MMP3 CD et R2DP sont montrées. Lors de l’activation, le poids moléculaire de la bande CD MMP-3 activée est d’environ 20 kilodaltons, par opposition au zymogène marqué His qui reste à environ 30 kilodaltons.
Lors de la centrifugation des lysats de cellules, les granulés peuvent ne pas être compacts. Lorsque cela se produit, soniquez plus et centrifugez plus longtemps. Lors de la reconcentration de la protéine, des précipitations peuvent se produire.
Dissoudre dans un tampon de solubilisation et répéter le processus. La procédure décrite ici fournit une méthode détaillée pour l’expression soluble des MMP humains actifs qui peut éventuellement être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire de l’activité enzymatique MMP. D’autres méthodes de purification des protéines telles que FPLC peuvent être effectuées pour purifier les protéines MMP.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode efficace pour exprimer le domaine catalytique de la MMP-3 recombinante dans E. coli, en utilisant la souche bactérienne R2DP afin d'augmenter les rendements protéiques. Le processus comprend la purification par étiquette His, la dialyse et l'activation pour obtenir une protéine soluble et active, adaptée à des applications thérapeutiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Ingénierie des protéines
- Développement de thérapeutiques
Contexte
- Les métalloprotéinases matricielles (MMP) sont impliquées dans diverses maladies, notamment le cancer et les troubles neurodégénératifs.
- Les MMP solubles actives sont essentielles au développement d'inhibiteurs de MMP.
- E. coli est couramment utilisé pour l'expression protéique en raison de sa simplicité et de son faible coût.
- La souche R2DP améliore l'expression de protéines eucaryotes dans les systèmes bactériens.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode rentable pour produire le domaine catalytique actif de la MMP-3 chez E. coli.
- Fournir un protocole pouvant être adapté à d'autres cibles thérapeutiques parmi les MMP.
- Faciliter la recherche sur les MMP et leur rôle dans les mécanismes des maladies.
Méthodes utilisées
- Inoculation d'Escherichia coli transformée à partir de milieux sélectifs.
- Purification par étiquette His pour isoler le domaine catalytique de la MMP-3.
- Dialyse pour éliminer les impuretés et concentrer la protéine.
- Analyse des fractions protéiques à l'aide de gels SDS-PAGE.
Résultats principaux
- Expression réussie du domaine catalytique soluble de la MMP-3 chez E. coli.
- Forts rendements de protéine active, adaptés aux applications thérapeutiques.
- Méthodes efficaces de purification et d'analyse démontrées.
- Protocole applicable à d'autres MMP et protéines similaires.
Conclusions
- La méthode décrite fournit une approche fiable pour produire la MMP-3 dans un système bactérien.
- Les améliorations du rendement protéique et de la solubilité peuvent faciliter le développement thérapeutique.
- Ce protocole peut servir de base à des études futures sur les MMP.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une production rentable et à haut rendement du domaine catalytique actif de la MMP-3 humaine dans E. coli, en réponse à un goulot d'étranglement majeur dans la validation ciblée pour les thérapeutiques liées aux MMP. En améliorant l'expression soluble et les rendements de purification, il soutient les tests d'hypothèses en phase précoce ainsi que la réduction des risques mécanistiques dans les programmes de découverte de médicaments en oncologie, en neurodégénérescence et en cardiologie. La méthode accroît la préparation du portefeuille en assurant un accès fiable à une protéine bioactive pour le criblage d'inhibiteurs et le développement de tests.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier l'hypothèse thérapeutique de la MMP-3 grâce à la production d'un domaine catalytique actif et soluble pour des tests fonctionnels.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance aux systèmes mammifères coûteux en améliorant le rendement et la solubilité de l'expression bactérienne via la souche R2DP.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en fournissant une protéine cohérente et de conformation native pour la validation en aval.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère une MMP-3 purifiée, adaptée au développement de tests biochimiques et cellulaires permettant d'évaluer la puissance et la sélectivité des inhibiteurs.
- Valeur opérationnelle : Fournit une production protéique standardisée et quantifiable grâce à la purification par marque His et à la dialyse, permettant un criblage reproductible de composés.
- Extensibilité : Utilise des étapes d'induction et de lyse simples, compatibles avec un passage à l'échelle en culture de plusieurs litres pour la production de réactifs d'analyse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet de passer de la validation de la cible à des études précliniques en fournissant une MMP-3 active pour des études sur le mécanisme d'action et les biomarqueurs.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'évaluer les effets de l'inhibition de la MMP-3 sur les voies de remodelage de la matrice extracellulaire associées aux phénotypes pathologiques.
- Confiance prédictive : Permet d'établir des corrélations structure-fonction à l'aide de la protéine purifiée afin de guider l'optimisation des candidats médicaments.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce, permettant la validation de cibles grâce à la production de protéines recombinantes, ce qui oriente l'identification de composés leaders et l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de la MMP.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en fournissant une MMP-3 active afin de préciser son rôle dans les voies protéolytiques et les mécanismes de la maladie.
- Criblage : Fournit une protéine purifiée adaptée à des tests biochimiques à haut débit pour identifier et hiérarchiser les candidats inhibiteurs.
- Analyse : Permet une évaluation quantitative par mesure de l'A280 et par électrophorèse SDS-PAGE afin de comparer les rendements d'expression et l'efficacité de purification entre souches.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte aux travaux précliniques en fournissant la protéine nécessaire à des études de dégradation tissulaire ex vivo et d'interaction avec les cytokines.
- Réutilisation en milieu industriel : Met en place une plateforme évolutible et adaptable pour la production d'autres domaines catalytiques de MMP, réduisant ainsi les efforts de réoptimisation pour différents cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la MMP-3 comme cible thérapeutique en permettant une production reproductible de la protéine active.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et le rendement par rapport à BL21(DE3), réduisant ainsi les échecs par lots et les coûts en réactifs lors de la production de protéines.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt en assurant un accès fiable à la protéine cible pour le profilage précoce des inhibiteurs.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des programmes ciblant les MMP grâce à un débit accru dans la validation des cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences en biologie moléculaire en matière de clonage, de transformation et de systèmes d'expression inductibles.
- Repose sur du matériel de laboratoire standard, notamment des agitateurs, des centrifugeuses, des sonicateurs et un appareil de dialyse.
- Exige une optimisation du temps et de la température d'induction pour assurer la solubilité selon les différentes cibles MMP.
- Implique la manipulation d'agents dénaturants et solubilisants, nécessitant des protocoles de sécurité appropriés.
- L'efficacité de l'activation peut varier et doit être surveillée par traitement à l'APMA et électrophorèse SDS-PAGE afin de confirmer le clivage du zymogène.
