Préparation d’échantillons pour analyse lipidique rapide dans le cerveau de drosophile à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice

L’imagerie spectrométrique Maldi MS est un outil établi et utile pour identifier et visualiser l’abondance et la distribution des lipides, sans modification excessive de l’échantillon. Le principal avantage de l’imagerie Maldi est sa capacité à détecter les lipides in situ sans marquage et à analyser simultanément une grande population d’échantillons. C’est en forgeant qu’on devient forgeron.

Assurez-vous de bien pratiquer avant de traiter les échantillons expérimentaux réels. Minimisez le temps de préparation de l’échantillon et évitez la contamination tout au long de la procédure. Pour commencer, ajoutez la température de coupe optimale, ou OCT dans un cryomoule en plastique à la moitié de la profondeur du cryomoule tout en évitant la formation de bulles.

Laissez le moule sur une surface plane pendant plusieurs minutes, puis transférez-le sur de la glace sèche. Gardez le cryomoule à plat sur la glace sèche et laissez l’OCT former une surface plane et uniforme. Attendez que l’OCT soit complètement solidifié dans le moule.

Utilisez immédiatement les étages OCT congelés ou conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Après avoir anesthésié les mouches adultes À l’aide de dioxyde de carbone, préparer une boîte de Petri contenant un morceau de lingette de laboratoire. Utilisez de l’eau pour humidifier une partie de la lingette afin de réduire l’électricité statique.

Gardez la lingette à moitié humide et à moitié sèche. Après avoir coupé la tête de mouche sous une lunette de dissection, prélever quatre à cinq têtes et les placer sur la zone sèche de la lingette de laboratoire. Prenez l’étape OCT de la glace sèche au microscope deux.

Transférez immédiatement les têtes à l’étape OCT et disposez-les rapidement, ce qui prend environ 30 à 60 secondes pour éviter la fonte OCT. Laissez environ un millimètre d’espace vide autour de chaque cerveau de mouche pour assurer un soutien adéquat de l’OCT et quatre à cinq millimètres d’espace vide du bord du bloc pour fournir suffisamment d’espace pour manipuler la section. Remettez la scène OCT sur la glace sèche et laissez-la reposer pendant environ trois minutes pour vous assurer que la scène OCT reste gelée et solide.

Une fois que toutes les têtes de mouches sont alignées, laissez la scène OCT reposer sur de la glace sèche pendant encore cinq à 10 minutes. Transférer l’étape OCT de la glace sèche sur une surface plane, puis ajouter rapidement une grande quantité de composé OCT pour couvrir tous les échantillons et remplir l’ensemble du cryomoule, ce qui prend environ trois secondes. Transférez immédiatement le cryomoule dans de la glace sèche et congelez tout le bloc OCT contenant les tissus incorporés.

Laissez la scène de l’OCT reposer sur la glace sèche pendant encore cinq à 10 minutes. Étiquetez les échantillons sur la marge du cryomoule et conservez les échantillons congelés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la section. Confirmez le côté codé ITO en testant la conductivité des lames ITO à l’aide d’un voltmètre réglé sur la résistance.

Marquez le côté avec une mesure de résistance comme le côté auquel adhérer le tissu. Étiquetez-le et placez toujours une lingette de laboratoire sur le bas de la lame pour éviter toute contamination par la lame. Ensuite, laissez les tissus s’équilibrer dans la chambre du cryostat pendant 30 à 45 minutes.

Nettoyez le cryostat, de préférence avec de l’éthanol à 70%. Essuyez la plaque de rouleau en phase et retirez les lames usagées. Utilisez des lingettes propres supplémentaires pour vous assurer que l’éthanol s’est évaporé et que toutes les surfaces sont sèches avant le début de la section.

Ensuite, ajustez la température de la tête de spécimen de sable de la chambre du cryostat en fonction du type de tissu. Montez le tissu sur le porte-échantillon à l’aide de la reconnaissance optique d’images. Veillez à utiliser suffisamment de TCO pour couvrir la base du bloc OCT et montez le bloc aussi plat que possible.

Placez une lame propre sur la scène et verrouillez-la. Placez la tête de l’échantillon vers la scène au besoin pour obtenir l’angle de coupe souhaité. Ensuite, commencez la coupe en sections épaisses jusqu’à ce que la région d’intérêt soit trouvée.

Brossez constamment les pièces supplémentaires avec un pinceau d’artiste pré-refroidi pour garder la scène propre. Ajustez légèrement la température de la chambre si nécessaire et changez l’épaisseur des sections à 10 à 12 micromètres une fois la région souhaitée atteinte. Rassemblez soigneusement la section souhaitée.

Prenez une lame ITO à température ambiante et positionnez-la sur la section. Approchez doucement la section et collez-la à la lame sans laisser de traces sur l’étage du cryostat. Placez la lame de côté dans un rack ou essuyez le laboratoire à l’extérieur du cryostat entre les collections de plusieurs sections.

Si une comparaison entre différents échantillons de la même cohorte est souhaitée, placez les sections de plusieurs échantillons sur une seule diapositive afin qu’elles puissent être analysées simultanément pour minimiser les variations. Si nécessaire, séparez-les de deux toboggans, car le support de cible Maldi peut accueillir deux toboggans en une seule course. Transportez les lames dans une boîte à vide vers un desséchat avec dessécher comme couche inférieure.

Conduisez les lames sous vide pendant 30 à 60 minutes, puis procédez au dépôt de la matrice. Utilisez deux cinq acides dihydroxybenzoïques, ou DHB, dans l’eau de méthanol comme matrice. Placez les lames dans un transporteur de diapositives et scellez solidement l’ouverture avec le film de cire.

Scellez avec le sac zippé. Placez-le dans un autre sac à fermeture à glissière contenant du déshydratant. Étiquetez l’extérieur et expédiez l’échantillon aux installations principales de Maldi avec une sécheresse oculaire adéquate.

Pour le dépôt de matrice, utilisez 40 milligrammes par millilitre de DHB et d’eau de méthanol comme matrice et pulvérisez-le à l’aide d’un pulvérisateur à matrice automatique HTX M5. Utilisez une pression d’azote gazeux de 10 PSI. Utilisez un temps de vol Maldi, un instrument MS et un mode ion positif pour acquérir un spectre de masse.

Calibrez l’instrument en repérant 0,5 microlitre d’émulsion de phosphore rouge dans l’acéto Nitro sur les lames ITO. Utilisez ses spectres pour calibrer l’instrument dans la gamme de masse de 100 à 1000 MZ en appliquant une courbe d’étalonnage quadratique. Réglez les diamètres des points laser sur moyen car il s’agit du profil de faisceau modulé pour une largeur raster de 40 micromètres et collectez des données d’imagerie en additionnant 500 prises de vue à un taux de répétition laser de 1000 hertz par position de réseau.

Enregistrez ensuite les données spectrales. Effectuez l’analyse des données d’imagerie à l’aide de la normalisation quadratique moyenne pour générer des images ioniques à une bande passante de plus moins 0,10 Dalton. Aligner les spectres de l’OCT et du tissu cérébral de la même expérience à l’aide du logiciel pour évaluer les pics de chevauchement dans l’interférence de suppression ionique de l’OCT.

Enfin, traiter les lames MALDI contenant les échantillons de tissus par hématoxyline et éosine, ou coloration H et E. Les images de l’analyse de Maldi MS ont révélé une diminution générale de la teneur en lipides dans le cerveau du mutant knockout LPR1. Les coupes représentatives du cerveau des mouches adultes colorées H et E sont montrées ici.

Les espèces lipidiques, leurs valeurs MZ respectives et les échelles de la carte thermique sont également indiquées dans cette image. Le pli moyen de réduction du mutant knockout LPR1 par rapport aux témoins d’au moins quatre réplicas biologiques est représenté par des nombres à côté des flèches. Le spectre de masse de la région OCT vierge sélectionnée dans la région du tissu cérébral à partir des mouches témoins et mutantes est montré dans la plage de MZ1 à 1000 et MZ520 à 900.

L’interférence de l’OCT est associée à la fois à des phénomènes de suppression d’ions et à des problèmes de signaux qui se chevauchent. Pour maintenir la fidélité des données lipidomiques, la préparation appropriée des échantillons, la dissection et la cryosection sont cruciales. Après avoir effectué l’expérience de Maldi, l’identité des lipides peut être vérifiée par LCMS, également connu sous le nom de chromatographie liquide, lipodomique basée sur la spectrométrie de masse.

Cette technique permet d’obtenir des informations moléculaires sur l’homéostasie des lipides cérébraux en utilisant le système de modèle puissant à doux qui ouvre la voie à la compréhension des changements métaboliques liés aux maladies humaines dans le cerveau.