Name: Étudier les facteurs d’antirécompense dans le comportement de dépendance avec des méthodes d’expression génique unicellulaire anatomiquement spécifiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez l'analyse transcriptomique unicellulaire par microdissection laser et RT-qPCR microfluidique pour étudier la neuroinflammation dans les troubles psychiatriques liés à l'addiction.

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Le travail présenté ici a été financé par NIH HLB U01 HL133360 attribué à JS et RV, NIDA R21 DA036372 attribué à JS et EVB, T32 AA-007463 attribué à Jan Hoek à l’appui de SJO, et National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

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<li>O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+alcohol+and+opioid+withdrawal+syndromes+suggest+common+negative+reinforcement+mechanisms+involving+the+interoceptive+antireward+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+neuroscience%3A+A+growing+frontier+in+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness.</a> Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+glia+and+neuron+gene+expression+in+the+central+amygdala+in+opioid+withdrawal+suggests+inflammation+with+correlated+gut+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+scale+neuronal+and+glial+gene+expression+and+putative+cell+phenotypes+and+networks+in+the+nucleus+tractus+solitarius+in+an+alcohol+withdrawal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+microfluidic+qpcr+to+analyze+transcriptional+profiles+of+single+cells%3A+A+systems+biology+approach+to+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).</li>
<li>Achanta, S., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+high-throughput+qRT-PCR+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Single cell high-throughput qRT-PCR protocol.</a> Protocols.io. , (2020).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interoceptive+antireward+pathway+and+gut+dysbiosis+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatry%2C+Depression+%26+Anxiety%22%5BJournal%5D)">The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction.</a> Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+reveals+novel+neuronal+phenotypes+and+interaction+networks+involved+in+the+central+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>Staehle, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+patterns+of+gene+expression+in+the+dorsal+vagal+complex+and+the+central+nucleus+of+the+amygdala+-+Non-rhythm-generating+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).</li>
<li>Réus, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammation+and+microglial+activation+in+the+pathophysiology+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders.</a> Neuroscience. 300, 141-154 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+astrocytes+in+major+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders.</a> Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).</li>
<li>Lieber, C. S., DeCarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+alcohol+feeding+and+liver+injury+in+the+baboon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon.</a> Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).</li>
<li>Lieber, C. S., Decarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+ethanol+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic ethanol toxicity.</a> Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).</li>
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<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).</li>
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le trouble lié à la consommation d’alcool demeure une maladie difficile à traiter. Notre groupe a abordé ce trouble en étudiant les processus antirécompense dans une perspective de neuroscience des systèmes. Nous avons mesuré les changements d’expression génique dans les neurones SNT simples et la microglie dans une série de temps de sevrage alcoolique16. Le SNT a été choisi pour son rôle de premier plan dans la dysrégulation autonome qui se produit dans le syndrome de sevrage alcoolique. Nous com...

La dépendance reste un défi croissant dans le monde développé 1,2. Malgré des avancées scientifiques et cliniques majeures, les taux de dépendance continuent d’augmenter tandis que l’efficacité des traitements établis reste stable aumieux3,4,5. Cependant, les progrès de la biotechnologie et des approches scientifiques ont conduit à de nouvelles méthodes et hypothèses pour étudier plus avant la physiopathologie de la dépendance aux substances 6,7,8. En effet, les développements récents suggèrent que de nouveaux concepts et paradigmes de traitement peuvent conduire à des percées avec des conséquences sociales, économiques et politiques 9,10,11,12.
Nous avons étudié l’antirécompense dans le sevrage de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes13,14,15,16. Les méthodes sont au cœur de ce paradigme17,18. La microdissection par capture laser (LCM) peut sélectionner des cellules individuelles avec une spécificité anatomique élevée. Cette fonctionnalité fait partie intégrante de l’hypothèse antirécompense de la neuroinflammation, car la glie et les neurones peuvent être collectés et analysés à partir du même sous-noyau neuronal chez le même animal 13,14,15,16,19. Une partie pertinente du transcriptome de cellules sélectionnées peut ensuite être mesurée avec des réactions en chaîne quantitatives par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR) fournissant des ensembles de données de grande dimension pour l’analyse informatique donnant des informations sur les réseaux fonctionnels20,21.
La mesure d’un sous-ensemble du transcriptome dans les neurones et la glie dans un noyau cérébral spécifique génère un ensemble de données robuste à la fois en nombre d’échantillons et en gènes mesurés, sensible et spécifique. Ces outils sont optimaux pour l’approche neuroscience d’un système à la maladie psychiatrique parce que la glie, principalement les astrocytes et la microglie, ont démontré un rôle central dans les maladies neurologiques et psychiatriques au cours de la dernière décennie22,23. Notre approche permet de mesurer la réponse expressive de la glie et des neurones de manière concomitante à travers de nombreux récepteurs et ligands impliqués dans la signalisation paracrine locale. En effet, la signalisation peut être déduite de ces ensembles de données en utilisant diverses méthodes quantitatives telles que la logique floue24. En outre, l’identification des sous-phénotypes cellulaires dans les neurones ou la glie et leur fonction peut fournir un aperçu de la façon dont les cellules cérébrales dans des noyaux spécifiques s’organisent, répondent et dérégulent au niveau de la cellule unique. La dynamique de ce système fonctionnel peut également être modélisée à l’aide d’expériences de séries chronologiques16. Enfin, les modèles animaux peuvent être perturbés anatomiquement ou pharmacologiquement pour donner une condition mécaniste à l’approche de ce système.
Expérience représentative : Ci-dessous, nous fournissons un exemple de l’application de ces méthodes. Cette étude a examiné l’expression des gènes neuronaux et microgliaux du rat dans le noyau solitaire (SNT) en réponse à la dépendance à l’alcool et au sevrage subséquent16. Les cohortes de rats comprenaient 1) le groupe témoin, 2) l’éthanol-dépendant (EtOH), 3) le retrait de 8 h (Wd), 4) 32 h Wd et 5) 176 h Wd (figure 1A). Après une décapitation rapide, les troncs cérébraux ont été séparés du cerveau antérieur et cryosectionnés, et des tranches ont été colorées pour les neurones tyrosine hydroxylase positive (TH +) et la microglie (Figure 1B). La LCM a été utilisée pour collecter à la fois les neurones TH+ et TH- et la microglie. Toutes les cellules provenaient du SNRC et ont été analysées comme des échantillons de pools de 10 cellules. Quatre réseaux dynamiques RT-qPCR microfluidiques de 96 x 96 ont été exécutés sur la plateforme RT-qPCR mesurant 65 gènes (Figure 1B-C). Les données ont été normalisées à l’aide d’une méthode -ΔΔCt et analysées à l’aide de R, et la sélection d’une cellule unique a été validée avec des marqueurs moléculaires (Figure 1D-E). La validation technique a ensuite été vérifiée par des répliques techniques analysées au sein d’un seul lot et entre les lots (figure 2 et figure 3). Les neurones TH+ et TH- sont organisés en différents sous-phénotypes avec des groupes de gènes inflammatoires similaires, mais des groupes de récepteurs (R) de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) différents (Figure 4 et Figure 5). Les sous-phénotypes qui avaient une expression élevée des groupes de gènes inflammatoires étaient surreprésentés à 32 h Wd, tandis que l’expression du récepteur GABA (GABAR) restait faible dans le sevrage prolongé de l’alcool (176 h Wd). Ces travaux contribuent à l’hypothèse antirécompense de la dépendance à l’alcool et aux opioïdes qui conjecture que la rétroaction interceptive des viscères en sevrage contribue à la dérégulation des noyaux neuronaux viscéraux-émotionnels (c.-à-d. SNT et amygdale) entraînant des séquelles autonomes et émotionnelles plus graves, qui contribuent à la dépendance aux substances (Figure 6).

<table><tbody><tr><td>20X Colorant de liaison à l’ADN</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE Assay Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC pour l’expression génique (appelé puce qPCR dans le texte)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-CD11&beta ; Anticorps</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>Tache microgliale</td></tr><tr><td>Anti-NeuN Anticorps, clone A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Tache neuronale</td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxylase</td><td>ABCAM</td><td>AB112</td><td>Coloration pour neurones TH+</td></tr><tr><td>ArcturusXT Système de microdissection par capture laser</td><td>Arcturus</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>RT-qPCR plate-forme</td></tr><tr><td>Antigène sérique bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp ; LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>NA CellDirect Kit qRT-PCR en une étape</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Composants de la solution tampon de lyse</td></tr><tr><td>CellsDirect Resuspension & Kit de tampon de lyse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11739010</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Nucleus Stain</td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37118</td><td>Seconadry </td></tr><tr><td>Exonucléase d’anticorps I</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>ExtracSure Dispositif d’extraction d’échantillons</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>FisherbrandTM Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Lames en verre ordinaire</td></tr><tr><td>GeneAmp Tube de réaction à paroi mince ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L), Anticorps secondaire recombinant Superclona, Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28180</td><td>Contrôleur d’anticorps Seconadry</td></tr><tr><td>IFC</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix avec Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>NA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Kit de synthèse d’ADNc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11754250</td><td>Contient Protéine VILO et SuperScript</td></tr><tr><td>T4 Gene 32</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>TE</td><td>T0225</td><td></td></tr><tr><td>NA TempPlate Semi-Skirted 96-Well Plaque PCR, 0,2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

Étudier les facteurs d’antirécompense dans le comportement de dépendance avec des méthodes d’expression génique unicellulaire anatomiquement spécifiques

Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods

L’augmentation des taux de comportement de dépendance a motivé les chercheurs en santé mentale et les cliniciens à comprendre l’antirécompense et le rétablissement. Cet éloignement de la récompense et du commencement nécessite de nouvelles perspectives, paradigmes et hypothèses, ainsi qu’une expansion des méthodes appliquées pour étudier la dépendance. Ici, nous fournissons un exemple: Une approche de biologie des systèmes pour étudier l’antirécompense qui combine la microdissection par capture laser (LCM) et les réactions quantitatives en chaîne par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR). La dynamique du réseau d’expression génique a été mesurée et un facteur clé de la dysrégulation neuroviscérale dans le sevrage de l’alcool et des opioïdes, la neuroinflammation, a été identifié. Cette combinaison de technologies fournit une spécificité anatomique et phénotypique à une résolution unicellulaire avec une sensibilité à haut débit et des mesures d’expression génique spécifiques produisant à la fois des ensembles de données génératrices d’hypothèses et des possibilités mécanistes qui génèrent des opportunités pour de nouvelles connaissances et de nouveaux traitements.

La validation de la collecte de cellules uniques est effectuée visuellement pendant les procédures LCM. Les noyaux cellulaires sont évalués à la station QC. Le type de cellule peut être déterminé par l’émission de fluorophore marqué pour ce type de cellule et sa morphologie générale. Si des cellules non désirées ont été sélectionnées sur le capuchon, leur matériel génétique peut être détruit avec un laser UV à la station QC. Une validation supplémentaire par analyse moléculaire est également nécessaire. Dans cet exemple ...

La combinaison de la microdissection par capture laser et de la RT-qPCR microfluidique fournit une spécificité anatomique et biotechnique dans la mesure du transcriptome dans les neurones individuels et la glie. L’application de méthodes créatives avec l’approche biologique d’un système à la maladie psychiatrique peut conduire à des percées dans la compréhension et le traitement telles que l’hypothèse de la neuroinflammation antirécompense dans la dépendance.

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift ...

Le protocole est très sensible et permet une capture à haut débit du profil d’expression génique à une résolution unicellulaire. La technique fournit à la fois une spécificité spatiale et moléculaire anatomique à une résolution cellulaire unique. Après avoir récolté le cerveau, sélectionné les cellules individuelles et préparé l’ARNm, injectez le fluide de la ligne de contrôle dans la puce qPCR pour l’amorçage.Insérez la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Prime et exécutez le programme. Une fois le programme terminé, retirez la puce qPCR amorcée et pipette six microlitres de la réaction de la plaque d’échantillon PCR dans le puits d’échantillon correspondant dans la puce qPCR amorcée.Maintenant, pipeter six microlitres de la réaction de la plaque de dosage PCR dans le puits de dosage correspondant dans la puce qPCR amorcée. Insérez ensuite la puce dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Load Mix et exécutez le programme.Allumez la plateforme microfluidique RT-qPCR et réchauffez l’ampoule. Retirez la puce qPCR du dispositif de mélange microfluidique et décollez l’autocollant de protection du bas de la puce. Ouvrez la plateforme microfluidique RT-qPCR et chargez la puce qPCR dans la plateforme.Lancez le logiciel de collecte de données en cliquant sur Démarrer une nouvelle exécution. Vérifiez le code-barres et le type de puce de la puce. Cliquez ensuite sur suivant.Sélectionnez le fichier d’exécution de la puce et parcourez l’emplacement du fichier pour le stockage de la collecte de données. Cliquez ensuite sur Type d’application et sélectionnez Expression génique. Sélectionnez ROX pour une référence passive, sonde unique et EVAGreen pour le type de sonde.Cliquez pour sélectionner le programme de cyclage thermique et sélectionnez Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. PCL. Téléchargez le logiciel d’analyse de données.Lancez le logiciel pour analyser l’expérience microfluidique RT-qPCR. Cliquez sur Chip Run et ouvrez le ChipRun. BML créé par l’expérimentateur.Une fenêtre affichant les détails expérimentaux, y compris la référence passive, la sonde et le programme thermique PCR, apparaîtra. Sous l’onglet Chip Explorer, cliquez sur Sample Plate Setup (Configuration de la plaque d’échantillon) et créez un nouveau modèle d’échantillon de plaque. Copiez et collez les exemples d’étiquettes dans la feuille de calcul du logiciel selon la conception expérimentale.Entrez le nom de l’échantillon et la concentration d’ARN utilisée pour les échantillons standard. Maintenant, mappez l’exemple configuré en cliquant sur mappage dans le menu des tâches et en sélectionnant SBS96-Left.dsp. Ensuite, sélectionnez Vues détaillées pour mettre à jour ces modifications dans le fichier et cliquez sur Analyser.Sélectionnez Detector Plate Setup (Configuration de la plaque détectrice) et créez une nouvelle plaque d’essai. Sélectionnez le type et le format de conteneur appropriés. Collez les noms des tests selon la conception expérimentale et cliquez sur Analyser.Dans le volet des paramètres d’analyse, cliquez sur Utilisateur et définissez l’ajustement sur auto. Maintenant, examinez manuellement chaque réaction dans la puce 96x96. Visualisez les courbes d’amplification et de fusion pour déterminer si chaque réaction a suivi le modèle qPCR attendu.Si la courbe d’amplification ou de fusion ne correspond pas à ce qui est attendu, échouez cette réaction. Après QC, exportez les données en sélectionnant fichier, en cliquant sur Exporter et en enregistrant le jeu de données en tant que fichier csv. Comme le fichier csv exporté possède à la fois une matrice d’échec de réussite et une matrice avec des valeurs CT brutes, utilisez la matrice d’échec de réussite pour remplacer toutes les cellules défaillantes du jeu de données par NA. Téléchargez la version récente du logiciel open Source R, puis téléchargez l’application R Studio.Pour le centrage médian, utilisez le logiciel R pour calculer la valeur CT médiane calculée à partir de toutes les valeurs CT pour un échantillon individuel, puis soustrayez toutes les valeurs CT individuelles de cette valeur médiane pour obtenir une valeur CT moins delta. Pour la normalisation des gènes d’entretien ménager, calculez l’expression moyenne des gènes d’entretien ménager pour chaque échantillon et utilisez cette valeur pour soustraire les valeurs CT individuelles. Pour générer une valeur CT delta moins delta, exécutez le code dans le logiciel R.Téléchargez le jeu de données normalisé dans R et analysez les données à l’aide de la fonction d’échelle, générez les données mises à l’échelle, puis utilisez la fonction de carte thermique R ou un logiciel distinct pour générer une carte thermique. Pour organiser l’ensemble de données pour d’autres fonctionnalités, calculez les corrélations de Pearson entre chaque gène suivi de la fonction de fusion. Exportez et téléchargez ces données dans un logiciel de réseau de corrélation génétique.Les neurones ont montré une expression élevée de NeuN et les échantillons microgliaux ont montré une expression significative des marqueurs microgliaux Cd34 et Cx3xr1. Les échantillons neuronaux Th + ont démontré une expression significativement élevée de Th par rapport aux échantillons de neurones Th et de microglies. Les neurones Th ont montré une expression significative de Gcg, suggérant que les échantillons de neurones Th sont enrichis avec des neurones qui utilisent Glp1 comme neurotransmetteur.L’analyse linéaire de discrimination a montré que ces trois types de cellules avaient des profils d’expression génique différents pour les 65 gènes. Les sous-phénotypes cellulaires d’échantillons de neurones enrichis en Glp1 par le biais d’une série de temps de sevrage alcoolique ont été représentés à l’aide de cartes thermiques. Le sous-phénotype A, qui exprime fortement le groupe de gènes inflammatoires un, augmente en rapport au point de temps de retrait de huit heures et atteint un maximum à 32 heures de retrait.Le sous-phénotype inflammatoire est normalisé pour contrôler par un retrait de 176 heures. Le sous-phénotype B, qui exprime fortement le deuxième groupe de gènes du récepteur GABA, démontre une suppression globale de l’expression de ce groupe de gènes par la condition de sevrage de 176 heures. L’expression génique des échantillons individuels a été combinée en moyennes afin que l’expression des grappes de gènes et l’emplacement des protéines de ce transcrit de gène puissent être visualisés tout au long de la série chronologique.Cette technique peut être appliquée à n’importe quel système biologique ou tissu pour comprendre la réponse cellulaire à une maladie ou à une perturbation. Il s’agit de déchiffrer la réponse moléculaire à une résolution cellulaire unique relative à l’architecture spatiale et anatomique du tissu.

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