Étudier les facteurs d’antirécompense dans le comportement de dépendance avec des méthodes d’expression génique unicellulaire anatomiquement spécifiques
4 août 2022
La combinaison de la microdissection par capture laser et de la RT-qPCR microfluidique fournit une spécificité anatomique et biotechnique dans la mesure du transcriptome dans les neurones individuels et la glie. L’application de méthodes créatives avec l’approche biologique d’un système à la maladie psychiatrique peut conduire à des percées dans la compréhension et le traitement telles que l’hypothèse de la neuroinflammation antirécompense dans la dépendance.
Le protocole est très sensible et permet une capture à haut débit du profil d’expression génique à une résolution unicellulaire. La technique fournit à la fois une spécificité spatiale et moléculaire anatomique à une résolution cellulaire unique. Après avoir récolté le cerveau, sélectionné les cellules individuelles et préparé l’ARNm, injectez le fluide de la ligne de contrôle dans la puce qPCR pour l’amorçage.
Insérez la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Prime et exécutez le programme. Une fois le programme terminé, retirez la puce qPCR amorcée et pipette six microlitres de la réaction de la plaque d’échantillon PCR dans le puits d’échantillon correspondant dans la puce qPCR amorcée.
Maintenant, pipeter six microlitres de la réaction de la plaque de dosage PCR dans le puits de dosage correspondant dans la puce qPCR amorcée. Insérez ensuite la puce dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Load Mix et exécutez le programme.
Allumez la plateforme microfluidique RT-qPCR et réchauffez l’ampoule. Retirez la puce qPCR du dispositif de mélange microfluidique et décollez l’autocollant de protection du bas de la puce. Ouvrez la plateforme microfluidique RT-qPCR et chargez la puce qPCR dans la plateforme.
Lancez le logiciel de collecte de données en cliquant sur Démarrer une nouvelle exécution. Vérifiez le code-barres et le type de puce de la puce. Cliquez ensuite sur suivant.
Sélectionnez le fichier d’exécution de la puce et parcourez l’emplacement du fichier pour le stockage de la collecte de données. Cliquez ensuite sur Type d’application et sélectionnez Expression génique. Sélectionnez ROX pour une référence passive, sonde unique et EVAGreen pour le type de sonde.
Cliquez pour sélectionner le programme de cyclage thermique et sélectionnez Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. PCL. Téléchargez le logiciel d’analyse de données.
Lancez le logiciel pour analyser l’expérience microfluidique RT-qPCR. Cliquez sur Chip Run et ouvrez le ChipRun. BML créé par l’expérimentateur.
Une fenêtre affichant les détails expérimentaux, y compris la référence passive, la sonde et le programme thermique PCR, apparaîtra. Sous l’onglet Chip Explorer, cliquez sur Sample Plate Setup (Configuration de la plaque d’échantillon) et créez un nouveau modèle d’échantillon de plaque. Copiez et collez les exemples d’étiquettes dans la feuille de calcul du logiciel selon la conception expérimentale.
Entrez le nom de l’échantillon et la concentration d’ARN utilisée pour les échantillons standard. Maintenant, mappez l’exemple configuré en cliquant sur mappage dans le menu des tâches et en sélectionnant SBS96-Left.dsp. Ensuite, sélectionnez Vues détaillées pour mettre à jour ces modifications dans le fichier et cliquez sur Analyser.
Sélectionnez Detector Plate Setup (Configuration de la plaque détectrice) et créez une nouvelle plaque d’essai. Sélectionnez le type et le format de conteneur appropriés. Collez les noms des tests selon la conception expérimentale et cliquez sur Analyser.
Dans le volet des paramètres d’analyse, cliquez sur Utilisateur et définissez l’ajustement sur auto. Maintenant, examinez manuellement chaque réaction dans la puce 96x96. Visualisez les courbes d’amplification et de fusion pour déterminer si chaque réaction a suivi le modèle qPCR attendu.
Si la courbe d’amplification ou de fusion ne correspond pas à ce qui est attendu, échouez cette réaction. Après QC, exportez les données en sélectionnant fichier, en cliquant sur Exporter et en enregistrant le jeu de données en tant que fichier csv. Comme le fichier csv exporté possède à la fois une matrice d’échec de réussite et une matrice avec des valeurs CT brutes, utilisez la matrice d’échec de réussite pour remplacer toutes les cellules défaillantes du jeu de données par NA. Téléchargez la version récente du logiciel open Source R, puis téléchargez l’application R Studio.
Pour le centrage médian, utilisez le logiciel R pour calculer la valeur CT médiane calculée à partir de toutes les valeurs CT pour un échantillon individuel, puis soustrayez toutes les valeurs CT individuelles de cette valeur médiane pour obtenir une valeur CT moins delta. Pour la normalisation des gènes d’entretien ménager, calculez l’expression moyenne des gènes d’entretien ménager pour chaque échantillon et utilisez cette valeur pour soustraire les valeurs CT individuelles. Pour générer une valeur CT delta moins delta, exécutez le code dans le logiciel R.
Téléchargez le jeu de données normalisé dans R et analysez les données à l’aide de la fonction d’échelle, générez les données mises à l’échelle, puis utilisez la fonction de carte thermique R ou un logiciel distinct pour générer une carte thermique. Pour organiser l’ensemble de données pour d’autres fonctionnalités, calculez les corrélations de Pearson entre chaque gène suivi de la fonction de fusion. Exportez et téléchargez ces données dans un logiciel de réseau de corrélation génétique.
Les neurones ont montré une expression élevée de NeuN et les échantillons microgliaux ont montré une expression significative des marqueurs microgliaux Cd34 et Cx3xr1. Les échantillons neuronaux Th + ont démontré une expression significativement élevée de Th par rapport aux échantillons de neurones Th et de microglies. Les neurones Th ont montré une expression significative de Gcg, suggérant que les échantillons de neurones Th sont enrichis avec des neurones qui utilisent Glp1 comme neurotransmetteur.
L’analyse linéaire de discrimination a montré que ces trois types de cellules avaient des profils d’expression génique différents pour les 65 gènes. Les sous-phénotypes cellulaires d’échantillons de neurones enrichis en Glp1 par le biais d’une série de temps de sevrage alcoolique ont été représentés à l’aide de cartes thermiques. Le sous-phénotype A, qui exprime fortement le groupe de gènes inflammatoires un, augmente en rapport au point de temps de retrait de huit heures et atteint un maximum à 32 heures de retrait.
Le sous-phénotype inflammatoire est normalisé pour contrôler par un retrait de 176 heures. Le sous-phénotype B, qui exprime fortement le deuxième groupe de gènes du récepteur GABA, démontre une suppression globale de l’expression de ce groupe de gènes par la condition de sevrage de 176 heures. L’expression génique des échantillons individuels a été combinée en moyennes afin que l’expression des grappes de gènes et l’emplacement des protéines de ce transcrit de gène puissent être visualisés tout au long de la série chronologique.
Cette technique peut être appliquée à n’importe quel système biologique ou tissu pour comprendre la réponse cellulaire à une maladie ou à une perturbation. Il s’agit de déchiffrer la réponse moléculaire à une résolution cellulaire unique relative à l’architecture spatiale et anatomique du tissu.
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Aperçu
Cette étude exploite la microdissection par capture laser et la RT-qPCR microfluidique pour analyser les transcriptomes de neurones et de cellules gliales individuels. Elle met l'accent sur la haute sensibilité et spécificité de la méthode, qui pourrait approfondir notre compréhension des maladies psychiatriques associées à la neuroinflammation, notamment dans le contexte de la dépendance.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Analyse transcriptionnelle
- Troubles psychiatriques
Contexte
- Comprendre les profils d'expression de l'ARN dans les neurones et les cellules gliales est essentiel pour élucider les maladies psychiatriques.
- Les méthodes antérieures manquaient à la fois de spécificité spatiale anatomique et de spécificité moléculaire.
- L'inflammation neurologique a été mise en cause dans l'hypothèse antirécompense de la dépendance.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode sensible permettant de capturer les profils d'expression génique à une résolution unicellulaire.
- Analyser la manière dont ces modifications moléculaires sont liées aux réponses comportementales dans les troubles psychiatriques.
- Évaluer le rôle de la neuroinflammation dans les mécanismes liés à l'addiction.
Méthodes utilisées
- La RT-qPCR microfluidique a été utilisée, permettant une collecte de données à haut débit à partir de cellules uniques.
- Des cellules uniques ont été isolées à partir de tissu cérébral après la récolte, en vue de la préparation et de l'analyse de l'ARNm.
- Des protocoles détaillés pour l'amorçage de la puce, la collecte des données et l'analyse ont été mis en œuvre.
- Les données d'expression génique ont été validées et analysées à l'aide de logiciels statistiques.
Résultats principaux
- Les neurones présentaient une expression élevée de NeuN, tandis que les microglies montraient une expression significative de Cd34 et de Cx3xr1.
- Différents sous-types ont été identifiés selon les profils d'expression génique, notamment en réponse au sevrage et à la neuroinflammation.
- Les conclusions principales concernant les groupes de gènes et leur régulation lors d'un stress de sevrage ont été tirées d'analyses de cartes thermiques.
Conclusions
- L'étude démontre que la combinaison de ces méthodologies permet une compréhension approfondie des réponses spécifiques aux types cellulaires dans le cadre de la neuroinflammation.
- Les connaissances acquises pourraient contribuer à l'élaboration d'approches thérapeutiques ciblées pour les troubles psychiatriques impliquant la dépendance.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le profilage de l'expression génique à l'échelle de la cellule unique avec une spécificité anatomique permet une réduction mécanistique des risques dans la découverte de cibles neuropsychiatriques, en particulier pour les voies liées à l'addiction et à l'antirécompense. Cette approche offre une vision haute résolution des facteurs déclenchants de la neuroinflammation, renforçant la confiance prédictive à l'intersection entre la pathologie moléculaire et les phénotypes comportementaux. L'intégration de ces méthodes dans les phases précoces des pipelines de découverte améliore le tri du portefeuille et la continuité translationnelle pour le développement de médicaments du système nerveux central.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'interroger les hypothèses neuroinflammatoires et d'antirécompense à une résolution unicellulaire.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en associant l'expression génique à la spécificité anatomique et phénotypique.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques pour les cibles du SNC impliquées dans la dépendance et le sevrage.
- Améliore la confiance prédictive pour le développement de cibles neuropsychiatriques.
Développement de criblage et de tests
- Prépare des systèmes cellulaires validés pour des criblages transcriptomiques et phénotypiques en aval.
- Fournit des données quantitatives et reproductibles d'expression génique pour la standardisation des tests.
- Permet une analyse à haut débit des réseaux géniques dans des types cellulaires définis.
- Facilite une évaluation fiable des effets des composés sur les voies neuroinflammatoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les découvertes moléculaires avec les systèmes neuroanatomiques pertinents pour la maladie dans les modèles de dépendance.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique des biomarqueurs de neuroinflammation.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque pour les programmes thérapeutiques du système nerveux central.
- Améliore le développement de biomarqueurs translationnels en associant l'expression génique aux phénotypes de sevrage.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode établit un lien entre la phase initiale de découverte et la recherche préclinique en permettant une analyse de l'expression génique à haut débit et anatomiquement précise dans les tissus du SNC.
- Biologie de la découverte : Soutient la validation d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans la neuroinflammation et les mécanismes d'antirécompense.
- Écrantage : Fournit des données reproductibles et quantitatives d'expression génique pour le développement d'essais et l'écrantage de composés.
- Analytique : Génère des jeux de données évolutifs pour l'analyse de réseaux, la cartographie thermique et la comparaison statistique des phénotypes cellulaires.
- Recherche translationnelle : Relie les signatures moléculaires à des états de sevrage pertinents pour la maladie et à l'alignement de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable de transcriptomique unicellulaire applicable à divers modèles du SNC et de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles du système nerveux central.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles normalisés, évolutifs et reproductibles d'expression génique à l'échelle de la cellule unique.
- Valeur stratégique : Permet des décisions éclairées d'aller/arrêt et une gestion efficace du portefeuille en recherche et développement neuropsychiatrique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, de candidats thérapeutiques pour le système nerveux central.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microdissection laser et sur des plateformes de RT-qPCR microfluidiques.
- Exige une infrastructure analytique robuste pour le traitement des données à haut débit et l'analyse de réseaux.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des échantillons et de normalisation des données.
- Adaptable à divers tissus du système nerveux central et modèles de maladies moyennant une optimisation appropriée.
- Dépend de l'accès à des instruments spécialisés et à un soutien en bioinformatique.
