Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a

Huang long bing, abrégé en HLB. C’est une maladie des agrumes dévastatrice dans le monde entier. Dans les pays les plus producteurs d’agrumes, tels que la Chine et les États-Unis, le HLB est causé par la bactérie restreinte au phloème Candidatus Liberibacter asiaticus, abrégée en CLas.

La détection précoce des NCas était importante pour les producteurs, facilitant l’intervention précoce et prévenant la propagation des maladies. Nous avons donc développé ici une nouvelle méthode pour le diagnostic rapide et portable du HLB, combinant avec l’amplification de la polymérase recombinase et le système CRISPR-Cas12a. Nous l’avons appelé CLas-DETECTR.

La sensibilité de notre plateforme est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, il montre un résultat similaire avec la qPCR lorsque les échantillons de feuilles ont été utilisés. Comparez avec les détections CLas conventionnelles, notre méthode peut être terminée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme.

Le résultat peut également être visualisé à l’aide d’un dispositif de détection fluorescent portatif sur le terrain. Le CLas-DETECTR contient quatre étapes: la préparation de la solution, l’isolement de l’ADN total des agrumes, l’amplification isotherme de l’ADN et les résultats de la visualisation. Le schéma du test CLas-DETECTR est illustré ici.

Les tampons A, B et C sont préparés comme décrit dans le protocole. Pour gagner du temps et rendre cette méthode adaptée à la détection de CLas sur le terrain, l’approche à base de polyéthylèneglycol E. coli a été utilisée pour obtenir des extraits bruts de plantes pour l’amplification de l’ADN. Les feuilles d’agrumes sont utilisées dans l’outil.

Poinçonner les quelques morceaux de disques de feuilles de la feuille. Mettez les disques foliaires dans un tube d’Eppendorf de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon A dans le tube.

Broyer manuellement les disques de feuilles jusqu’à consistance lisse. Laissez le tube intact pendant 10 minutes. Le surnageant est ensuite appliqué à l’amplification de l’ADN.

Pour l’amplification isotherme de l’ADN, ajouter un microlitre de surnageant de l’étape 2.3 et un microlitre d’acétate de magnésium dans la solution B et bien mélanger. En laboratoire, incuberez-les dans un simple incubateur à 37 degrés pendant 15 minutes. Pour visualiser les résultats, ajoutez 10 microlitres du mélange de l’étape 3.2 dans la solution C et mélangez bien.

Incuberez-les dans l’incubateur à 37 degrés pendant 60 minutes. Portez un masque de protection et observez le signal de fluorescence verte à l’aide d’un dispositif de détection fluorescent portatif. Pour tester la spécificité de CLas-DETECTR, premières colonies pures d’Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

citri qui est l’agent pathogène du chancre des agrumes et Burkholderia stabilis souche 1440 isolé dans notre laboratoire ont été utilisés pour extraire leur ADN génomique. Ensuite, cet ADN génomique de trois bactéries et l’ADN génomique des feuilles de Newhall CLas positives ont été soumis au test CLas-DETECTR. Pour tester la sensibilité de CLas-DETECTR, une série de dilutions de fragments d’ADN CLas a été détectée par PCR, CLas-DETECTR et qPCR comme décrit dans le protocole Après le test de spécificité et de sensibilité, la méthode CLas-DETECTR a été utilisée pour détecter la présence des CLas sur le terrain.

Échantillons de feuilles prélevés sur l’oranger doux de Newhall cultivé dans la pépinière de ressources en germoplasme sur le campus de l’Université normale de Gannan, Jiangxi, Chine. qPCR, une méthode convaincante de détection CLas habituellement utilisée en laboratoire, a également été appliquée. Les échantillons de feuilles de l’arbre de Newhall infecté et non infecté par HLB, dans lesquels la présence du CLas a été confirmée dans notre laboratoire, ont été soumis au test CLas-DETECTR.

Le signal de fluorescence verte a été capturé dans l’échantillon infecté par HLB, mais pas dans le témoin HLB non infecté et négatif. Nous avons déterminé la spécificité de CLas-DETECTR en utilisant des acides nucléiques extraits d’autres bactéries. Dans le test CLas-DETECTR, seul l’ADNg extrait des feuilles de Newhall CLas positives a démontré des signaux fluorescents verts.

L’ADNg extrait d’Agrobacterium tumefaciens GV3101, de Xanthomonas citri subsp. citri et de la souche 1440 de Burkholderia stabilis ne l’a pas fait, ce qui signifie que le CLas-DETECTR peut détecter spécifiquement les CLas. Nous avons également testé la sensibilité de CLas-DETECTR en utilisant une série de dilutions d’ADN CLas, énumérées dans le protocole.

La PCR peut détecter 201 copies par mégalitre. D’autre part, CLas-DETECTR peut détecter 2,01 copies par mégalitre, ce qui suggère sa disponibilité en tant que diagnostic de terrain sensible. qPCR peut détecter 0,201 copie par mégalitre et la valeur Ct est supérieure à 36.

Ainsi, CLas-DETECTR est deux ordres de grandeur plus sensible que la PCR traditionnelle et un ordre de grandeur moins sensible que qPCR lorsque des amplicons spécifiques CLas dilués ont été utilisés. Enfin, nous avons réexaminé la faisabilité du CLas-DETECTR pour les échantillons de terrain et comparé sa sensibilité à la qPCR. En chiffres, on le voit.

Nous pouvons voir que la valeur Ct est supérieure à 36 lorsque la concentration CLas est inférieure à 0,2 copie par mégalitre, ce qui est une concentration très faible. Parmi les 15 échantillons, la valeur Ct des échantillons 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 et 14 détectés par qPCR était inférieure à 36. Un signal de fluorescence vert apparent a été observé.

D’autre part, lorsque la valeur Ct des échantillons 6, 7, 9, 12 et 15 détectés par qPCR était indéterminée, aucun signal fluorescent vert n’a été observé. De plus, de faibles signaux fluorescents verts ont été observés lorsque la valeur CT des échantillons 5 et 11 détectés par qPCR était supérieure à 36. Les résultats suggèrent que notre plateforme est un outil rapide, robuste et sensible pour le diagnostic HLB sur le terrain.