Détection rapide et spécifique des infections à Acinetobacter baumannii à l’aide d’un système d’amplification par polymérase recombinase/système à base de Cas12a

Mes recherches portent sur les maladies respiratoires et les infections. J’aborderai les technologies actuelles qui progressent dans ce domaine et les lacunes de recherche de l’ensemble du domaine du projet. Les technologies clés dont nous parlons ici comprennent le séquençage de nouvelle génération, CRISPR, le séquençage de l’ARN unicellulaire et les modèles d’analyse d’organes. Ils ont un chiffre dur en ce qui concerne le diagnostic des maladies cardiaques standard fonctionnent et proposent un meilleur traitement. Mon protocole répond au besoin de détection rapide et spécifique d’Acinetobacter baumannii, en surmontant les limites des questions de diagnostic actuelles telles que les techniques chronophages et basées sur la culture.

[Narrateur] Pour commencer, concevez 12 paires d’amorces à l’aide d’outils de conception d’amorces basés sur des principes de conception standard. Obtenez quatre amorces directes et trois amorces inverses pour composer 12 paires d’amorces. Évaluez la spécificité et l’efficacité de chaque paire d’amorces à l’aide de l’outil Primer-BLAST du National Center for Biotechnology Information. Concevez ensuite l’ARN CRISPR ou l’ARN guide ou l’ARNg en utilisant la séquence d’échafaudage d’ARN CRISPR LbaCas12a comme séquence fixe. Incorporez un segment spécifique à la cible, en veillant à ce que le motif adjacent au protospacer ou PAM soit situé à l’extrémité cinq premiers du brin non complémentaire. Pour la construction du plasmide recombinant positif, amplifiez d’abord le segment d’ADNr 16S d’Acinetobacter baumannii à l’aide des ensembles d’amorces avant et arrière. Préparez le mélange de réaction PCR de 50 microlitres tel qu’indiqué à l’écran. Définissez les conditions de cycle PCR sur la machine PCR. Après avoir purifié le produit PCR positif, clonez-le dans un vecteur PUC57 qui a été digéré avec les enzymes BamHI et SalI. Diluez le plasmide recombinant positif en série par dizaines avec de l’eau stérilisée doublement distillée. Conservez le plasmide dilué à moins 20 degrés Celsius pour une expérience plus approfondie. Ensuite, mélangez le tampon de réhydratation sans apprêt, les amorces avant et arrière d’A. baumannii et de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 465 microlitres. Vortex et faites tourner brièvement le mélange avant de le transférer dans des tubes de réaction enzymatique à partir du kit RPA. Bien mélanger et ajouter 25 microlitres d’acétate de magnésium de 280 millimolaires. Ensuite, pipetez un microlitre du plasmide recombinant positif, contenant 10⁷ copies par microlitre à la solution A avec différentes paires d’amorces. Incuber la solution à 39 degrés Celsius pendant 20 minutes. Purifiez ensuite les produits amplifiés à l’aide d’un kit de purification RPA. Appliquez le produit purifié sur un gel d’agarose à 1 % à 120 volts pendant 10 minutes pour identifier la paire d’amorces avec la bande la plus brillante et la plus large. Pour optimiser le système d’amplification RPA, maintenez les concentrations de tous les autres composants de la réaction constantes tout en ajustant le volume final de la solution A à 465 microlitres. Ajoutez ensuite des volumes appropriés d’eau doublement distillée sans ARN pour obtenir les concentrations finales de l’amorce telles qu’elles ont été données et incubez. Après avoir purifié et électrophorisé le produit RPA, identifiez la concentration optimale de l’amorce et le temps d’incubation en analysant l’intensité et la distribution de la bande. Pour préparer la solution B, mélangez un rapporteur d’ADN simple brin, un tampon de réaction CAST12a, un ARN CRISPR CAST12a et de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 15 microlitres. Ajoutez cinq microlitres du produit d’amplification par polymérase recombinase ou RPA dans la solution B. Mélangez soigneusement jusqu’à ce que l’homogénéité soit homogène. Placez les échantillons dans un instrument de PCR quantitative par fluorescence. Pour les tests de spécificité, obtenez des matrices d’ADN de diverses espèces à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN de référence ou en faisant bouillir des bactéries dans de l’eau. Utilisez l’eau comme contrôle négatif. Transférez 10 nanogrammes, soit un microlitre, des matrices d’ADN dans la solution A contenant des amorces avant et arrière. Puis pipette 25 microlitres d’acétate de magnésium 280 millimolaires. Bien mélanger et incuber à 39 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, ajoutez cinq microlitres du produit de réaction à la solution B et mélangez. Placez les échantillons dans un instrument de PCR quantitative à fluorescence. Réglez la chaîne sur FAM et lisez le signal fluorescent toutes les minutes à 39 degrés Celsius pendant un total de 60 minutes. Pour l’évaluation de la sensibilité de la plateforme de détection basée sur RPA-CRISPR CAST12a, utilisez un plasmide recombinant positif dilué à des concentrations allant de un à 10 copies par microlitre comme matrice de la réaction. Utilisez l’eau comme contrôle négatif. Transférez le plasmide dans la solution A, ajoutez de l’acétate de magnésium et incubez comme démontré précédemment. Après l’incubation et le transfert dans la solution B, lire le signe fluorescentAl. La paire d’amorces F3-R3 a été identifiée comme la plus efficace pour l’amplification de la polymérase recombinase, affichant les bandes les plus brillantes et les plus denses sur électrophorèse sur gel d’agarose. La concentration optimale de l’amorce pour l’amplification a été déterminée à 0,44 micromolaire et le temps de réaction optimal était de 20 minutes. L’intensité de fluorescence de l’ARN1 de CRISPR a augmenté au fil du temps, contrairement à l’ARN2 de CRISPR, ce qui a conduit à la sélection de l’ARN1 de CRISPR pour la détection d’A. baumannii. L’analyse de spécificité a confirmé que le système de détection d’A. baumannii a détecté exclusivement l’ADN d’A. baumannii, sans qu’aucune fluorescence n’ait été observée pour d’autres échantillons d’ADN bactérien. Le système pouvait détecter aussi peu qu’une copie par microlitre d’ADN, ce qui le rendait très sensible. Le test de la bandelette à flux latéral a confirmé la grande spécificité de la méthode de détection, ne montrant aucune réactivité croisée avec d’autres espèces bactériennes. Le test A. baumannii a détecté avec succès de l’ADN dans des dilutions allant de 10 copies par microlitre à une seule copie par microlitre, confirmant ainsi sa robustesse sous la lumière UV.