Cartographie de la densité absolue de l’ADN dans les noyaux cellulaires à l’aide de la microscopie de localisation à molécule unique

La méthode actuelle permet de mesurer la densité absolue de l’ADN dans les noyaux cellulaires afin d’étudier les contraintes spatiales dans les structures de la chromatine qui ne sont autrement caractérisées que par des modifications d’histones post-traduction. La tessellation de Voronoï combinée à la SMLM permet d’estimer la densité absolue de l’ADN en termes de paire de bases par micromètre carré. La seule connaissance a priori nécessaire est la teneur totale en ADN du noyau cellulaire mesuré.

Dans les expériences futures, il serait intéressant d’étudier si les différences de densité absolues sont corrélées avec des informations biologiques provenant d’autres méthodes, telles que l’immunofluorescence des modifications épigénétiques ou les données Hi-C. Commencez par reconstruire la zone numérisée en mosaïque les images individuelles préenregistrées. Ouvrez CellProfiler, puis chargez le pipeline cellcycleanalysis.cpproj.

Dans les images de la première étape du pipeline, faites glisser et déposez les images, y compris l’image de référence. Ensuite, définissez un emplacement où les images de référence seront stockées. Cliquez ensuite sur l’icône Démarrer le mode de test, puis sur Exécuter.

Une fois l’histogramme des noyaux de l’image à analyser affiché, déterminez les intervalles d’intensité pour les phases G1, S et G2, et assurez-vous qu’ils sont renseignés dans les étapes suivantes de l’objet filtre du pipeline et que ces étapes sont actives. Cliquez ensuite à nouveau sur le bouton Exécuter pour poursuivre la seconde moitié du pipeline. Regardez les trois images avec les superpositions représentant les différents stades du cycle cellulaire, G1, S ou G2, et sélectionnez les noyaux dans G1 ou G2 pour une imagerie plus poussée afin que la quantité d’ADN dans les paires de bases des noyaux d’image soit connue.

Déplacez les cellules sur le microscope de localisation de molécule unique et assurez-vous que le processus FPALM clignote correctement. Tout d’abord, enregistrez une pile 3D du noyau choisi en utilisant uniquement 500 images par tranche. Cela permet de déterminer la quantité relative d’ADN dans la section médiane, qui est ensuite imagée avec beaucoup plus d’images pour révéler son ultrastructure.

Commencez l’acquisition de la série d’images en utilisant un temps d’exposition de 50 millisecondes, ce qui donne une fréquence d’images d’environ 20 images par seconde. Prenez une pile Z à travers le noyau avec des intervalles de pas de 200 nanomètres et seulement 500 images par section optique légère. Une fois la pile acquise, revenez à la position z initiale et acquérez l’ensemble de données principal de 50 000 images avec le même temps d’exposition de 50 millisecondes.

Ouvrez l’ensemble de données FPALM dans ImageJ. Pour optimiser les paramètres de détection des signaux clignotants, cliquez sur ThunderSTORM, puis sur Exécuter l’analyse. Maintenant, choisissez Configuration de l’appareil photo.

Entrez la taille de pixel correcte des données d’image, le nombre A/N, l’efficacité quantique de la caméra utilisée, le niveau de base et le gain EM, puis cliquez sur OK. Choisissez l’algorithme pour déterminer les coordonnées de localisation en ajustant les signaux clignotants. Dans la section Filtrage d’image, utilisez le filtre d’ondelettes B-Spline avec une échelle B-Spline d’ordre 3 et une échelle B-Spline 2. Ensuite, définissez la méthode de localisation approximative des molécules sur Maximum local, définissez le seuil d’intensité de crête et la connectivité sur 8-neighborhood.

Dans la section Localisation des molécules dans les sous-pixels, en tant que méthode, choisissez PSF integrated Gaussian, définissez Rayon d’ajustement px sur 3, sélectionnez Méthode d’ajustement comme Vraisemblance maximale et définissez Initial sigma sur 1,6. Cliquez ensuite sur OK pour lancer la détection des signaux et la reconstruction de l’image. Si l’acquisition est partitionnée en différentes piles d’images, concaténez les tables de localisation dans ThunderSTORM.

Pour ce faire, cliquez sur Importer dans la fenêtre contextuelle. Assurez-vous que l’option Ajouter à la table actuelle est activée et que le numéro de départ correct est utilisé pour éviter de remplacer les localisations dans la table. Sélectionnez ensuite le chemin d’accès au fichier et cliquez sur OK pour importer un fichier après l’autre.

Pour éviter le surcomptage des signaux sur des trames consécutives, fusionnez les données de localisation à l’aide d’une distance maximale de 20 nanomètres, de 1 image désactivée maximale et de 0 image maximale par molécule, puis cliquez sur Fusionner. Pour mesurer et corriger la dérive en corrélant des sous-sections de données, ouvrez le menu Correction de la dérive et cliquez sur les flèches. Ajoutez 3 bacs et réglez l’agrandissement sur 5.

Cliquez ensuite sur Appliquer, et la fenêtre montrant la dérive x et y apparaîtra. Pour déterminer la quantité de signal proportionnelle au contenu en ADN dans chaque tranche de la pile 3D préenregistrée avec 500 images pour chaque tranche, choisissez Plugins, puis ThunderSTORM, puis Import/Export, et importez le tableau des résultats pour la première tranche de la pile. Pour éviter de surcompter les signaux provenant d’autres plans d’image de la pile 3D, les signaux provenant de l’extérieur de l’intervalle de pas de 200 nanomètres en z entre les tranches doivent être supprimés.

Appuyez sur Tracer l’histogramme et, dans la boîte de dialogue Distribution, choisissez z et appuyez sur OK. Déterminez la position du pic et utilisez le champ de filtre pour sélectionner les signaux avec une taille de pas optique de 200 nanomètres. Cliquez sur Visualisation et choisissez l’option Histogrammes, puis cliquez sur OK. Enregistrez l’image résultante dans un dossier au format TIFF. Ouvrez toutes les tranches et combinez-les à l’aide de l’option Image, puis de l’option Piles, puis de l’option Images à empiler.

Après avoir sélectionné toute la zone de l’image, allez dans Analyser, cliquez sur Outils et sélectionnez le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Ajouter, puis sur Analyser, puis sur Définir les mesures et sélectionnez Densité intégrée. Maintenant, choisissez l’option Plus, sélectionnez Multi Mesure, cochez Mesurer toutes les piles ainsi qu’Une ligne par tranche.

Cliquez sur OK et les résultats s’affichent. La somme des intensités de toutes les tranches est proportionnelle au contenu en ADN de l’ensemble du noyau, de la même manière que les intensités des tranches individuelles sont proportionnelles à leur fraction de l’ensemble du génome. Après avoir ouvert le tableau des résultats du plan central qui contient les signaux de 50 000 images, filtrez-le à une épaisseur de 100 nanomètres.

Créez l’histogramme des signaux résultants comme illustré précédemment, et mesurez la densité intégrée de la section centrale. Convertissez la grande table de localisation ThunderSTORM contenant les informations ultrastructurelles de la section centrale du format csv au format ORTE en exécutant le script MATLAB TS2orte. m, qui transforme la table de localisation en matrice MATLAB et l’enregistre au format mat.

Allez dans le dossier LAND-voronoi, et dans le sous-dossier coreAlgorithm, ouvrez le fichier voronoicluster. m et ajustez le contenu en ADN, la fraction de la section centrale observée de la fraction du noyau entier et les localisations, ainsi que le facteur de conversion en fonction du type de cellule utilisé et de l’étape du cycle cellulaire pour les calculs de densité absolue. Editez le script qui démarre l’analyse voronoi.m.

Ajustez le chemin d’accès au fichier pour les données de localisation orte et le dossier de sortie pour les fichiers de résultat. Spécifiez les coordonnées définissant la zone dans laquelle la tessellation doit être effectuée. Définissez plusieurs zones à calculer dans le même jeu de données d’entrée.

Après avoir exécuté le script, recherchez l’image montrant les densités absolues d’ADN ainsi que d’autres fichiers contenant des graphiques montrant l’histogramme de la distribution de la zone et des densités. m contenant les densités de chaque cellule de Voronoï calculée dans le dossier de sortie. La mesure FPALM composée de 50 000 images a donné 2,68 fois 10 à la puissance de 6 localisations détectées dans une section médiane de 100 nanomètres d’épaisseur.

La précision de localisation de l’image reconstruite était de 10 nanomètres. Le grand nombre de localisations a permis de combiner une imagerie à super résolution tout en montrant des densités d’ADN absolues. Il était évident que les densités d’ADN mesurées n’étaient pas uniformément réparties dans le noyau et couvraient une large gamme dynamique.

Des grossissements plus élevés des zones à l’intérieur du noyau montrant des cellules de Voronoï plus grandes indiquaient de faibles densités d’ADN, tandis que des cellules plus petites indiquaient des densités d’ADN élevées. Les densités d’ADN mesurées dans un demi-noyau G1C3H10T ont montré la distribution absolue de la densité de l’ADN dans le noyau d’un type et d’une espèce différents. Bien que l’organisation de base ressemblait au noyau précoce de HeLa G1, elle possédait également des amas constitutifs d’hétérochromatine paracentrique.

Aucun changement architectural spectaculaire n’a été observé dans un noyau G2 malgré une légère augmentation de la taille du noyau. Le noyau HeLa traité avec TSA a montré des différences remarquables en ce qui concerne la topographie nucléaire et la densité de l’ADN. À l’exception de l’hétérochromatine périphérique, qui présentait des îlots de densité d’ADN plus élevée, le reste de la chromatine semblait beaucoup plus homogène et décondensé.