Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels

Ons protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt om ziekten te creëren in hydrogels die sterk lijken op de aard van kraakbeenweefsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om ziekten te produceren in hydrogels met duidelijke biologische activiteit in ruimtelijke structuur, lage immunogeniciteit en biologische industriële functie. Hak om te beginnen het verzamelde kraakbeen met een scalpel in stukjes van één tot twee kubieke millimeter groot.

Dompel in een centrifugebuis van 50 millimeter 20 gram van het gehakte kraakbeen onder in 20 milliliter hypotone Tris-hydrochloridebuffer. Zet de buis drie uur op 80 graden Celsius en daarna drie uur in de oven op 37 graden Celsius. Draai de centrifugebuis gedurende 30 seconden op 1000 RPM.

Filter vervolgens het gedecellulariseerde kraakbeen met behulp van een plastic zeef die op een centrifugebuis van 50 milliliter is geplaatst. Was het kraakbeen driemaal met steriele PBS voordat u het opvangt. Voeg 10 milliliter trypsine-oplossing toe aan het verzamelde kraakbeen en incubeer het gedurende 24 uur op een shaker bij 37 graden Celsius, waarbij de trypsine om de vier uur wordt vervangen.

Was na het filteren van de suspensie het getrypsiniseerde kraakbeen met hypertone buffer. Zodra het kraakbeen behouden is, voeg je 10 milliliter nuclease-oplossing toe en plaats je deze gedurende vier uur op een shaker bij 37 graden Celsius. Voeg na het wassen met steriele PBS hypertone Tris-hydrochloride-oplossing toe aan het kraakbeen en plaats deze op de shaker zoals getoond.

Eenmaal gewassen met steriele PBS, dompelt u het weefsel gedurende 24 uur onder in 1%Triton X-100-oplossing. Spoel na het verwijderen van de Triton X-100 het gedecellulariseerde kraakbeen gedurende drie dagen af met gedestilleerd water en ververs het water elke 12 uur. Voeg na drie dagen perazijnzuuroplossing toe aan het kraakbeen en laat het vier uur weken.

Eenmaal gewassen met PBS, vangt u het kraakbeen op met behulp van een plastic zeef, zoals eerder gedemonstreerd. Bereid met vloeibare stikstof gedecellulariseerd kraakbeenpoeder. Voeg 80 milliliter 0,5 molair azijn en 20 milligram pepsine toe aan twee gram kraakbeenpoeder en verteer het mengsel gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Centrifugeer de suspensie na de digestie gedurende 10 minuten bij 400 G en vang het supernatant op, dat nu DC-ECM-oplossing wordt genoemd Voor het bewaren van de DC-ECM-oplossing, voegt u één milliliter van de oplossing toe aan elk putje van een plaat met zes putjes en plaatst u deze in een lyofilisator. Zodra de oplossing is gevriesdroogd, brengt u deze over in een centrifugebuis. Om een hydrogel te vormen, lost u 20 milligram gevriesdroogde DC-ECM-oplossing op in één milliliter steriel gedestilleerd water.

Eenmaal gewerveld, voeg je één milligram vitamine B2 toe aan de DC-ECM-oplossing. Bestraal het na incubatie gedurende drie minuten met UV-licht. Voeg buffer GTL en proteïnase K toe aan 20 milligram DC-ECM-kraakbeenpoeder en meng grondig met behulp van vortexoscillatie.

Voor volledige oplossing van het kraakbeen incubeert u het mengsel gedurende vier uur bij 56 graden Celsius. Eenmaal gewerveld, voeg je 200 microliter buffer GTL toe, gevolgd door watervrije ethanol. Centrifugeer het monster na het vortexen gedurende één minuut bij 6000 G bij vier graden Celsius.

Verzamel en kwantificeer vervolgens het DNA zoals beschreven in het manuscript. Voor het analyseren van collageen, zuur vijf milligram DC-ECM-poeder in zoutzuur bij 100 graden Celsius gedurende 20 minuten. Neutraliseer het vervolgens met vijf milliliter natriumhydroxide-oplossing van zes molairen.

Bereken het hydroxyprolinegehalte van het geneutraliseerde monster met behulp van absorptie op 570 nanometer ten opzichte van de hydroxyprolinestandaard. Voeg na het mengen 500 microliter reagens A toe aan 200 milligram DC-ECM-poeder. Incubeer het monster gedurende 16 uur bij vier graden Celsius.

Eenmaal gecentrifugeerd, verzamel 50 microliter monsteroplossing en voeg 50 microliter reagens B toe, gevolgd door reagens C.Voeg na 10 minuten incuberen van het monster 750 microliter reagens D toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker. Voeg na het centrifugeren een microliter reagens E toe aan de pellet en meng goed voor het centrifugeren. Dissocieer vervolgens het monster vóór de meting van het GAG-gehalte.

In het geprepareerde DC-ECM-kraakbeen werd het DNA-gehalte aanzienlijk geëlimineerd. Het collageen- en GAG-gehalte bleef echter behouden in vergelijking met het natuurlijke kraakbeen. De SEM- en TEM-analyse demonstreerden de ultrastructuur van de geprepareerde DC-ECM.

De bereide hydrogel in de omgekeerde buis stroomde niet naar de bodem, waardoor gelering werd aangetoond. Verder, in vergelijking met de DC-ECM-oplossing, verkortte de toevoeging van vitamine B2 de geleringstijd als gevolg van de geïnduceerde verknoping tijdens de DC-ECM-hydrogelvorming. De DC-ECM-hydrogelviscositeit was hoger dan de viscositeit van de oplossing en verhoogde afschuifsnelheden verlaagden de viscositeit van de oplossing.

Bovendien gaf de hoge opslagmodulus van de DC-ECM-oplossing en hydrogel aan dat ze beide gel- in plaats van vloeibare eigenschappen hadden. De SEM-analyse toonde aan dat de poriegrootte van de DC-ECM-oplossing aanzienlijk was afgenomen in de hydrogelvorm na verknoping en vriesdrogen. Het protocol omvat een combinatie van fysische en chemische verstoring en enzymatische vertering om celmateriaal te verwijderen met behoud van de structuur en het gesprek van de ECM.