Flux de travail « Cell Surface Capture » pour la quantification sans marquage du protéome de surface cellulaire

Ce protocole nous permet d’étudier les antigènes présents à la surface des cellules de différents types de cellules afin de trouver des antigènes spécifiques à ce type de cellule ou de tissu. La technique que nous présentons ici permet d’enrichir des protéines membranaires cellulaires à partir d’un lysat de cellule entière, finalement pour une analyse par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ainsi, une application spécifique de ce protocole est de l’appliquer aux cellules tumorales pour rechercher des antigènes présents à la surface de ces cellules cancéreuses et non des cellules normales qui pourraient servir de nouvelles cibles pour les immunothérapies anticancéreuses.

Une chose à noter à propos de ce protocole est qu’il peut être important d’optimiser votre entrée d’échantillon pour l’expérience qui vous intéresse. Il peut donc falloir plusieurs itérations ou titrages pour trouver les conditions optimales. Akul Naik, un spécialiste junior de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, retirez la pastille cellulaire congelée marquée à la biotine à moins 80 degrés Celsius et décongelez-la sur de la glace. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse 2X à la pastille, mélangez soigneusement et agitez vigoureusement pendant 30 secondes. Sonicez le lysat cellulaire sur de la glace et centrifugez-le à 17 200 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour granuler les débris restants.

Pendant que le lysat est en centrifugation, ajoutez 100 microlitres de billes de résine d’agarose NeutrAvidin à une colonne de filtration fixée au collecteur à vide. Appliquez un aspirateur doux et lavez les perles en faisant couler 3 millilitres de tampon de lavage 1 dessus. Retirez la colonne de filtration du collecteur à vide, bouchez le fond et ajoutez le lysat cellulaire clarifié à la colonne avec les billes.

Coiffez le haut de la colonne et incubez le lysat avec les billes sur un rotor bout à bout pendant 120 minutes à 4 degrés Celsius. Une fois l’incubation du lysat terminée, replacez la colonne de filtration sur le collecteur à vide et appliquez un vide doux. Lavez les perles en faisant couler cinq millilitres de tampon de lavage 1 dessus.

Répétez l’étape de lavage avec cinq millilitres de tampon de lavage 2 et de tampon de lavage 3. Une fois que le tampon de lavage final s’est entièrement écoulé à travers les billes, retirez la colonne du collecteur. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de lyse aux billes et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,7 millilitre à faible teneur en protéines avec une pipette.

Tournez brièvement le tube pour déposer les billes et retirez 50 microlitres de solution. Ensuite, placez le tube sur un agitateur de bloc chauffant à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes à 1000 tr/min. Remettez en suspension la trypsine séchée dans le tube de digestion du kit en ajoutant 210 microlitres de la solution de remise en suspension et en la pipetant de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que toute la trypsine séchée est remise en suspension.

À la fin de l’incubation des billes, retirez-les de l’agitateur de blocs chauffants et ajoutez 50 microlitres de la solution de trypsine en suspension aux billes. Incuber le tube à 37 degrés Celsius, en l’agitant à 500 tr/min pendant au moins 90 minutes pour digérer la protéine. Une fois la digestion terminée, transférez la solution contenant les billes dans une colonne de centrifugation et insérez-la dans un microtube à centrifuger de 1,7 millilitre à faible teneur en protéines.

Faites tourner le tube pour séparer la solution peptidique digérée des billes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution d’arrêt pour arrêter la réaction de digestion et acidifier la solution peptidique. À l’aide d’un adaptateur de tube, placez une colonne de dessalage dans un microtube à centrifuger de 1,7 millilitre à faible liaison protéique.

Ajoutez toute la solution peptidique acidifiée dans la colonne. Faites tourner la colonne à 3 800 G pendant 3 minutes, de sorte que la solution s’écoule à travers la colonne. Jetez le flux car les peptides sont maintenant liés à la colonne.

Ajoutez 200 microlitres de solution Wash 1 dans la colonne, essorez à 3, 800 G pendant 3 minutes à température ambiante, puis jetez le flux. Répétez l’étape de lavage avec 200 microlitres de solution Wash 2. Transférez la colonne dans un nouveau tube à centrifuger de 1,7 millilitre à faible teneur en protéines.

Ajouter 100 microlitres de solution d’éluée dans la colonne et tourner à 3 800 G pendant 3 minutes à température ambiante. Les peptides sont maintenant élués de la colonne dans le tube. Placez la solution peptidique dans une centrifugeuse sous vide et laissez-la sécher pendant la nuit.

Placez les peptides séchés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à quantifier et à analyser sur le spectromètre de masse. L’analyse du protéome a été effectuée pour caractériser les protéines de surface cellulaire enrichies à l’aide de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse en tandem. Une concentration finale de peptides d’environ 630 nanogrammes par microlitre a été obtenue sur la base du test de quantification colorimétrique des peptides.

Les données de spectrométrie de masse analysées à l’aide de MaxQuant et l’analyse ultérieure de l’ensemble de données des protéines de surface cellulaire ont révélé la présence de 601 protéines de surface dans l’échantillon, soit environ 27 % de toutes les protéines identifiées. Un graphique représentant la distribution de la protéine identifiée dans le score d’Andromède est présenté ici, et le graphique de dispersion illustre la corrélation d’un échantillon à l’autre. Les boîtes à moustaches illustraient la variation d’une exécution à l’autre.

Et le graphique de distribution par échantillon représentait la qualité des données des répétitions. La chose la plus importante à garder à l’esprit est l’endroit où se trouvent les peptides à chaque étape. Initialement, ils sont en solution, puis ils sont liés aux billes jusqu’à la digestion, puis, ils sont liés à la colonne de dessalage jusqu’à ce qu’ils soient finalement élués.

À la suite de cette procédure, il existe différentes façons de valider une poignée de protéines identifiées, telles que la cytométrie en flux ciblée et la protéomique ciblée. Cela donnera des informations plus détaillées sur les niveaux d’expression de ces protéines dans l’échantillon.