Évaluation dynamique multiparamétrique de la fonction plaquettaire à l’aide d’un biocapteur capacitif

Nous concevons un test pour évaluer la fonction plaquettaire dans des contextes physiologiques, afin de remédier à la limitation des tests actuels en activant les plaquettes dans un microenvironnement semi-rigide avec un capteur de capacité membranaire. Le test mesure la numération plaquettaire, la force de stimulation et les voies d’activation. Cet outil propose une approche globale pour étudier les mécanismes plaquettaires au cours de l’hémostase.

Notre protocole permet d’évaluer plusieurs paramètres de la plaquette dans un seul essai dans des conditions physiologiques. Nous nous concentrerons sur l’amélioration de ce protocole et le développement d’autres capteurs d’évaluation de l’hémostase. Commencez par utiliser un logiciel de CAO standard pour concevoir la disposition de la puce de capacité à membrane d’équipe, ou MCC, pour un substrat de plaquette de silicium de quatre pouces pour le processus de microfabrication, comme décrit dans le manuscrit.

Pour la biofonctionnalisation, nettoyez l’électrode de détection du TMCC à l’aide d’un plasma d’oxygène pendant 45 secondes à 100 watts. Ajouter une solution de Do Decanal dans de l’éthanol à 200 degrés dans le puits d’échantillon sur les TMCC. Placez les TMCC dans un récipient rempli d’azote sec.

Fermez le récipient et enveloppez-le de parafilm pendant 24 à 48 heures. Après deux jours, rincez la surface dorée du TMCC avec de l’eau déminéralisée et de l’éthanol à 200 degrés. Séchez les TMCC avec de l’azote gazeux à température ambiante.

Ajoutez une solution de fibronectine humaine dans du PBS dans le puits d’échantillonnage de TMCC et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à huit heures. Pour la configuration du capteur capacitif, utilisez un compteur LCR avec des micro-positionneurs et des sondes à aiguille pour établir un contact électrique avec le capteur. Utilisez des fixations en plastique imprimées en 3D pour placer en toute sécurité le TMCC et le BMCC.

Assurez-vous que le luminaire inférieur est équipé de butées sur l’axe XY pour aligner précisément le TMCC sur le BMCC, formant ainsi un condensateur. Appliquez un signal sinusoïdal de 0,5 volt à 100 kilohertz avec une fréquence d’échantillonnage de huit hertz. Pour obtenir du plasma riche en plaquettes concentré, ou CPRP, centrifugez les échantillons de sang humain.

Transférez le CPRP dans un récipient stérile et effectuez la numération plaquettaire. Pour les études sur les inhibiteurs, incubez le CPRP avec une concentration prédéfinie d’aspirine dans le tampon de Tyrode. Pour le dosage fonctionnel des plaquettes, assemblez TMCC et BMCC dans les montages imprimés en 3D.

Mesurez la capacité de base des MCC assemblés pendant cinq minutes, puis ajoutez 45 microlitres de CPRP dans le puits de l’échantillon dans le TMCC et attendez 30 minutes pour permettre aux plaquettes d’adhérer à l’électrode enrobée de fibronectine dans le TMCC. Ensuite, retirez 30 microlitres de CPRP du puits de l’échantillon sans perturber les plaquettes collées et remplissez le puits avec le tampon de Tyrode. Après le dernier lavage, ajoutez 10 microlitres de la solution agoniste à la concentration souhaitée et équilibrez l’échantillon pendant 80 minutes.

Mesurez la variation maximale de la capacité après 30 minutes d’adhésion pour déterminer l’adhésion delta C. Pour la phase d’activation, mesurez la variation maximale de la capacité, appelée activation delta C. Calculez la pente de la courbe de capacité entre 200 et 300 secondes après l’activation pour déterminer l’activation S.

Effectuez une analyse statistique à l’aide de l’analyse de variance avec le test postopératoire de Tukey pour comparer les résultats entre les groupes. Utilisez la qualité de l’ajustement de Shapiro-Wilk pour tester la distribution normale. Une solution de CPRP avec une numération plaquettaire prédéterminée a montré une diminution linéaire de la capacité pendant l’adhésion.

Une diminution exponentielle à l’état d’équilibre a été observée après l’activation de la thrombine. Les valeurs d’adhésion Delta C ont montré une forte corrélation avec la numération plaquettaire dans une gamme de numérations plaquettaires, avec une réduction significative à 1,3 millimole de concentration d’aspirine. Le taux de diminution exponentielle de la capacité après la stimulation plaquettaire augmentait avec la concentration cellulaire.

L’ampleur de la perte de capacité a également augmenté avec des concentrations plus élevées, montrant une nette tendance à la hausse de l’activation du delta C. Une tendance similaire a été observée pour l’activation du S et la numération plaquettaire. Avec l’augmentation de la dose d’aspirine, la capacité, l’activation delta C et l’activation S ont montré des tendances à la baisse.

Une différence statistiquement significative dans l’activation du S a été observée entre les doses élevées et moyennes, tandis qu’aucune différence significative n’a été observée dans l’activation du delta C. Les signaux de capacité pour les échantillons de CPRP activés par la thrombine ont montré que la réduction de la capacité devenait plus prononcée avec l’augmentation de la concentration de thrombine. L’activation delta C et l’activation S ont toutes deux montré une tendance statistiquement significative avec les niveaux de thrombine.