Name: Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Apprenez à quantifier les génomes viraux adéno-associés par ddPCR en gouttelettes. Cette méthode standardisée améliore la précision et la fiabilité du contrôle qualité des vecteurs AAV pour la recherche et les applications cliniques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole normalisé pour la quantification du génome viral à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Gimpel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+process+and+product+characterization+of+recombinant+adeno-associated+virus-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 20, 740-754 (2021).</li>
<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
<li>Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobnik%2C+D+%22Front+Microbiol%22">Front Microbiol</a>. 10, (2019).</li>
<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pipette 8 canaux 10 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 8 canaux 200 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 8 canaux 300 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>Bandelette PCR 8 puits</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermocycleur avec 96&ndash ; Module de réaction à puits profonds</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Contrôle tampon pour sondes 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Plaques Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96 puits (paquet de 25)</td>Huile de <td></td> lecteur de gouttelettes <td>Bio-Rad</td> 12001925 <td></td></tr><tr><td>ddPCR (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Porte-cartouche DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>Cartouches DG8 pour QX200/QX100 (paquet de 24)</td><td>Joints Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 pour QX200/QX100 (paquet de 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro ; L) + tampon</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Gouttelettes Génération Huile pour sondes (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0.1-10 &mu ; L, 34 mm, Rack, PCR Clean, STÉRILE&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 &mu ; L, 55 mm, Rack, PCR Clean, STÉRILE&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Pointe de filtre, 2-100 &mu ; L, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERILE&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Apprêts lyophilisés en aval et huiles mères respectives à 100 mM&nbsp ;</td><td>GFP IDT</td><td></td><td>comme séquence cible. Amorce avant : sonde 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'</td></tr> <tr><td>Lyopohilized et stock maître à 100 & micro ; M&nbsp ;</td><td>GFP IDT</td><td></td><td>comme séquence cible. Sonde PrimeTime Eco : /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR Thermoscellable, feuille, perçable (paquet de 100)</td>Tensioactif non ionique <td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 (100x)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>potassium (KCl)</td><td>Produits chimiques de recherche Honeywell</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de gestion</td><td>QX Bio-Rad</td><td></td><td>Logiciel pour l’analyse des données ddPCR Générateur</td></tr> de <tr><td>gouttelettes QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lecteur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de réactifs</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Amorces lyophilisées inverses et huiles mères correspondantes à 100 mM&nbsp ;</td><td>GFP IDT</td><td></td><td>comme séquence cible. Amorce inverse : 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'Tube</td></tr> <tr><td>réactionnel SafeSeal, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïde de saumon, cisaillé (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>IDT</td><td></td><td>Accompagné d’amorces lors de la commande de</td></tr><tr><td>chlorhydrate de Tris (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un logiciel approprié. Pour chaque puits, le graphique d’amplitude 1D affiche toutes les gouttelettes par rapport à leur amplitude. Une séparation claire entre les gouttelettes positives et négatives est attendue. Si plus de 10 % du total des gouttelettes se trouvent entre les nuages de gouttelettes positives et négatives (phénomène appelé pluie de gouttelettes), il est nécessaire de mesurer à nouveau l’échantillon (voir la figure 1). Des informations supplémentaires sur la pluie de gouttelettes sont disponibles dans la discussion.
Un tableau de données peut être créé pour résumer tous les renseignements enregistrés, y compris le nom de l’échantillon, le nombre de gouttelettes acceptées (nombre d’événements) et la concentration (copies/μL). Idéalement, le nombre d’événements devrait se situer entre 15 000 et 20 000 gouttelettes acceptées. Si le nombre d’événements pour un puits est inférieur à 10 000, le point de données doit être exclu de l’analyse. Le tableau 5 donne un exemple des données de sortie.
Le titre vg peut être calculé sur la base de la concentration (copies/μL), en tenant compte des dilutions de l’échantillon. La plage de travail de dd_PCR est de 10 à 10 000 copies/μL. Les valeurs inférieures à 10 copies/μL doivent être exclues de l’analyse. Le titre vg des échantillons, ainsi que les témoins positifs et négatifs, doivent être calculés. La valeur mesurée du témoin positif doit avoir un coefficient de variation (%CV) inférieur à 20 % par rapport à la valeur théorique. Le témoin négatif doit être inférieur à 5 copies/μL. De plus, le % CV entre les répétitions et les différentes dilutions pour chaque échantillon doit être calculé. Si le % CV entre différentes dilutions dépasse 20 %, la valeur peut être considérée comme inexacte et il peut être nécessaire de mesurer à nouveau l’échantillon.
Une mesure réussie se caractérise par une séparation nette des nuages de gouttelettes positives et négatives, au moins 10 000 gouttelettes acceptées, une valeur comprise entre 10 copies/μL et 10 000 copies/μL, et un %CV inférieur à 20 % entre les répétitions.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Figure 1 : Visualisation de dd_PCR gouttelettes. (A) Le graphique d’amplitude 1D montre une séparation claire des gouttelettes positives et négatives, indiquant une répartition réussie des gouttelettes. (B) Le graphique montre une mauvaise séparation des gouttelettes positives et négatives, connue sous le nom de pluie de gouttelettes, ce qui suggère une répartition sous-optimale ou des problèmes potentiels avec le test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail pour la quantification des génomes viraux à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. (1) Les tampons, les réactifs et les solutions sont préparés conformément aux instructions du fabricant ou à l’étape 1 du protocole (Préparation des solutions mères). (2) 45 μL de la solution de DNase I sont aliquotes dans chaque tube d’une bandelette PCR à 8 tubes. Après un vortex et une brève centrifugation des échantillons, 5 μL de l’échantillon sont ajoutés à l’un des tubes. La DNase I et la bandelette PCR à huit tubes contenant l’échantillon sont incubées dans un thermocycleur pendant 1 h à 37 °C, puis les échantillons sont dilués en série. (3) Le mélange maître de PCR est préparé comme décrit, et 19,8 μL sont aliquotes dans chaque tube d’une bandelette de PCR à 8 tubes. Les dilutions en série de l’échantillon de l’étape 2 sont ajoutées au mastermix. 20 μL de mastermix plus la solution d’échantillon est chargée dans la rangée centrale de la cartouche, et 60 μL d’huile générant des gouttelettes sont transférés dans les puits inférieurs d’une cartouche génératrice de gouttelettes. La cartouche est ensuite placée dans le générateur de gouttelettes et fonctionne selon les conditions spécifiées. Après la génération des gouttelettes, 42,5 μL de la rangée supérieure de la cartouche sont transférés sur une plaque PCR multi-puits. (4) La plaque PCR est chargée dans un thermocycleur PCR et fonctionne selon les conditions fournies. La plaque est analysée à l’aide d’un lecteur dd_PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Données de précision. Ce tableau présente des données de précision provenant de quatre ensembles d’échantillons de contrôle de la qualité (CQ), chacun avec cinq concentrations (QC1-QC5). Chaque CQ a été mesuré cinq fois. Le coefficient de variation (% CV) entre différents cycles, représentant la répétabilité (A), et entre différents ensembles d’échantillons, représentant une précision intermédiaire (B), est indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Dilutions des échantillons. Le tableau montre les dilutions d’échantillon recommandées en fonction du titre attendu du génome viral (vg/mL). Un total de trois dilutions est recommandé pour s’assurer qu’au moins deux valeurs se situent dans la plage de travail du test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Composition du master mix dd_PCR. Ce tableau décrit la composition du dd_PCR master mix, qui comprend une amorce directe et inverse (909 nM), une sonde (227 nM) et dd_PCR supermix pour sondes (sans dUTP, 1x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 4 : Conditions de thermocyclage. Le tableau détaille le programme de PCR recommandé, qui comprend : (1) une incubation de 10 minutes à 95 °C pour la rupture de la capside et l’activation enzymatique, (2) 40 cycles de 30 s à 94 °C pour la dénaturation de l’ADN et 1 min à 60 °C pour le recuit et l’extension, (3) une incubation de 10 minutes à 98 °C pour la désactivation de l’enzyme, et (4) maintien à 4 °C. La température de recuit peut nécessiter une optimisation en fonction du jeu d’amorce/sonde utilisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 5 : Exemple de données de sortie d’une exécution AAV réelle. Le tableau fournit un exemple de données de sortie d’un cycle AAV réel, où un échantillon a été mesuré dans deux dilutions différentes, chacune en double. Le titre du génome viral (vg) (en vg/mL) est calculé à l’aide de la formule suivante : 10 (prétraitement de la DNase I) x 10 (dilution dans le mélange maître) x 1 000 (μL à mL) x dilution dans le tampon de dilution AAV. STDEV représente l’écart-type et CV indique le coefficient de variation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

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Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

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