Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

[Narrateur] À l’aide de la protéomique spatiale, nommée méthode de l’année 2024 par Nature Methods, l’emplacement précis des cellules immunitaires ainsi que les interactions cellule-cellule peuvent être cartographiés dans les tissus. Cela révèle des modèles spatiaux liés aux résultats cliniques. La construction de panels d’anticorps complexes et de tissus d’imagerie à haute fluorescence endogène présente des défis importants en termes de temps, de ressources et d’expertise pour IBEX et d’autres techniques de microscopie à fluorescence. À l’aide d’IBEX, des caractéristiques spécifiques à la tumeur ont été identifiées chez des patients atteints de lymphome folliculaire à haut risque et chez des collègues de Human Cell Atlas. Une carte spatiale complète du thymus humain a été créée. On sait peu de choses sur la composition des cellules immunitaires, les interactions spatiales et les différences de production de cytokines entre diverses pathologies pulmonaires mycobactériennes. Ce protocole comble cette lacune. Ce protocole offre une méthode de photoirradiation peu coûteuse et adaptable pour réduire considérablement l’autofluorescence tissulaire à large spectre, en particulier dans les échantillons FFPE difficiles, tout en préservant le signal des anticorps pour l’analyse spatiale. Pour commencer, immergez les lames avec du tissu dans du PBS après avoir terminé la récupération de l’antigène. Retirez une lame du PBS et utilisez une lingette non pelucheuse pour sécher soigneusement tout excès de tampon sans toucher le tissu. À l’aide d’un stylo hydrophobe, tracez une bordure autour de la section du tissu sur la diapositive. Après avoir répété le processus pour les lames restantes, laissez sécher les barrières hydrophobes pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une lingette non pelucheuse, évacuez le PBS de la section du tissu sans toucher directement le tissu. Ajoutez maintenant 200 microlitres de tampon de blocage sur la lame et fermez la chambre d’humidité. Placez la chambre dans un micro-ondes scientifique non chauffant doté d’un mécanisme de régulation de la température et exécutez le programme précédemment établi pendant cinq cycles. Pendant l’incubation bloquante, préparer la solution primaire de coloration des anticorps 1 à l’aide de crochets et du tampon bloquant contenant le bloc Fc. Mélangez les anticorps et mélangez délicatement le cocktail. Lorsque le cycle de micro-ondes est terminé, retirez et ouvrez la chambre de la lame et évacuez le tampon de blocage de la lame sans toucher le tissu. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution primaire de coloration des anticorps 1 sur la lame. Remettez la chambre au micro-ondes et exécutez à nouveau le programme d’anticorps primaires pendant environ 30 minutes. Une fois l’étiquetage de l’anticorps primaire terminé, tenez la lame verticalement. Pour laver la lame, pipetez 1 000 microlitres de PBS sur le tissu, en le laissant s’écouler. Évacuez l’excès de PBS et fixez la lame avec du paraformaldéhyde à 1 % pendant 10 minutes à température ambiante dans la chambre d’humidité. Après la fixation, lavez soigneusement la lame avec 1 000 microlitres de PBS trois à cinq fois et laissez une couche de PBS sur le tissu jusqu’à l’étape de photoirradiation. Pour préparer la boîte de photoirradiation, rassemblez une lampe LED de 150 watts, une lampe LED RGBW flood de 40 watts, un grand récipient en plastique d’une capacité de 75,71 litres ou plus, du PBS frais et une boîte de Pétri. Remplissez maintenant la boîte de Pétri avec 1x PBS pour immerger complètement la lame. Effectuez la procédure de photoirradiation dans une chambre froide pour minimiser la chaleur des lampes. Placez ensuite la lame dans la boîte de Pétri, en vous assurant qu’elle est entièrement immergée dans le PBS. Ensuite, placez la lampe de 40 watts directement au-dessus de la boîte de Pétri avec la source lumineuse vers le bas vers la diapositive et réglez la lampe sur le mode de lumière rouge. Enfin, allumez les lampes de 150 watts et de 40 watts et couvrez toute la configuration avec le couvercle du récipient en plastique. Après deux heures, mettez la lampe en vert et incubez pendant 16 heures. Les fluorophores les plus brillants compatibles avec le protocole d’inactivation des colorants ont été identifiés et associés à des marqueurs faiblement exprimés pour améliorer la détection des signaux. L’autofluorescence a été réduite de manière significative après la photoirradiation et à des longueurs d’onde d’imagerie plus longues. Anticorps directement conjugués ciblant des marqueurs structurels fortement exprimés, l’actine musculaire alpha-lisse et la pancytokératine, remplacés dans le canal proche infrarouge à 750 nanomètres. Le signal d’arrière-plan a été soustrait par calcul à l’aide d’une image de référence non colorée et de l’arithmétique SimpleITK, et les signaux réels ont été améliorés grâce au seuillage. L’imagerie de lames entières de coupes colorées par IBEX a révélé des granulomes avec des noyaux nécrotiques et des neutrophiles CD15 positifs. Mycobacterium tuberculosis ou des mycobactéries non tuberculeuses ont été détectés près du noyau nécrotique du granulome à l’aide d’un anticorps antigène 85B. Le tissu lymphoïde associé au granulome contenait des lymphocytes B CD20 positifs, des lymphocytes T CD4 positifs, quelques lymphocytes T CD8 positifs et le marquage CD45 de toutes les cellules immunitaires du poumon. L’imagerie IBEX a également permis de visualiser les caractéristiques anatomiques des poumons, notamment les cellules épithéliales bronchiques, les muscles lisses artériels et les macrophages CD68 positifs.