Name: Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Découvrez une méthode de photoirradiation économique pour réduire l'autofluorescence tissulaire tout en préservant les signaux d'anticorps. Cette technique permet l'imagerie multiplexée de lames entières à partir d'échantillons cliniques archivés.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,3 % Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. T8787</td><td>Solution pour bloquer la mémoire tampon</td></tr><tr><td>1 % de BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>Solution pour bloquer la mémoire tampon</td></tr><tr><td>1 % Bloc BD Fc humain</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>Fc Bloc requis pour le blocage de la mémoire tampon</td></tr><tr><td>Lampe LED 150 W</td><td>Amazone</td><td>B07VH3CVSF</td><td>Source lumineuse LED pour la photoirradiation tissulaire</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Solution pour bloquer les étapes de tampon et de lavage</td></tr><tr><td>Conteneur de stockage de 20 gallons</td><td>Amazone</td><td>B001B1C4G0</td><td>Récipient pour procédé de photoirradiation</td></tr><tr><td>Lampe LED RGBW flood 40 W&nbsp ;</td><td>Amazone</td><td>B08QFPJSMD</td><td>Source lumineuse RVB pour le photoirradiation tissulaire</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Kit de blocage Avidin/Biotine</td><td>Abcam</td><td>AB64212</td><td>Solution de blocage de l’avidine et de la biotine</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Solution de fixation</td></tr><tr><td>Solution de daffilation BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Solution de déparaffinisation</td></tr><tr><td>BOND Solution de récupération d’épitopes 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Solution de récupération d’épitopes à base de citrate pH 6 (ER1)</td></tr><tr><td>BOND Solution de récupération d’épitopes 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>Solution de récupération d’épitopes pH 9 à base d’EDTA (ER2)</td></tr><tr><td>Système de détection de recherche BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Réactif de coloration de recherche automatisé</td></tr><tr><td>Colorant de recherche BOND RX</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>Plateforme de coloration de recherche automatisée</td></tr><tr><td>Solution de lavage BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Tampon de lavage</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>Référence 347420/AB_400298</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Référence 50-0202-82/AB_11150959</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& D Systèmes</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>CD45 Phycoérythrine (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32814/AB_2762838</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Tél. : 715-545-020/AB_2340844</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32794/AB_2762834</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Système de coloration EasyDip</td><td>Approvisionnement des nouveaux arrivants</td><td>5300KIT</td><td>Système de coloration par glissement</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td>Supports de montage</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Coloration nucléaire pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Convertisseur de fichiers Imaris x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instruments</td><td></td><td>Convertisseur de fichiers gratuit</td></tr><tr><td>Logiciel ImarisViewer x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instruments</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’image gratuit</td></tr><tr><td>Stylo ImmEdge</td><td>Laboratoires Vecteurs</td><td>H-4000</td><td>Stylo barrière hydrophobe</td></tr><tr><td>Borohydrure de lithium (1 gramme)</td><td>STREM Produits chimiques</td><td>93-0397</td><td>Produit chimique pour l’inactivation du colorant, achetez de petites aliquotes de ce produit chimique (1 gramme)</td></tr><tr><td>Biotine Lumican</td><td>R& D Systèmes</td><td>BAF2846</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Lunettes Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>Couvercles de diapositives en verre</td></tr><tr><td>Pan-cytokératine Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Anticorps pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Système micro-ondes PELCO BioWave Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Micro-ondes scientifique non chauffant</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>Contrôle de température entièrement automatisé pour micro-ondes scientifique</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Logiciels open source</td><td></td><td>Logiciel d’enregistrement et de traitement des canaux</td></tr><tr><td>Streptavidine Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. S11227</td><td>Réactif de marquage pour l’imagerie IBEX. Voir le tableau 1.</td></tr><tr><td>Microscope à grand champ</td><td>Microsystèmes Leica</td><td>NA</td><td>Imageur THUNDER de Leica Microsystems avec source lumineuse LED8 et logiciel LAS X (3.7.1.21655). Pour l’imagerie de fluorescence, un filtre quadribande personnalisé avec roue à filtres externe (PN : 11536075) avec deux filtres monobande supplémentaires (PN : 8118215) a été utilisé pour imager sept canaux de colorant par passe. Les raies d’excitation du filtre, dichroïque et d’émission sont (1) Cube quadribande : dichroïque à 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, pas de filtres d’excitation ou d’émission ; (2) roue à filtres externes position 1 : 434/32, position 2 : 520/40, position 3 : 585/20, position 4 : 720/60, position 5 : passage ; (3) monobande 1&mdash ; excitation 585/22, 594 dichroïque, émission 625/30 ; (4) monobande de 2 po ; 635/20 excitation, 647 dichroïque, 667/30 émission.</td></tr><tr><td>Nettoyant pour verres optiques Zeiss</td><td>Amazone</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Nettoyeur d’objectif de microscope</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Anticorps </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>AB43019</td><td>IgG polyclonales de lapin, cycle 1</td></tr><tr><td>Alpha-lisse à action musculaire DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, cycle 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& D Systèmes</td><td>FAB8165G</td><td>IgG polyclonales de chèvre, cycle 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLégende</td><td>372906</td><td>C8/144B, cycle 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>KP1, cycle 1</td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32814</td><td>Âne polyclonal, cycle 1</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Référence A32787</td><td>Âne polyclonal, cycle 1</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32794</td><td>Âne polyclonal, cycle 1</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Étiquette nucléaire, cycle 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>347420</td><td>MMA, cycle 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>L26, cycle 2</td></tr><tr><td>CD45 Phycoérythrine (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, cycle 2</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020</td><td>Âne polyclonal, cycle 2</td></tr><tr><td>Biotine Lumican</td><td>R& D Systèmes</td><td>BAF2846</td><td>IgG polyclonales de chèvre, cycle 2</td></tr><tr><td>Pan-cytokératine Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, cycle 2</td></tr><tr><td>Streptavidine Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. S11227</td><td>N/A, cycle 2</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Cycle 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><Solutions>fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer (cycle 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. T8787</td><td>0,3 % en volume</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td>1 % en volume</td></tr><tr><td>Bloc BD Fc humain</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>1 % en volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>97,7 % en volume</td></tr><tr><td><forte>solution de coloration d’anticorps primaire #1 (cycle 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage (cycle 1)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLégende</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td><forte>solution de coloration primaire des anticorps #2 (cycle 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage (cycle 1)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>CD4&nbsp ; AF488</td><td>R& D Systèmes</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td><forte>solution de coloration d’anticorps secondaire #1 (cycle 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage (cycle 1)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>Âne Anti-Chèvre AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Âne anti-Lapin AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Âne anti-Souris AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N° A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td><forte>solution de coloration d’anticorps primaire #3 (cycle 1)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage (cycle 1)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>tampon de blocage sans BSA (cycle 2)&nbsp ; </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. T8787</td><td>0,3 % en volume</td></tr><tr><td>Bloc BD Fc humain</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td>1 % en volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>98,7 % en volume</td></tr><tr><td><fort>solution de coloration primaire des anticorps #4 (cycle 2)</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biosciences</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Biotine Lumican</td><td>R& D Systèmes</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-cytokératine AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td><fort>solution de coloration d’anticorps secondaire #2 (cycle 2)</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage sans BSA (cycle 2)</td><td>Voir ci-dessus</td><td></td><td>Complétez jusqu’au volume après l’ajout d’anticorps</td></tr><tr><td>Âne anti-Souris IgM AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Tél. : 715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strénavidine AF594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Réf. S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

La conception d’un panel d’imagerie basé sur des anticorps multiplexés nécessite beaucoup de temps, d’efforts et de ressources12. Ces défis sont particulièrement prononcés lors de la conception d’un panel pour des échantillons FFPE archivés provenant de tissus hautement autofluorescents, comme décrit ici (Figure 1). Pour surmonter ces défis, nous avons d’abord identifié les fluorophores les plus brillants compatibles avec notre protocole d’inactivation des colorants (...

Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Arrière-plan autofluorescence des échantillons biologiques complique souvent basés sur la fluorescence des techniques d’imagerie, en particulier dans les tissus de postmitotiques humains âgés. Ce protocole décrit comment l’autofluorescence de ces échantillons peut être efficacement enlevé avec une lampe disponible dans le commerce, émettant une lumière diode source vers photobleach l’échantillon avant immunostaining.

Simple élimination de Fluorescence de fond dans les tissus cérébraux humains fixés au formol pour la microscopie en Immunofluorescence

Un protocole détaillé pour un panel de six-marqueur immunofluorescence multiplex est optimisé et réalisé, en utilisant une passoire automatisé pour des résultats plus uniformes et une courte procédure. Cette approche peut être directement adaptée par tout laboratoire d’études immuno-oncologie.

Automated panneau Multiplex Immunofluorescence pour des études sur des échantillons de tissus fixés au formol carcinome Immuno-oncologie

L'immunohistochimie fluorescente multiplex est une technologie émergente qui permet la visualisation de plusieurs types de cellules dans le tissu intact de formaline-fixe, incorporé de paraffine (FFPE). Présentés sont des lignes directrices pour assurer un multiplexe 7-couleur réussie avec des instructions pour optimiser les anticorps et les réactifs, la préparation des diapositives, la conception et des conseils pour éviter les problèmes communs.

Optimisation, conception et éviter les pièges dans l'immunohistochimie fluorescente du multiplex manuel

Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.

Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

L’immunohistochimie cyclique multiplex permet la détection in situ de plusieurs marqueurs simultanément en utilisant l’incubation répétée d’antigène-anticorps, le balayage d’images et l’alignement et l’intégration d’images. Nous présentons ici le protocole opératoire pour identifier les substrats des cellules immunitaires avec cette technologie dans des échantillons de cancer du poumon et de métastases cérébrales appariées.

Immunohistochimie par fluorescence cyclique multiplex

Ce rapport décrit un protocole automatisé pour les tests d’immunofluorescence multiplex (mIF) sur un colorateur de lames automatisé. Il démontre la haute reproductibilité de la protéomique spatiale sur des autocolorateurs tissulaires standard à haut débit et des imageurs de fluorescence sur lames entières, ce qui est idéal pour les tests mIF personnalisés sur un grand nombre de lames de tissus dans la recherche translationnelle.

Tests d’immunofluorescence multiplex automatisés à haut débit pour la recherche translationnelle

La combinaison de l’IBEX (Iterative-Bleaching-Extends-Multiplexity) et d’un test commercial de marquage nucléotidique (Click-iT EdU) permet la détection et la catégorisation de types de cellules en division dans des processus hautement dynamiques dans des coupes de tissus murins congelés fixes. De plus, un nouveau pipeline de traitement d’images open source permet l’acquisition et l’analyse d’images à haut débit.

Flux de travail d’imagerie et d’analyse à haut débit pour l’évaluation des phénotypes et des états de prolifération des cellules cutanées dans des échantillons de tissus

Ici, nous décrivons l’application de la méthode IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) à l’aide de colorants tissulaires automatisés disponibles dans le commerce et des considérations d’optimisation pour l’utilisation de réactifs basés sur l’amplification du signal tyramide.

Le blanchiment itératif étend la multiplicité grâce à l’utilisation de l’automatisation de la coloration pour les installations centrales

Cet article décrit un protocole d’immunofluorescence multiplex optimisé pour caractériser l’architecture tridimensionnelle des métastases péritonéales.

L’imagerie tridimensionnelle de tissus porteurs de tumeurs à l’aide du blanchiment itératif étend l’approche de multiplexité

Le blanchiment itératif spectral étend la multiplexité (IBEX) s’appuie sur la technique IBEX de base en ajoutant un blocage de l’héparine pour minimiser la liaison non spécifique et en exploitant la détection spectrale avec démélange informatique pour supprimer l’autofluorescence. Cette approche accélère l’acquisition d’images tout en réduisant les sources d’arrière-plan, ce qui permet des analyses protéomiques spatiales robustes et multi-rondes à paramètres élevés.

Imagerie High-Plex à l’aide de la microscopie confocale spectrale pour minimiser la fluorescence tissulaire non spécifique

L’immunofluorescence multiplexée permet le marquage séquentiel de plusieurs marqueurs d’anticorps dans une même section tissulaire afin de soutenir l’analyse spatiale de l’architecture tissulaire et des populations cellulaires. Ici, un flux de travail pour la détection multiplex des marqueurs structuraux, structurels et immunitaires associés à la sénescence est présenté, incluant la préparation manuelle et automatisée des lames, l’imagerie itérative et l’analyse unicellulaire à l’aide d’un...

Essai d’immunofluorescence multiplexé pour l’évaluation spatiale des marqueurs de sénescence in vivo

Découvrez une méthode de photoirradiation économique pour réduire l'autofluorescence tissulaire tout en préservant les signaux d'anticorps. Cette technique permet l'imagerie multiplexée de lames entières à partir d'échantillons cliniques archivés.

Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents (Vidéo) | JoVE Journal

Le flux de travail optimisé pour le blanchiment itératif étend l’imagerie multiplexité des échantillons cliniques hautement autofluorescents

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