Méthode optimisée de culture et de bioaugmentation microbienne de Typha latifolia (quenouille)

Notre travail résume l’absence de protocoles pour la culture de la quenouille à partir de graines. Nous avons développé des méthodes reproductibles pour la germination des graines, la croissance précoce et l’augmentation biologique microbienne afin de soutenir la recherche future sur les microbiens végétaux. Peu d’études cultivent la quenouille à partir de graines ou les suivent jusqu’à leur maturité, pourtant les quenouilles sont couramment utilisées dans la recherche sur la réhabilitation des zones humides.

La plupart des recherches sur les quenouilles consistent à acheter des rhizomes pour la propagation des quenouilles dans des études en laboratoire. Peu d’études cultivent la quenouille à partir de graines, ne laissant aucune méthode standardisée. Atteindre une germination constante et une colonisation persistante des microbes introduits a été un défi majeur.

Nous avons développé des méthodes reproductibles pour la germination des graines et l’augmentation biologique microbienne, démontrant comment une inoculation précoce aide à soutenir une colonisation à long terme. Pour commencer, utilisez des cisailles de jardin pour couper la tige d’un plant de Typha latifolia située à environ deux centimètres de la base de l’inflorescence. Retirez les graines de l’inflorescence, transférez-les dans un mélangeur de laboratoire jusqu’à ce que le mélangeur soit rempli d’environ 1/4, correspondant à environ 250 millilitres de graines non compactées.

Remplissez maintenant le blender de 500 millilitres d’eau du robinet, en assurant ainsi un espace de tête de 10 centimètres. Mélangez le mélange à vitesse moyenne-basse pendant 20 secondes, puis transférez immédiatement le contenu visqueux dans un bécher d’un litre. Transférez environ 100 millilitres du mélange d’eau de graines dans le blender.

Ajoutez ensuite 400 à 600 millilitres d’eau du robinet fraîche et mixez à vitesse moyenne élevée pendant 20 secondes. Versez le contenu dans un bécher d’un litre frais. Remplissez maintenant le bécher avec de l’eau du robinet jusqu’à 800 millilitres.

Après avoir laissé reposer 60 secondes, ramassez la boue flottante du dessus sans déranger les graines déposées au fond. Versez lentement le reste de l’eau et transférez les graines dans un bécher de 100 millilitres. Répétez le processus de mélange pour la boue d’eau de graine restante. Ensuite, placez le bécher contenant les graines séparées sur une plaque à brasser.

Après avoir remousé, retirez tout matériau végétal flottant à la surface du bécher. Versez les graines dans un entonnoir Buchner avec du papier filtre fixé au vide et laissez-les sécher toute la nuit. Conservez les graines séchées à 20 degrés Celsius dans des tubes coniques en polypropylène de 50 millilitres.

Préparez des plaques de médium Murashige et Skoog à demi-force avec 1 % de fagar de phyto. Transférez environ un milligramme des graines séchées dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’eau stérile double distillée dans le tube.

Placez le tube sur un vibreur orbital à vitesse moyenne-élevée pendant 10 minutes. Retirez maintenant l’eau du tube et ajoutez cinq millilitres de solution polysorbate 20 à 0,1 % préparée dans de l’eau stérile double distillée. Secouez le tube à vitesse moyenne élevée pendant 10 minutes.

Retirez la solution de polysorbate 20. Effectuez toutes les étapes suivantes devant une hotte à flamme ou à flux laminaire. Remplacer la solution par cinq millilitres d’eau de Javel commerciale à 30 % et de polysorbate 20 à 0,025 % préparés dans de l’eau distillée double stérile.

Remplacez le surnageant par de l’eau stérile double distillée. Ensuite, secouez le tube à vitesse moyenne et élevée pendant cinq minutes. Après le troisième rinçage, faites tourner le tube à basse vitesse pendant 24 heures pour induire la germination.

Le lendemain, retirez l’excès d’eau et assurez-vous que trois millilitres de liquide restent dans le tube. Maintenant, de façon aseptique, coupez la pointe d’une pointe de pipette en plastique de 1000 microlitres. Utilisez la pointe de pipette coupée pour pipeter vigoureusement et suspendre les graines à l’intérieur de la pointe.

Dressez les graines et le liquide sur des plaques d’agar Murashige et Skoog à demi-dose. Faites doucement tourner l’assiette pour répartir uniformément les graines. Enveloppez les plaques dans un film de scellement de laboratoire, puis placez-les dans une chambre de croissance avec un cycle d’éclairage de 16 heures et un cycle d’obscurité de 8 heures à 23 degrés Celsius et 70 % d’humidité.

Pour inoculer les graines de quenouille, stérilisez les graines avec de l’eau de Javel polysorbate 20 et de l’eau distillée double, comme démontré. Mesurer la densité optique d’une culture nocturne d’isolat de Luteimonas à 600 nanomètres. Normalisez la culture à une valeur d’absorption de 1,0 en diluant dans le milieu de culture.

Centrifugez maintenant un millilitre de culture à 9 300 G pendant deux minutes. Retirez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans un millilitre de PBS. Après centrifugation et retrait du surnageant, resuspendez la pellete bactérienne dans un millilitre d’eau stérile double distillée.

Utilisez des graines stérilisées, puis diluez l’inoculum à une dilution de un à dix avec 0,025 % de tensioactif organosiliconé dans le même tube. Secouez la suspension à basse vitesse pendant 24 heures avant la germination des graines. Commencez par remplir une chambre de croissance stérile de plantes avec un sol de votre choix préhumidifié à l’eau du robinet.

Couvrez la pointe Luer lock avec du papier aluminium et autoclavez l’appareil en cycle liquide pendant 20 minutes. Ensuite, en conditions stériles, il fixe une unité de filtration de 0,2 micromètre au connecteur Luer lock de la chambre de croissance. Ouvrez la chambre et ajoutez 500 microlitres d’engrais stérilisé par filtre 1 % 20 par 20 par 20 au sol.

Mélangez le sol avec une spatule stérile tout en ajoutant simultanément de l’eau stérile double distillée pour maintenir l’hydratation sans saturer le sol. Utilisez maintenant une lame de rasoir stérile pour couper en quatre l’agar Murashige et Skoog provenant de plaques contenant un vieux semis fragile. Avec une spatule stérile, transférez une section d’agar avec le plant sur le sol préparé dans la chambre de croissance.

Transférez l’unité de la chambre de croissance dans un incubateur de croissance végétale réglé sur un cycle de lumière de 16 heures et un cycle d’obscurité de 8 heures à 23 degrés Celsius et 70 % d’humidité. La scarification complète des graines de Typha a entraîné des composants visiblement séparés, tandis que la scarification incomplète a laissé le bec attaché et les graines non scarifiées sont restées intactes. Il a été démontré que le système hydroponique stérile favorisait la croissance des espèces de quenouille et de juncus, ici imaginées sous le nom de juncus, qui étaient maintenues dans le système stérile jusqu’à un an.

Le taux de germination des graines le plus élevé, de 20,8 %, a été observé avec la méthode de l’eau de Javel à 30 % et du polysorbate 20, ce qui était nettement supérieur à tous les autres traitements de stérilisation, à l’exception de la méthode au gaz chloré d’une heure qui n’a pas permis d’assurer une stérilisation complète des graines. Sept jours après la scarification, les semis de Typha en germination ont développé des radicaux visibles et du tissu de pousses dans l’environnement de plaques de Petri non stériles. Après la transplantation au sol, un sous-groupe de semis de Typha s’est établi avec succès et a produit de nouveaux tissus de pousses en une à deux semaines.

Après inoculation avec des espèces de Luteimonas portant un plasmide DsRed, une colonisation bactérienne fluorescente rouge a été observée dans l’ensemble des racines des semis de Typha à 16 jours après l’inoculation.