Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

L’objectif global de ce protocole est de développer et de caractériser des cellules dendritiques tolérogènes murines pour l’évaluation de leur utilité immunothérapeutique dans le traitement de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie cellulaire dendritique tolérogène en fournissant une méthode standardisée pour le développement et la caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut être utilisée pour le développement réussi de cellules dendritiques tolérogènes et pour les tests d’efficacité fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes.

Les implications de cette technique sont importantes. Ils s’étendent au développement de l’immunothérapie cellulaire pour les maladies auto-immunes, car les cellules dendritiques tolérogènes peuvent réinitialiser une réponse immunitaire anormale tout en restant soumises à des mécanismes de régulation immunitaire intrinsèques. Après avoir récolté les os de la patte arrière de souris C57BL/6 âgées de huit à 10 semaines, conformément aux protocoles standard, utilisez des lames chirurgicales et des pinces pour disséquer autant de tissu que possible et placez les tibias et les fémurs propres dans une boîte de culture de six centimètres contenant 70 % d’éthanol.

Coupez les deux extrémités des os à l’aide d’une lame chirurgicale et utilisez une seringue de trois millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 23, pour rincer la moelle du premier os avec trois millilitres de PBS dans un tube conique de 15 millilitres. Lorsque toute la moelle osseuse a été prélevée, centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges. Après cinq minutes, arrêtez la lyse avec neuf millilitres de PBS et collectez les cellules par centrifugation.

Remettez en suspension la pastille de cellules de moelle osseuse blanche dans 10 millilitres de milieu de culture et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un nouveau tube. Ajustez les cellules à une concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture complété par du GM-CSF et de l’IL-4. Et plaquez trois millilitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 6 puits pour une incubation de trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le troisième jour, lavez les cellules de chaque puits avec deux millilitres de PBS et agitez doucement pour éliminer les cellules non adhérentes. Ensuite, nourrissez les cellules avec trois millilitres de milieu de culture frais complété par du GM-CSF et de l’IL-4 et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire, en ajoutant trois millilitres supplémentaires de milieu de culture frais, complété par des cytokines dans chaque puits après deux jours. Le septième jour de la culture, placez l’assiette sur de la glace.

Après 10 minutes, pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger en suspension les cellules dendritiques immatures et faiblement adhérentes dérivées de la moelle osseuse. Ensuite, regroupez les cellules pour la collecte par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans le volume approprié de milieu de culture frais pour une analyse ultérieure en aval. Pour mesurer la prolifération des lymphocytes T syngéniques, utilisez d’abord l’extrémité arrière d’un piston de seringue de trois millilitres pour écraser la rate d’une souris OT2 C57BL/6 âgée de huit à 10 semaines à travers une passoire de cellules de 40 micromètres et rincez la passoire avec du PBS.

Granulez la suspension cellulaire groupée par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 400 microlitres de tampon de tri cellulaire magnétique et 100 microlitres de cocktail biotine-anticorps de lymphocytes T CD4 positifs à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 300 microlitres de tampon de tri et 200 microlitres de billes d’anti-biotine dans les cellules pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius et placez une colonne de billes magnétiques et un filtre de pré-séparation dans un aimant de séparation cellulaire de taille appropriée. Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon de tri et ajoutez neuf millilitres de tampon de tri dans les cellules.

Après la centrifugation, remettre en suspension la cellule et la bille dans trois millilitres de tampon de tri et ajouter la suspension cellulaire à la colonne pour recueillir l’éluat de lymphocytes T CD4 positifs dans un récipient approprié. Ensuite, lavez la colonne avec trois autres millilitres de tampon de tri, collectez le flux et placez les cellules T sur de la glace. Pour l’isolement syngénique des cellules dendritiques de la panlogie splénique, placez la rate d’une souris C57BL/6 âgée de huit à dix semaines dans une boîte de culture de six centimètres et utilisez une seringue d’un millilitre, équipée d’une aiguille de calibre 25, pour injecter deux fois un millilitre de solution de collagénase D dans la rate.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la rate en petits morceaux et incubez les morceaux en secouant à température ambiante pendant 25 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 500 microlitres d’EDTA 0,5 molaire à la bouillie tissulaire pour une incubation finale de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, utilisez l’extrémité arrière d’un piston de seringue de trois millilitres pour écraser la boue de rate à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres et recueillir les cellules par centrifugation.

Remettez la pastille en suspension dans 350 microlitres de tampon de tri cellulaire magnétique, 50 microlitres de réactif bloquant le récepteur Fc et 100 microlitres de cocktail biotine-anticorps de cellules pandritiques pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans neuf millilitres de tampon de tri et remettre en suspension la pastille dans 800 microlitres de tampon de tri frais avec 200 microlitres de billes d’anti-biotine à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour isoler la population de cellules dendritiques de la panthémine splénique par tri par billes magnétiques, comme cela vient d’être démontré. Remettez les cellules en suspension à une concentration de deux fois 10 à la cinquième cellule dendritique par millilitre et traitez-les avec la concentration expérimentale appropriée du triterpénoïde d’intérêt pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Au cours du dernier tiers de l’incubation, remettre les lymphocytes T en suspension à une concentration de 10 à 10 à sept cellules par millilitre dans une CFSE micromolaire pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et réajustez le volume à une concentration finale de deux fois 10 à six cellules T par millilitre. Co-cultivez 100 microlitres de cellules dendritiques traitées avec 100 microlitres de cellules T CD4 positives marquées au CFSE dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et ajoutez 100 nanogrammes par millilitre de peptide OVA 323-329 aux cellules, en mesurant l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après deux à trois jours d’incubation.

Les cellules progénitrices de la moelle osseuse cultivées en milieu complet, en présence de GM-CSF et d’IL-4, présentent une morphologie de cellules dendritiques immatures après six jours de culture. L’analyse de cellules dendritiques immatures dérivées de la moelle osseuse au septième jour révèle l’expression robuste de CD11c, un marqueur spécifique des cellules dendritiques murines, par la majorité des cellules cultivées. Malgré l’absence d’effet sur l’expression des marqueurs de maturation induits par le LPS, les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse présentent un profil de cellules dendritiques tolérogènes en réponse au traitement CDDO-DFPA, comme en témoigne une réduction significative de l’expression des gènes pro-inflammatoires et une expression accrue des gènes des cytokines anti-inflammatoires, même après stimulation par le LPS.

De plus, une réduction significative de la prolifération des lymphocytes T syngéniques spécifiques de l’OVA est observée dans les co-cultures in vitro dans lesquelles l’OVA est présenté par des cellules dendritiques traitées par CDDO-DFPA et in vivo, comme en témoigne une progression retardée vers une encéphalomyélite auto-immune expérimentale après l’injection de cellules dendritiques traitées par CDDO-DFPA pulsées par MOG, confirmant ainsi le phénotype tolérogène de ces cellules. Une fois cette technique maîtrisée, les cellules dendritiques tolérogènes peuvent être développées en huit jours, si les expériences sont correctement réalisées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules dendritiques tolérogènes ne sont pas homogènes.

Leur phénotype cellulaire dépend de la nature des agents utilisés pour l’induction de leur tolérance. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse cytométrique en flux, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’énergie ou l’apoptose des lymphocytes T spécifiques de l’antigène induite par les cellules dendritiques tolérogènes ou sur la capacité de différenciation des lymphocytes T. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer des cellules dendritiques tolérogènes fonctionnellement actives à l’aide d’agents connus ou de la façon de tester la capacité de nouvelles substances à induire ces cellules.