Name: Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez le développement et la caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes murines pour l'immunothérapie des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques. Cette méthode standardisée permet d'évaluer l'efficacité thérapeutique cellulaire.

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Nous remercions Reata Pharmaceuticals pour la fourniture de CDDO-Division. Nous reconnaissons également l’appui de la Jane et Lee Seidman Chaire Innovation de Cancer pédiatrique (John Letterio). Ce travail a été soutenu par le ministère de la défense [W81XWH-12-1-0452] ; l’Initiative de recherche Cancer adultes Angie Fowler adolescents et les jeunes au cas Comprehensive Cancer Center ; et le diplômé Callahan Scholar Award pour Wei Hsi-Ju de F.J. Callahan Foundation.

Toutes les études ont été effectuées conformément aux procédures approuvées de la Case Western Reserve University School of Medicine animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.
1. préparer la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs)
<ol><li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.</li>
	<li>Euthanasier souris C57BL/6 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. L’accise OS fémur et du tibia-péroné à l’aide de ciseaux chirurgicaux et placez-les avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Utiliser des lames chirurgicales et pinces à disséquer les tissus loin autant que possible sur le couvercle de la 10 cm culture plat et isoler les tibias et fémurs de les placer avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 6 cm.</li>
	<li>Lames chirurgicales permet de couper les deux extrémités des tibias et des fémurs. Utiliser 3 mL de PBS en seringue de 3 ml avec une aiguille de 23G pour vider le contenu de la moelle osseuse d’un bout d’os dans un tube conique contenant 12 ml de PBS. Répétez cette opération 3 fois pour chaque extrémité des os.</li>
	<li>Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de tampon lyse de ACK pendant 5 minutes éliminer les globules rouges.</li>
	<li>Ajouter 9 ml de PBS pour diluer le tampon de lyse ACK et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension avec 10 ml de milieu de culture (RPMI 1640 plus L-glutamine, 10 % FBS, 1 % des aminoacides non essentiels (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoéthanol et 5 % la pénicilline/streptomycine). NOTE : Niveau d’endotoxine doit être inférieure à 0,1 UE/ml en BF.</li>
	<li>Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 40 μm et prendre 20 µl de suspension cellulaire et mélanger avec 80 µl du bleu pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant cytomètre trypan.</li>
	<li>Ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/ml à 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Plaque de 3 ml de 1 x 106 cellules/ml dans chaque puits de la plaque 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 . Remarque : Les cellules de la moelle osseuse de souris est d’environ 3-5 x 107 cellules, ce qui indique qu’il peut être placé entre 2 à 3 plaques 6 puits.</li>
	<li>Le jour 3, supprimer tous les 3 ml de milieu de culture de chaque puits, ajouter 2 ml de PBS frais dans chaque puits, et puis doucement agiter la plaque afin d’enlever toutes les cellules non adhérentes.</li>
	<li>Remplacer les 3 ml milieu de culture fraîche avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .</li>
	<li>Le jour 5, ajouter directement un autre milieu de culture frais 3 ml avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 . Remarque : Le volume total dans chaque puits est maintenant 6 ml.</li>
	<li>Jour 7, mettre la plaque entière sur la glace pendant 10 minutes. Pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger le faiblement adhérentes BMDCs comme pays en développement insulaires en suspension. Remarque : Les macrophages adhérentes sont encore attachées à la plaque. Procédures et doucement à basse température sont la clé pour éviter l’activation de DC pour affecter davantage les expériences.</li>
	<li>Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 mn et remettre en suspension avec milieu de culture frais pour d’autres expériences. Remarque : BMDCs peuvent être identifiées avec l’anticorps CD11c marqués par fluorescence par cytométrie en flux et nous avons montré notre stratégie de blocage de BMDCs pour d’autres expériences dans la Figure 1.</li>
</ol>2. caractériser les gènes TolDC et profil protéique
<ol><li>Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits en puits-plaque 6 milieu de culture dans la présence ou l’absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour l’incubation de 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 . NOTE : CDDO-Division, un synthétique triterpénoïdes, est un facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 inducteur de facteur (Nrf2) et inhibiteur du facteur nucléaire-κB (NF-κB). Appliquer des autres agents d’induction de TolDCs de pays en développement insulaires, tels que l’IL-10, vitamine D3, dexaméthasone ou la baie 11-7085 et modifier cette étape pour une condition optimale pour chaque agent.</li>
	<li>Ajouter 10 ou 100 ng/ml de LPS pour incubation 4-24 heures pour induire la CAM (temps d’incubation est différent en raison de la mesure d’ARNm ou protéines).</li>
	<li>Doucement le milieu de culture dans chaque puits, déposer et récolter la suspension cellulaire à l’aide de la pipette 1 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 5 mn recueillir les cellules et le surnageant, respectivement.</li>
	<li>Analyser les ligands surfaces des granulés de cellules par cytométrie en flux, tels que les stimulateurs ligands : CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligands inhibitrices : PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.</li>
	<li>Isoler l’ARN à partir des granulés de cellule et d’analyser les ARN et les échantillons surnageants pour les niveaux de profil et des gènes et des protéines de cytokine par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR) et ELISA, respectivement. NOTE : par exemple, des cytokines inflammatoires : TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 et IL-23 ou anti-inflammatoires cytokines : IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 et HO-1.</li>
</ol>3. évaluer la fonction de TolDCs In Vitro et In Vivo
<ol><li>
Analyse de syngénique prolifération de lymphocytes T
	<ol>
<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.</li>
		<li>Préparer le tampon Mac à l’aide de 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA dans 500 ml de PBS. Stériliser le tampon en le filtrant à travers un filtre de 0,2 µm. Remarque : Conservez le tampon sur la glace au cours de l’expérience suivante.</li>
		<li>Pour obtenir des CD4+ T cellules, euthanasier des souris transgéniques de OT-II T-cell receptor (TCR) âgés de 8 à 10 semaines à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux.</li>
		<li>Mettre la rate avec 2 ml de PBS dans une boîte de Petri de 6 cm et utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à mâcher la rate en passant une passoire de cellule 40 μm.</li>
		<li>Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 400 μl de tampon de MACS.</li>
		<li>Ajouter 100 μl de CD4+ T Cell biotine-anticorps Cocktail à 4° C pendant 5 minutes. Remarque : Le cocktail d’anticorps se lie sur les autres types de cellules sauf CD4 des cellules+ T, tels que CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 et TCRγ/δ.</li>
		<li>Ajouter 300 μl de tampon de MACS et 200 µL de perles anti-biotine (Table des matières) à 4° C pendant 10 minutes.</li>
		<li>Place la colonne composée de sphères ferromagnétiques (Table des matières) et filtre de pré-séparation ensemble dans le magnétique sur le terrain et le rincer avec 3 ml de tampon de MACS.</li>
		<li>Ajouter 9 ml de tampon de MACS dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 3 ml de tampon de MACS et appliquez sur la colonne. Collect intermédiaires contenant CD4+ T des cellules.</li>
		<li>Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS et également recueillir l’accréditif.</li>
		<li>Pour obtenir DCs pan splénique, euthanasier souris C57BL/6, 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Mettre la rate dans une boîte de Petri de 6cm contenant 2 ml de solution de collagènase D (collagénase de 2 mg/ml D dissous dans HBSS contenant du calcium, magnésium).</li>
		<li>Injecter 1 ml de solution de collagènase D à la rate deux fois avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25G. Couper la rate en petits morceaux avec des petits ciseaux.</li>
		<li>Agiter et laisser incuber à température ambiante pendant 25 minutes.</li>
		<li>Ajouter 500 μl d’EDTA 0,5 M à température ambiante pendant 5 minutes. Remarque : Les étapes de 3.1.13-3.1.14 sont essentiels pour accroître le rendement des contrôleurs de domaine.</li>
		<li>Maintenant utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à émincer la boue rate en passant une passoire de cellule 40 μm et recueillir la suspension cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 mn.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 350 μl de tampon MACS, 50 µl de réactif de blocage de FcR et de 100 μl de Pan biotine-anticorps cellules dendritiques Cocktail à 4° C pendant 10 minutes. Remarque : L’anticorps cocktail contre les antigènes qui ne sont pas exprimées par les contrôleurs de domaine.</li>
		<li>Laver les cellules en ajoutant 9 ml de tampon de MACS et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 800 μl de tampon de MACS et ajouter 200 µL de anti-biotine perles à 4 ° C pendant 10 minutes.</li>
		<li>Répétez les étapes de 3.1.9-3.1.11 de recueillir des contrôleurs de domaine.</li>
		<li>Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS deux fois et aussi recueillir l’accréditif.</li>
		<li>Traiter les 2 x 105 DCs/ml en présence ou en absence de lymphocytes T de 100 à 400 nM CDDO-Division à 37 ° C pendant 1 h séparément, étiquette le CD4+ (1 x 107/ml) avec 1 μM CFSE à 37 ° C pendant 15 minutes, laver avec du PBS et réajuster le volume pour obtenir la concentration finale de 2 x 106 T cellules/ml.</li>
		<li>Ensuite, dans une plaque à 96 puits, co-culture 100 μl des cellules dendritiques traitées avec le même volume de CD4 marqué CFSE+ T cells, tous deux prélevés dans les étapes ci-dessus pour obtenir 01:10 ratio. Maintenant ajoutez 100 ng/mL le peptide d’ovalbumine (OVA) 323-329 par puits et mesure l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après 2-3 jours d’incubation. Remarque : Le nombre de cellules et le rapport des contrôleurs de domaine et T ont été optimisés en cellules de nos précédents travaux37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induire le passif EAE en injectant BMDCs pulsé avec la myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits de 6 puits-plaque avec milieu de culture en présence ou en absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour incubation 1hr.</li>
		<li>Ajouter 10 ng/ml de LPS pour incubation 24 hrs.</li>
		<li>Ajouter 100 μg/ml de MOG (35-55) pour incubation 4 hrs.</li>
		<li>Récolter la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
		<li>Resuspendre le culot cellulaire avec du PBS et compter les cellules.</li>
		<li>Injecter par voie sous-cutanée de 200 μl de 2 x 106 cellules à des souris C57BL/6 femelles âgés de 8 à 10 semaines (100 μl dans chaque patte arrière).</li>
		<li>Le jour de l’injection de BMDC et 48 heures. plus tard, injecter 200 ng de la toxine coquelucheuse (PTX) dans chacune des souris.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.2.6-3.2.7 une fois par semaine pendant 4 semaines consécutives.</li>
		<li>Évaluer les symptômes cliniques de l’EAE quotidiennement en utilisant les critères standard37 (0,5 limp queue, queue 1-boites, faiblesse modérée 2 patte, patte 3 grave faiblesse, paralysie de la patte 4-complet, état 5-quadriplégie ou moribond, 6-mort).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Cet article décrit un protocole efficace qui peut être utilisé pour reproductible pour générer des pays en développement insulaires et à les différencier par la suite dans TolDCs, et nous proposons que cela peut servir à évaluer la capacité des nouveaux agents de la cible moléculaire pour induire la TolDC phénotype. Comme décrit dans le présent rapport, nous avons suivi une séquence dans laquelle nous avons tout d’abord analysé TolDC expression de ligands surfaces par cytométrie en flux, suivie d’une évaluation du profil...

Les cellules dendritiques (CD) font partie intégrante du système immunitaire inné et ont d’abord découvert et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 comme cellules présentatrices d’antigène professionnelle primaire1. DCs ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’activation immunitaire en présentant des antigènes transformés à cellules T et cellules B via des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) dans les organes lymphoïdes secondaires pour relier le système immunitaire inné et adaptatif2. Dans le système immunitaire des mammifères, il y a au moins deux catégories de contrôleurs de domaine qui ont été décrits comme myéloïde DCs et plasmacytoides des contrôleurs de domaine (PDC)3. DCs myéloïdes, aussi connus comme le DCs classiques (CDC), sont caractérisées par l’expression de CD11c et peuvent être différenciées comme immatures DCs (iDCs) in vitro de cellules souches de moelle osseuse ou les monocytes du sang périphérique à l’aide granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4 espèces murines ou humaines, respectivement4.
Activation de « danger » de signaux, tels que les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés (PAMP) ou profils moléculaires associés aux dommages (DAMP), conduira la maturation iDCs vers DCs immunogènes comme matures DCs (CAM) via liaison différents récepteurs de reconnaissance de modèle la surface DC5. Immunogènes DCs plus amorcer la prolifération des lymphocytes T naïfs et la différenciation par le biais de l’augmentation de MHCII2, ligands costimulation (CD80, CD86, CD40 et)6, cytokines et autres médiateurs solubles7. Une cascade de production pro-inflammatoire médiateur de DCs immunogène est essentielle pour la différenciation des cellules de T médiée par les cytokines. Par exemple, tant IL-12 et IFN-γ sont nécessaires pour de différenciation Th18 et IL-1, IL-6 et IL-23 sont essentiels pour naïve des lymphocytes T polarisation vers de cellules Th179. Bien que matures DCs réagissent aux antigènes étrangers, activation incontrôlée de DC par auto-antigènes susceptible d’entraîner l’ablation de tolérance et favorisent le développement de maladies auto-immunes en générant des cellules autoréactives T dont l’activation mène à la destruction des tissus10 .
Des rapports récents ont fourni une preuve claire de la plasticité de DC, témoigne de leur capacité à interagir avec différents repères au sein de leur microenvironnement de tissu et à se différencier en sous-ensembles distincts effecteur/suppresseur DC. Les médiateurs anti-inflammatoires, comme l’IL-10,11, TGF-β12et13 de la HO-1 ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’immunosuppression en induisant tolérogène DCs (TolDCs). Ces TolDCs acquérir des fonctions régulatrices et supprimer la prolifération de lymphocytes T14. En outre, l’absence de Co-stimulation par DCs la production de médiateurs anti-inflammatoires de TolDCs contribuent à l’induction des cellules T régulatrices (Tregs) et aussi efficacement inhibe la différenciation et l’expansion des Th1 et Th1715. Dans passé deux décennies, le potentiel thérapeutique des TolDCs a été rapporté par plusieurs chercheurs. Dans ces études, l’administration de l’ex-vivo généré TolDCs non seulement amélioré les symptômes pathologiques dans différents modèles précliniques de maladies auto-immunes16 mais aussi conduit au développement d’une tolérance immunitaire chez les patients17 ,,18. Fait intéressant, aujourd'hui la thérapie TolDCs a été considérée comme une approche alternative ou complémentaire pour des maladies auto-immunes dans plusieurs essais cliniques, y compris de type 1 diabète sucré19, polyarthrite rhumatoïde,20, 21, sclérose en plaques (MS)22,23,24et de la maladie de Crohn25.
Il existe une variété de protocoles qui ont été employés pour développer TolDCs et plusieurs laboratoires ont signalé des méthodes pour la production et la caractérisation phénotypique de TolDCs. Ces méthodes peuvent être utilisées de façon reproductible générer TolDCs in vitro de progéniteurs hématopoïétiques et de les maintenir stablement dans un état in vivode la tolérogène26,27,28,29. L’iDCs peut être converti en TolDCs par l’exposition à divers agents pharmacologiques immunomodulateurs ou cytokines anti-inflammatoires. Par exemple, la vitamine D3 est un agent pharmacologique bien connu connu pour augmenter la production d’IL-10 et de supprimer la sécrétion d’IL-12 de contrôleurs de domaine et d’accroître ainsi leur fonction immunosuppressive30. En outre, lorsque les contrôleurs de domaine sont exposés à des stimuli inflammatoires puissants, tels que les lipopolysaccharides (LPS), plusieurs agents pharmacologiques telles que dexaméthasone31et32de la rapamycine corticostéroïdes33 ont démontré qu’induisent les Phénotype TolDC en réduisant l’expression de CD40, CD80, CD86 et MHCII34DC en surface. IL-10 et TGF-β sont les cytokines anti-inflammatoires plus étudié pour induire la tolérance de DC35 et l’exposition simultanée à la fois de ces cytokines auraient dû être divulgués pour induire un phénotype tolérogène dans DCs36.
Depuis le tolérogène que DC est défini par des caractéristiques fonctionnelles plutôt que par des marqueurs phénotypiques, il y a un grand besoin d’élaborer une méthode cohérente pour la caractérisation fonctionnelle et cellulaire des TolDCs. En outre, un protocole rigoureux et cohérent doit être établi d’évaluation cohérents et de caractérisation du phénotype tolérogène DC si l'on veut efficacement et de façon reproductible comparer la capacité des nouveaux agents d’induire le phénotype TolDC dans la laboratoire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé avec les méthodes étape par étape pour isoler les pays en développement insulaires de progéniteurs hématopoïétiques de souris et d’analyser par la suite l’efficacité d’un nouvel agent en cours d’évaluation pour leur capacité à convertir des pays en développement insulaires en TolDCs, fournissant une robuste caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TolDCs in vitro et in vivo. Cette description inclut une méthode élaborée pour caractériser la TolDCs de leurs ligands surfaces, profil des cytokines et fonctions immunosuppressive in vitro. Nous fournissons également un exemple d’une méthode pour étudier l’application thérapeutique potentielle de ces TolDCs dans un modèle préclinique de MS, encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Ce protocole établi aide les chercheurs à évaluer la capacité des nouveaux agents pour promouvoir l’induction de TolDCs et facilitera les efforts visant à élargir le champ de développement thérapeutique TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>en synthèse maison</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Souris GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>Différenciation BMDC</td></tr><tr><td>Souris IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>Différenciation BMDC</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides (LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>&bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Toxine coquelucheuse (PTX)</td><td>R& D systems</td><td>3097</td><td>EAE</td></tr><tr><td>induction MOG (35&ndash ; 55) peptide</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>in house synthesis</td><td>EAE</td></tr><tr><td>induction Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide aminé non essentiel (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>40 &#956 ; Filtre cellulaire m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Isolement cellulaire</td></tr><tr><td>PE conjugué CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>PE conjugué CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>PE conjugué-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC conjugué MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>CD11c conjuguée APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Cytométrie</td></tr><tr><td>en flux Isotype apparié PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Isotype apparié APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes</td></tr><tr><td>T Kit d’isolement de cellules pandritiques</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Réactif bloquant FcR</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Cocktail de biotine-anticorps à base de cellules dendritiques</td><td>Pan Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T Microbilles</td></tr><tr><td>anti-biotine</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD4+ Kit d’isolement des lymphocytes</td><td>T Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes</td></tr><tr><td>T CD4+ Cocktail de biotine-anticorps</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T Microbilles</td></tr><tr><td>anti-biotine</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T Tampon</td></tr><tr><td>de lyse ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>Différenciation BMDC</td></tr><tr><td>1 ml seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>3 ml Seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>Différenciation BMDC</td></tr><tr><td>25G aiguille</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Aiguille 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>BMDC différenciation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes</td></tr><tr><td>T EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Filtre de pré-séparation</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>collagénase D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>peptide d’ovalbumine (OVA) 323&ndash ; 329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>O1641</td><td>Essai de prolifération des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Souris IFN-&gamma ; Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Souris IL-12a Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Souris IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Souris EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha ; Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Souris TNF-&alpha ; Kit ELISA Quantikine</td><td>R& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan sonde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Souris IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23A Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MM01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Souris IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta ; Sonde TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticorps anti-hème oxygénase 1</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-&bêta ;-actine</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réel</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytométrie en flux</td></tr></tbody></table>

développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Le système immunitaire fonctionne en maintenant un équilibre serré entre la coordination des réponses contre les antigènes étrangers et maintenir un État ne répondant pas contre des auto-antigènes comme antigènes dérivés d’organismes commensaux. La perturbation de cette homéostasie immunitaire peut entraîner une inflammation chronique et le développement de l’auto-immunité. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigène professionnelles du système immunitaire inné impliqué dans l’activation des cellules naïves T pour initier des réponses immunitaires contre les antigènes étrangers. Cependant, DCs peuvent également être différenciés dans les TolDCs qui agissent pour maintenir et promouvoir la tolérance des lymphocytes T et de supprimer les cellules effectrices qui contribuent au développement des deux conditions d’inflammation auto-immune ou chronique. Le récent progrès dans notre compréhension de TolDCs suggère que DC tolérance peut être réalisée en modulant leurs conditions de différenciation. Ce phénomène a entraîné une croissance considérable dans le développement de thérapies TolDC de nombreux désordres du système immunitaire causées à rompre dans la tolérance immunitaire. Des études dans les modèles murins auto-immunité précliniques ont validé davantage l’immunothérapie utilité de TolDCs dans le traitement des maladies auto-immunes. Aujourd'hui, les TolDCs sont devenus un outil prometteur immunothérapeutique dans la clinique de rétablissement tolérance immunitaire dans divers troubles immunitaires en ciblant les réponses auto-immunes pathogènes tout en conservant l’immunité protectrice intactes. Bien qu’un éventail de stratégies a été proposée par plusieurs laboratoires pour induire la TolDCs, il n’y a aucune cohérence pour caractériser le phénotype cellulaire et fonctionnel de ces cellules. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour le développement de la moelle osseuse DCs en grand nombre, une méthode unique permettant de les différencier en TolDCs avec un 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic de triterpénoïdes synthétique difluoro-propyl-amide de l’acide (CDDO-Division) et les techniques utilisées pour confirmer leur phénotype, y compris les analyses des signatures moléculaires essentielles de TolDCs. Enfin, nous montrons une méthode pour évaluer la fonction TolDC en testant leur réponse immunosuppressive in vitro et in vivo dans un modèle préclinique de sclérose en plaques.

La différenciation et la sélection de BMDCs :
Cellules souches de la moelle osseuse ont été cultivés en milieu RPMI complet en présence de GM-CSF et d’IL-4 à se différencier en pays en développement insulaires pendant 7 jours (Figure 1 a). Jour 1, les cellules ont de petite taille et morphologie sphérique. Laver avec du PBS avant le remplacement du milieu frais le jour 3 aidé des ce...

Nous présentons ici un protocole visant à développer et caractériser les cellules dendritiques tolérogène (TolDCs) et évaluer leur utilité immunothérapeutique.

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

L’objectif global de ce protocole est de développer et de caractériser des cellules dendritiques tolérogènes murines pour l’évaluation de leur utilité immunothérapeutique dans le traitement de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie cellulaire dendritique tolérogène en fournissant une méthode standardisée pour le développement et la caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle peut être utilisée pour le développement réussi de cellules dendritiques tolérogènes et pour les tests d’efficacité fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes.Les implications de cette technique sont importantes. Ils s’étendent au développement de l’immunothérapie cellulaire pour les maladies auto-immunes, car les cellules dendritiques tolérogènes peuvent réinitialiser une réponse immunitaire anormale tout en restant soumises à des mécanismes de régulation immunitaire intrinsèques. Après avoir récolté les os de la patte arrière de souris C57BL/6 âgées de huit à 10 semaines, conformément aux protocoles standard, utilisez des lames chirurgicales et des pinces pour disséquer autant de tissu que possible et placez les tibias et les fémurs propres dans une boîte de culture de six centimètres contenant 70 % d’éthanol.Coupez les deux extrémités des os à l’aide d’une lame chirurgicale et utilisez une seringue de trois millilitres, équipée d’une aiguille de calibre 23, pour rincer la moelle du premier os avec trois millilitres de PBS dans un tube conique de 15 millilitres. Lorsque toute la moelle osseuse a été prélevée, centrifugez la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges. Après cinq minutes, arrêtez la lyse avec neuf millilitres de PBS et collectez les cellules par centrifugation.Remettez en suspension la pastille de cellules de moelle osseuse blanche dans 10 millilitres de milieu de culture et filtrez les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un nouveau tube. Ajustez les cellules à une concentration d’une fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture complété par du GM-CSF et de l’IL-4. Et plaquez trois millilitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 6 puits pour une incubation de trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le troisième jour, lavez les cellules de chaque puits avec deux millilitres de PBS et agitez doucement pour éliminer les cellules non adhérentes. Ensuite, nourrissez les cellules avec trois millilitres de milieu de culture frais complété par du GM-CSF et de l’IL-4 et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire, en ajoutant trois millilitres supplémentaires de milieu de culture frais, complété par des cytokines dans chaque puits après deux jours. Le septième jour de la culture, placez l’assiette sur de la glace.Après 10 minutes, pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger en suspension les cellules dendritiques immatures et faiblement adhérentes dérivées de la moelle osseuse. Ensuite, regroupez les cellules pour la collecte par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans le volume approprié de milieu de culture frais pour une analyse ultérieure en aval. Pour mesurer la prolifération des lymphocytes T syngéniques, utilisez d’abord l’extrémité arrière d’un piston de seringue de trois millilitres pour écraser la rate d’une souris OT2 C57BL/6 âgée de huit à 10 semaines à travers une passoire de cellules de 40 micromètres et rincez la passoire avec du PBS.Granulez la suspension cellulaire groupée par centrifugation et remettez la pastille en suspension dans 400 microlitres de tampon de tri cellulaire magnétique et 100 microlitres de cocktail biotine-anticorps de lymphocytes T CD4 positifs à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 300 microlitres de tampon de tri et 200 microlitres de billes d’anti-biotine dans les cellules pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius et placez une colonne de billes magnétiques et un filtre de pré-séparation dans un aimant de séparation cellulaire de taille appropriée. Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon de tri et ajoutez neuf millilitres de tampon de tri dans les cellules.Après la centrifugation, remettre en suspension la cellule et la bille dans trois millilitres de tampon de tri et ajouter la suspension cellulaire à la colonne pour recueillir l’éluat de lymphocytes T CD4 positifs dans un récipient approprié. Ensuite, lavez la colonne avec trois autres millilitres de tampon de tri, collectez le flux et placez les cellules T sur de la glace. Pour l’isolement syngénique des cellules dendritiques de la panlogie splénique, placez la rate d’une souris C57BL/6 âgée de huit à dix semaines dans une boîte de culture de six centimètres et utilisez une seringue d’un millilitre, équipée d’une aiguille de calibre 25, pour injecter deux fois un millilitre de solution de collagénase D dans la rate.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la rate en petits morceaux et incubez les morceaux en secouant à température ambiante pendant 25 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 500 microlitres d’EDTA 0,5 molaire à la bouillie tissulaire pour une incubation finale de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, utilisez l’extrémité arrière d’un piston de seringue de trois millilitres pour écraser la boue de rate à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres et recueillir les cellules par centrifugation.Remettez la pastille en suspension dans 350 microlitres de tampon de tri cellulaire magnétique, 50 microlitres de réactif bloquant le récepteur Fc et 100 microlitres de cocktail biotine-anticorps de cellules pandritiques pour une incubation de 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans neuf millilitres de tampon de tri et remettre en suspension la pastille dans 800 microlitres de tampon de tri frais avec 200 microlitres de billes d’anti-biotine à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour isoler la population de cellules dendritiques de la panthémine splénique par tri par billes magnétiques, comme cela vient d’être démontré. Remettez les cellules en suspension à une concentration de deux fois 10 à la cinquième cellule dendritique par millilitre et traitez-les avec la concentration expérimentale appropriée du triterpénoïde d’intérêt pendant une heure à 37 degrés Celsius.Au cours du dernier tiers de l’incubation, remettre les lymphocytes T en suspension à une concentration de 10 à 10 à sept cellules par millilitre dans une CFSE micromolaire pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et réajustez le volume à une concentration finale de deux fois 10 à six cellules T par millilitre. Co-cultivez 100 microlitres de cellules dendritiques traitées avec 100 microlitres de cellules T CD4 positives marquées au CFSE dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et ajoutez 100 nanogrammes par millilitre de peptide OVA 323-329 aux cellules, en mesurant l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après deux à trois jours d’incubation.Les cellules progénitrices de la moelle osseuse cultivées en milieu complet, en présence de GM-CSF et d’IL-4, présentent une morphologie de cellules dendritiques immatures après six jours de culture. L’analyse de cellules dendritiques immatures dérivées de la moelle osseuse au septième jour révèle l’expression robuste de CD11c, un marqueur spécifique des cellules dendritiques murines, par la majorité des cellules cultivées. Malgré l’absence d’effet sur l’expression des marqueurs de maturation induits par le LPS, les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse présentent un profil de cellules dendritiques tolérogènes en réponse au traitement CDDO-DFPA, comme en témoigne une réduction significative de l’expression des gènes pro-inflammatoires et une expression accrue des gènes des cytokines anti-inflammatoires, même après stimulation par le LPS.De plus, une réduction significative de la prolifération des lymphocytes T syngéniques spécifiques de l’OVA est observée dans les co-cultures in vitro dans lesquelles l’OVA est présenté par des cellules dendritiques traitées par CDDO-DFPA et in vivo, comme en témoigne une progression retardée vers une encéphalomyélite auto-immune expérimentale après l’injection de cellules dendritiques traitées par CDDO-DFPA pulsées par MOG, confirmant ainsi le phénotype tolérogène de ces cellules. Une fois cette technique maîtrisée, les cellules dendritiques tolérogènes peuvent être développées en huit jours, si les expériences sont correctement réalisées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules dendritiques tolérogènes ne sont pas homogènes.Leur phénotype cellulaire dépend de la nature des agents utilisés pour l’induction de leur tolérance. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse cytométrique en flux, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’énergie ou l’apoptose des lymphocytes T spécifiques de l’antigène induite par les cellules dendritiques tolérogènes ou sur la capacité de différenciation des lymphocytes T. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer des cellules dendritiques tolérogènes fonctionnellement actives à l’aide d’agents connus ou de la façon de tester la capacité de nouvelles substances à induire ces cellules.

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Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Cette vidéo montre la génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes, ou DC, à partir de monocytes humains. L’incubation des monocytes avec des facteurs de croissance et des cytokines conduit à la production de CD immatures. En réponse aux molécules régulatrices immunitaires, les CD immatures se différencient en CD tolérogènes et matures.

Génération de cellules dendritiques immatures, matures et tolérogènes à partir de monocytes

Cette vidéo présente une méthode de conversion de cellules dendritiques (DC) en DC tolérogènes (TolDCs) à l’aide d’un agent pharmacologique immunomodulateur. Cette conversion est confirmée par l’évaluation de la fonction de TolDC à travers leur effet immunosuppresseur sur les lymphocytes T CD4+.

Effet d’un agent pharmacologique immunomodulateur sur l’interaction entre les cellules dendritiques et les lymphocytes T CD4+

Ce protocole décrit les procédures expérimentales pour évaluer la différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer de progéniteurs de cellules dendritiques ordinaires, en utilisant des techniques impliquant l'isolement FACS à médiation cellulaire, le transfert de gène hydrodynamique, et l'analyse des flux de sous-ensembles immuns dans les plaques de Peyer.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

Dans cette étude, nous présentons un système de culture in vitro capable de générer efficacement des pDC en co-cultivant des progéniteurs lymphoïdes communs avec des cellules nourricières AC-6 en présence du ligand Flt3.

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Des sous-ensembles distincts de cellules dendritiques existent en tant que populations rares dans les organes lymphoïdes, et sont donc difficiles à isoler en nombre suffisant et en pureté suffisante pour des expériences immunologiques. Nous décrivons ici une méthode à haute efficacité et à haut rendement pour l’isolement de tous les principaux sous-ensembles actuellement connus de cellules dendritiques spléniques de souris.

Une méthode de rendement efficace et haute pour l&#39;isolement des souris dendritiques sous-ensembles cellulaires

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Nous fournissons ici un protocole pour le dépistage des facteurs de transcription potentiels impliqués dans le développement de cellules dendritiques (DC) en utilisant la transduction lentivirale de l’ARNh pour obtenir des lignées cellulaires knockdown stables pour la différenciation DC in vitro .

Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

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Méthode simple et efficace pour tester des agents immunomodulateurs pour la génération de cellules dendritiques tolérogènes à partir de monocytes CD14+ humains

Découvrez le développement et la caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogènes murines pour l'immunothérapie des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques. Cette méthode standardisée permet d'évaluer l'efficacité thérapeutique cellulaire.

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

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