Analyse de l’expression et de l’assemblage des complexes des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale chez la levure de fission Schizosaccharomyces pombe

Le champ de notre recherche est la traduction des protéines mitochondriales, et nous essayons d’élucider les mécanismes qui affectent la traduction et l’assemblage du complexe de la chaîne respiratoire mitochondriale. Nos recherches ont révélé que shy1 joue un rôle dans la durabilité du fonctionnement régulier des mitochondries en participant à l’assemblage de quatre perfusions complexes. Notre laboratoire étudiera le mécanisme de la perfusion de M=méthotrexate.

[Narrateur] Pour commencer, mesurez le poids humide d’une pastille de cellules de Schizosaccharomyces pombe. Remettez les cellules en suspension dans huit millilitres de tampon S. Ajoutez du dithiothréitol à une concentration finale de 10 millimolaires et du fluorure de phénylméthylsulfonyle à un millimolaire, en vous assurant que les deux réactifs sont fraîchement préparés. Ajoutez des enzymes lytiques à la suspension cellulaire pour digérer la paroi cellulaire de Schizosaccharomyces pombe. Faites pivoter le tube sur un agitateur à 30 degrés Celsius pendant la durée recommandée pour l’enzyme lytique spécifique. Utilisez un microscope pour observer la formation des sphéroplastes. Ensuite, centrifugez l’échantillon pendant 10 minutes à 1 000 G, à 4 degrés Celsius pour granuler les sphéroplastes. Remettez le granulé en suspension dans huit millilitres de tampon S glacé. Après deux lavages, remettre les sphéroplastes en suspension dans huit millilitres de tampon d’homogénéisation glacé contenant des inhibiteurs de protéase. Transférez le mélange dans un homogénéisateur en verre pré-refroidi contenant un pilon et un tube à essai. Homogénéisez les cellules mécaniquement en effectuant environ 15 mouvements de haut en bas avec le pilon bien ajusté. Ensuite, examinez les sphéroplastes au microscope pour vérifier la rupture de la membrane. Transférez maintenant la suspension homogénéisée dans les tubes à centrifuger. Centrifugez pendant cinq minutes à 1 000 G à 4 degrés Celsius pour granuler les cellules et les débris intacts. Centrifugez le surnageant résultant pendant cinq minutes à 3 000 G à 4 degrés Celsius pour granuler les noyaux. Transférez ensuite le surnageant dans des tubes à centrifuger frais. Centrifugez à 12 000 G pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius pour granuler les mitochondries et autres organites, remettez en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de serpillières de sorbitol EDTA glacé après décantation du surnageant. Ensuite, centrifugez à nouveau pendant 15 minutes à 12 000 G à 4 degrés Celsius pour laver les mitochondries. Remettez en suspension la pastille finale dans un millilitre de tampon de vadrouille EDTA sorbitol glacé. Ensuite, aliquote les mitochondries purifiées dans des tubes de stockage pour de futures expériences. Sur la page SDS, chargez la mémoire tampon dans 40 microlitres de protéines totales mitochondriales. Dénaturez les protéines en incubant le mélange pendant le temps indiqué à la température appropriée. Chargez environ 20 microgrammes ou quatre microlitres de protéines mitochondriales dans un gel de page SDS à 12 % avant l’immuno-transfert. Pour préparer l’échantillon pour la page BN, prélever d’abord les mitochondries granulaires des aliquotes précédentes par centrifugation. Remettez les mitochondries en suspension dans 200 microlitres de trois tampons de gel de page XBN. Ensuite, pipetez deux microlitres de 100 X de fluorure de phénylméthylsulfonyle et un microlitre de chlorure de magnésium molaire. Centrifugez à nouveau pendant 15 minutes à 12 000 G à 4 degrés Celsius. Remettez en suspension la pastille mitochondriale dans 160 microlitres de 5 % en poids par volume digitorum. Incuber sur glace pendant 30 minutes en mélangeant doucement toutes les 10 minutes. Centrifugez la suspension pendant cinq minutes à 20 000 G à 4 degrés Celsius. Transférez ensuite le surnageant dans un tube frais. Ajoutez 80 microlitres de tampon d’échantillon de trois pages XBN à l’échantillon traité par digitorum. Soit 32 microlitres à l’échantillon traité au DDM. Assemblez maintenant les gels natifs Bis-Tris préfabriqués avec une pente de 3 à 12 %. Chargez les échantillons de protéines traitées avec des marqueurs protéiques de haut poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif. Faites fonctionner le gel à une tension constante de 80 volts et à un courant de six milliampères pendant 30 minutes à l’aide d’un tampon cathodique contenant 0,02 % de Kumasi G250. Remplacez le tampon par un tampon cathodique sans Kumasi et continuez à fonctionner à 10 milliampères pendant trois heures jusqu’à ce que le front du colorant atteigne le fond du gel. Coupez la bande de gel contenant le marqueur protéique. Colorez le marqueur avec le tampon Kumasi R250 pendant 15 minutes. Ensuite, détachez jusqu’à ce que les bandes deviennent visibles. Plongez la partie restante du gel dans le tampon de transfert de page BN pendant 30 minutes pour équilibrer. Rincer la membrane de transfert PVDF de 0,45 micromètre avec du méthanol et équilibrer dans le tampon de transfert pendant 10 minutes. Transférez les protéines du gel sur la membrane PVDF en utilisant un courant constant de 300 milliampères pendant deux heures. Rincez la membrane PVDF avec du méthanol pour éliminer le colorant Kumasi. Ensuite, incubez la membrane dans un tampon bloquant TBS contenant 5 % de lait écrémé pendant une heure à 25 degrés Celsius. Incuber la membrane PVDF avec les anticorps primaires spécifiés contre les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale de Schizosaccharomyces pombe. Après une nuit d’incubation à quatre degrés Celsius, laver la membrane à l’aide d’un tampon TBST. Ensuite, incubez la membrane dans l’anticorps secondaire à une dilution de un à 10 000 pendant une heure à 25 degrés Celsius. Après avoir lavé la membrane avec un tampon TBST, exposez et scannez la membrane PVDF pour visualiser les résultats de l’immuno-transfert. La délétion du gène shy1 a entraîné une réduction marquée des niveaux à l’état d’équilibre des protéines de la chaîne respiratoire codées par l’ADN mitochondrial, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 et Atp6. L’analyse de la page native bleue a montré que l’abondance des supercomplexes 3242 et 324 de la chaîne respiratoire solubilisée DG était réduite dans les cellules Delta shy1. Alors que les niveaux de super complexes 32.= et 55N sont restés inchangés. Le niveau de DDM solubilisé du complexe diamétral 3 était inchangé dans la souche Delta shy1.