Name: Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Découvrez un modèle d'infection persistante chez les larves de poisson-zèbre blessées pour étudier Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode reproduit la tolérance aux antibiotiques et accélère le criblage de nouveaux traitements.

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Toutes les expériences sur le poisson-zèbre décrites dans la présente étude ont été menées à l’Université de Montpellier en suivant les principes des 3R - Remplacement, Réduction et Raffinement - selon les directives de l’Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par la Direction Sanitaire et Vétérinaire de l’Hérault et le Comité d’Ethique pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques sous la référence CEEA-LR-B4-172-37. Toutes les expériences d’infection ont été réalisées sur des embryons jusqu’à 5 jours après la fécondation. L’élevage du poisson-zèbre adulte (Danio rerio) à partir des poissons AB ou Golden Lines a respecté les directives internationales spécifiées par la directive européenne sur la protection des animaux 2010/63/UE. Installation de poisson-zèbre de l’Université de Montpellier avec des conditions standard définies comme un cycle lumière/obscurité de 12 h :12 h, réservoir en polycarbonate de 3,5 L (maximum 22 poissons par réservoir) connecté à un système de recirculation avec une salinité de 4 % / conductivité de 400 μS et une température de l’eau de 28 °C. Les poissons ont été nourris 2 fois par jour avec de la nourriture pour poissons.
1. Préparation des solutions
<ol>
	<li>Préparez une solution de travail 1x pour l’eau de poisson avec ou sans bleu de méthylène pour la croissance des embryons de poisson-zèbre (voir tableau 1).</li>
	<li>Préparez 20 fois la solution mère (0,4 %) et 1 solution anesthésique de tricaïne fonctionnelle comme décrit dans le tableau 1. Pour éviter la congélation et la décongélation répétées de la solution mère, préparer 10 mL d’aliquotes de tricaïne 20x et les conserver à -20 °C.</li>
	<li>Préparez une solution de triton à 2 % diluée dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Tableau 1).</li>
</ol>
2. Préparation de l’inoculum de  P. aeruginosa fluorescent exprimant la GFP de manière constitutive
REMARQUE : Tous les travaux avec P. aeruginosa sont effectués avec les précautions BSL-2 dans une enceinte de biosécurité. Les souches de P. aeruginosa doivent être génétiquement modifiées pour exprimer constitutivement un rapporteur fluorescent, tel que la GFP (tel qu’utilisé ici et décrit en13). L’utilisation de souches avec un rapporteur fluorescent codé chromosomiquement est fortement recommandée pour éviter la perte de plasmide dans le cas d’un rapporteur fluorescent codé par plasmide.
<ol>
	<li>2 jours avant l’infection, faire prélever à partir de -80 °C un stock de P. aeruginosa génétiquement modifié exprimant la GFP sur des plaques de gélose LB (tableau 1) et incuber toute la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Vérifier la fluorescence des colonies à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement 6x) pour inoculer une colonie GFP+P. aeruginosa dans 1 mL de bouillon LB (tableau 1) et faire croître pendant la nuit à 37 °C en agitant (180 tr/min).</li>
	<li>Le jour de l’infection, diluer la culture de nuit de P. aeruginosa ci-dessus à 1:20 dans 5 mL de bouillon LB frais. Cultivez les bactéries à 37 °C en secouant (180 tr/min) jusqu’à ce que la culture atteigne une DO600 = 0,8. Cela devrait prendre environ 2-3 h.</li>
	<li>Centrifuger la culture bactérienne pendant 10 min à température ambiante (RT) à 3584 x g. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène.</li>
	<li>Adapter le volume de culture avec de l’eau de poisson pour avoir 7 x 107 à 1 x 108 UFC/mL. Cela correspond à une DO600 d’environ 0,15 (à adapter pour chaque souche).</li>
	<li>Pour quantifier l’inoculum, procéder à une dilution en série de la suspension bactérienne, déposer 20 μL de la dilution 10-4 sur une plaque de gélose LB et incuber pendant une nuit à 37 °C.</li>
	<li>Comptez les colonies GFP+ au microscope fluorescent pour déterminer les UFC de l’inoculum.</li>
</ol>
3. Collecte et préparation des embryons de poisson-zèbre
<ol>
	<li>3 jours avant l’expérience d’immersion bactérienne, mettez en place des couples reproducteurs de poissons-zèbres. Placez un mâle et une femelle reproducteurs dans un bassin de croisement.</li>
	<li>Le lendemain matin, récupérez les œufs après la fécondation à l’aide d’une passoire à mailles fines. Placez les œufs collectés dans une boîte de Pétri contenant de l’eau de poisson avec du bleu de méthylène.</li>
	<li>Pour éviter la contamination, ajoutez 1 goutte d’eau de Javel dans la boîte de Pétri. Après 5 min, changez l’eau du poisson avec du bleu de méthylène pour enlever l’eau de Javel.</li>
	<li>Jetez les ovules dont le développement embryonnaire est anormal (les ovules non fécondés sont similaires à un stade d’œuf à 1 cellule) ou les ovules morts (aspect blanc).</li>
	<li>Le matin de l’infection (à 2 dpf), déchorionner les embryons à l’aide de deux pinces très fines sous le stéréomicroscope (grossissement 11x). Déchirez le chorion à l’aide d’une pince sans pincer l’embryon afin de le libérer.</li>
	<li>Placez les embryons déchoionnés dans une boîte de Pétri contenant du poisson avec du bleu de méthylène. Incuber les plats à 28 °C jusqu’à l’infection.</li>
</ol>
4. Lésion de l’embryon
<ol>
	<li>Anesthésier les embryons de poisson-zèbre dans de l’eau de poisson sans bleu de méthylène, contenant 0,02 % de tricaïne, environ 5 minutes avant la blessure dans une boîte de culture cellulaire (35 mm x 10 mm). Les embryons ne bougent plus et ne répondent plus aux stimuli.</li>
	<li>Placez des aiguilles 25G sur le dessus de deux baguettes pour faciliter la manipulation des aiguilles.</li>
	<li>Au stéréomicroscope, éliminez les embryons au développement anormal ou morts. À l’aide d’un mouvement circulaire de la parabole, rassemblez tous les embryons au centre.</li>
	<li>Isolez les embryons un par un à l’aide de deux aiguilles en position verticale (tête vers le bas - queue vers le haut) et placez l’aiguille gauche au niveau de la queue pour la maintenir droite. Coupez l’aileron au bord de la notocorde avec l’aiguille droite. Faites la coupe en une seule fois. Ne pas dépasser 10 min entre la découpe et l’immersion dans la solution bactérienne.</li>
</ol>
5. Infection des embryons blessés
<ol>
	<li>Dans l’enceinte de sécurité biologique de type II, agiter et ajouter la solution de P. aeruginosa à environ 1 x 107 UFC/mL dans une plaque à 6 puits.</li>
	<li>Prélevez les embryons blessés à l’aide d’une pipette jetable en verre Pasteur et ajoutez-les à la solution bactérienne sous le poteau de sécurité microbiologique. Incuber la plaque à 28 °C pendant 1,5 h. REMARQUE : Si un grand nombre de larves infectées sont nécessaires, faites des groupes d’environ 50 larves, faites la plaie, immergez-les et répétez l’opération pour le groupe suivant.</li>
	<li>Après l’infection, lavez les embryons sous le poteau de sécurité microbiologique comme décrit ci-dessous.<ol>
		<li>Transférez les embryons à l’aide d’une pipette en verre pour les laver dans 10 ml d’eau de poisson sans bleu de méthylène, en ajoutant le moins de liquide possible, pendant 30 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Transférez à nouveau les embryons infectés à l’aide d’une pipette en verre pour un deuxième lavage dans 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène pendant quelques minutes.</li>
		<li>Transférez 24 embryons infectés individuellement dans une plaque multipuits avec 1 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placez les assiettes dans une boîte en plastique dans l’incubateur à 28 °C. Humidifiez le boîtier (avec des essuie-tout humides, par exemple) pour limiter l’évaporation.</li>
</ol>
6. Survie des embryons infectés
<ol>
	<li>Pour les études de survie embryonnaire, vérifiez la viabilité au stéréomicroscope à 18 h, 24 h et 48 h après l’infection (hpi). Un embryon est considéré comme mort lorsque le cœur et la circulation sanguine cessent.</li>
	<li>Représenter les taux de mortalité/survie à l’aide de représentations graphiques en escalier de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) et analyser les données à l’aide d’un log-rank ou d’autres tests statistiques appropriés.</li>
</ol>
7. Calcul de la charge bactérienne dans les embryons infectés (Figure 1)
<ol>
	<li>Effectuer le dosage des UFC à partir d’embryons infectés à quatre moments différents : 1,5 hpi, c’est-à-dire directement après l’infection, et après chaque lavage à 24, 48 et 72 hpi avec 5 embryons/point temporel. Effectuez toutes les étapes sous le poteau de sécurité microbiologique.</li>
	<li>Préparez pour chaque larve infectée des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 95 μL de 1x PBS. Le volume des larves est d’environ 5 μL.</li>
	<li>Transférez les larves dans une plaque à 6 puits avec 4 mL d’eau de poisson sans bleu de méthylène pour effectuer un lavage et éliminer les bactéries planctoniques.</li>
	<li>Placez chaque embryon dans un tube de microcentrifugation contenant du PBS, en ajoutant le moins de liquide possible. Il suffit de toucher la pipette en verre contenant les larves à la surface du PBS pour permettre aux larves de s’enfoncer dans le tube de la microcentrifugeuse sans ajouter de liquide.</li>
	<li>Écrasez les embryons individuellement à l’aide d’un pilon situé sur le côté du tube de microcentrifugation. Gardez le pilon à l’intérieur du tube. Déterminez le point final lorsqu’il n’y a plus d’embryon intact.</li>
	<li>Soulevez le pilon et ajoutez 100 μL de PBS-Triton 2 % pour rincer toute bactérie résiduelle du pilon (la concentration finale est de 1 %). Vortex et attendez 10 min. Ne traitez pas plus de cinq embryons en même temps.</li>
	<li>Déposez 3 fois 10 μL de lysats non dilués sur des plaques de gélose LB pour chaque embryon. Faites une dilution en série des lysats dans une plaque de 96 puits jusqu’à ce qu’une dilution de 10-3 soit atteinte à l’aide d’une pipette multicanaux. Déposez 3x, 10 μL de dilution 10-1, 10-2 et 10-3 à côté des non dilués sur des plaques de gélose LB et incubez les plaques pendant la nuit à 37 °C.</li>
	<li>Comptez les colonies fluorescentes de chaque dilution au microscope et calculez l’UFC par embryon infecté.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig1.jpg"> 
Figure 1 : Chronologie expérimentale de l’évaluation de la virulence et de la persistance bactériennes dans l’embryon de poisson-zèbre. Abréviations : UFC = Unités formant colonie, hpi = heures après l’infection. Le dessin a été réalisé avec BioRender.com. Le chiffre a été modifié au lieu de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
8. Test du traitement contre l’infection persistante (figure 2)
<ol>
	<li>Préparez des solutions antibiotiques à 40 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la souche P. aeruginosa . Avant l’expérience, vérifiez que la concentration d’antibiotique choisie n’est pas toxique pour l’embryon.</li>
	<li>Suivez les étapes 7.1 et 7.2. Placez 1 ml d’eau de poisson avec des antibiotiques dans une plaque de 24 puits et faites un contrôle sans antibiotiques.</li>
	<li>Transférez cinq embryons de l’étape de lavage par traitement dans la plaque à 24 puits, en ajoutant le moins de liquide possible.</li>
	<li>Incuber avec les antibiotiques pendant 30 min à température ambiante. Revenez à l’étape 7.3. pour quantifier la charge bactérienne après traitement.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig2.jpg"> 
Figure 2 : Procédure expérimentale utilisée pour évaluer l’efficacité des traitements antibiotiques sur des embryons infectés. Abréviations : ATB 30' = traitement antibiotique pendant 30 min, UFC = unités formant colonie, hpi = heures après l’infection. Le dessin a été réalisé avec BioRender.com. Le chiffre a été modifié au lieu de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6639">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68464">10.3791/68464</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68464">Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

<table><tbody><tr><td>Méthanesulfonate d’éthyl-3-aminobenzoate</td><td>Sigma</td><td>E50521</td><td></td></tr><tr><td>Granulé de piston</td><td>Eppendorf, Dutscher</td><td>33522</td><td></td></tr><tr><td>sels marins</td><td>Instant Ocean, Systèmes d’aquarium &nbsp ;</td><td>218035</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation de l’infection persistante à pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

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Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Ce protocole décrit un modèle d’infection d’Aspergillus dans les larves de poisson zèbre. Les spores d’Aspergillus sont microinjectées dans le cerveau postérieur des larves, et un traitement chimique est utilisé pour induire une immunosuppression. La progression de l’infection est surveillée via une configuration d’imagerie quotidienne pour surveiller la croissance fongique et les réponses immunitaires ainsi que l’énumération des spores vivantes par placage d’unités formant des colonies.

Infection des larves de poisson zèbre par des spores d’Aspergillus pour l’analyse des interactions hôte-pathogène

Découvrez un modèle d'infection persistante chez les larves de poisson-zèbre blessées pour étudier Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode reproduit la tolérance aux antibiotiques et accélère le criblage de nouveaux traitements.

Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

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