Modélisation de l’infection persistante à Pseudomonas aeruginosa chez les larves de poisson-zèbre blessées

Infection chronique causée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa sont tolérantes aux antibiotiques et très difficiles à traiter. Notre objectif est de développer un modèle in vivo qui accélérera la découverte de thérapies efficaces. Les médicaments antibactériens sont principalement testés in vitro, et tester des médicaments chez des souris infectées de manière chronique est un défi complexe. Pour combler le vide entre ces deux approches, nous proposons un modèle préclinique alternatif utilisant des larves de poisson-zèbre blessées. Notre modèle d’infection persistante chez le poisson-zèbre basé sur l’utilisation de la souche clinique de Pseudomonas aeruginosa reproduit la tolérance aux antibiotiques. Alors que la micro-injection est couramment utilisée pour infecter les larves de poisson-zèbre, notre méthode de blessure reflète un mode d’infection naturel et est bien adaptée au dépistage de composés thérapeutiques.

[Narrateur] Pour commencer, placez des aiguilles de calibre 25 sur deux baguettes pour faciliter la manipulation. À l’aide d’un stéréomicroscope, identifiez et retirez les embryons qui présentent un développement anormal ou qui ne sont pas viables. Déplacez le plat dans un mouvement circulaire pour rassembler les embryons restants au centre. Maintenant, utilisez deux aiguilles orientées verticalement pour isoler chaque embryon, en positionnant l’aiguille gauche au niveau de la queue pour garder le corps droit. Avec l’aiguille droite, faites une seule entaille au bord de la notocorde pour retirer la nageoire. Terminez chaque coupe rapidement, en veillant à ce que tous les embryons soient immergés dans une solution bactérienne dans les 10 minutes. Pour la procédure d’infection, mélangez la solution de Pseudomonas aeruginosa sous une enceinte de sécurité biologique de type deux et ajoutez-la à environ une fois 10 à la puissance sept unités formant colonies par millilitre dans une plaque à six puits. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre jetable, prélevez les embryons blessés et transférez-les dans la solution bactérienne. Incuber la plaque à six puits à 28 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Après l’incubation, récupérez les embryons infectés et placez-les sous la sécurité microbiologique pour le lavage. Maintenant, transférez les embryons avec une pipette en verre dans 10 millilitres d’eau de poisson sans bleu de méthylène, en minimisant le volume transféré et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez à nouveau les embryons à l’aide d’une pipette en verre dans quatre millilitres d’eau de poisson sans bleu de méthylène et incubez brièvement. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez les embryons infectés individuellement dans une plaque de 24 puits, en ajoutant un millilitre d’eau de poisson sans bleu de méthylène dans chaque puits. Placez la plaque à 24 puits dans un incubateur réglé à 28 degrés Celsius. Préparez des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec 95 microlitres de 1X PBS pour chaque larve infectée. Transférez les larves dans une plaque à six puits contenant quatre millilitres d’eau de poisson sans bleu de méthylène pour laver et éliminer les bactéries planctoniques. Placez chaque embryon lavé dans un tube de microcentrifugation avec du PBS, en transférant le moins de liquide possible. Maintenant, utilisez un pilon pour écraser chaque embryon contre le côté du tube de microcentrifugation, en laissant le pilon à l’intérieur du tube par la suite. Ensuite, soulevez le pilon et ajoutez 100 microlitres de 2 % de PBS Triton pour rincer les bactéries résiduelles du pilon, atteignant une concentration finale de 1 %. Vortex le tube et incuber pendant 10 minutes. Ensuite, distribuez trois gouttes de 10 microlitres de lysat non dilué de chaque embryon sur des plaques de gélose LB. À l’aide d’une pipette multicanaux, diluez en série chaque lysat dans une plaque à 96 puits jusqu’à 10 à la puissance moins trois dilution. Enfin, distribuez trois gouttes de 10 microlitres des dilutions à côté des points non dilués. Et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Les quatre isolats de Pseudomonas aeruginosa de la mucoviscidose étaient significativement moins virulents dans le modèle d’embryon lésé que dans la souche de référence PAO1. Chez les embryons infectés par deux isolats, la charge bactérienne a été nettement réduite sur trois jours, ce qui indique une élimination bactérienne. En revanche, les deux autres isolats, B6513 et RP73, ont maintenu une charge bactérienne relativement stable de 18 à 65 heures après l’infection après une chute initiale, ce qui suggère une persistance. Un traitement court de 30 minutes à la tobramycine 1,5 heure après l’infection a considérablement réduit la charge bactérienne chez les embryons infectés par les isolats B6513. La tobramycine n’a pas eu d’effet significatif sur la charge bactérienne lorsqu’elle a été administrée 24 ou 48 heures après l’infection, démontrant une résistance pendant les stades persistants de l’infection.