Mise à jour du Protocole pour l’assemblage et l’utilisation du réseau de minibioréacteurs (MBRA)

Notre recherche se concentre donc sur le microbiome intestinal, en particulier sur la façon dont il peut être modifié pour prévenir la colonisation d’agents pathogènes nocifs. En même temps, nous nous intéressons également à la compréhension des règles et des mécanismes écologiques qui sous-tendent cette résistance à la colonisation. La technologie, comme le séquençage de nouvelle génération, la bio-informatique avancée, les souris sans germes et les modèles intestinaux in vitro, transforment toutes la façon dont nous étudions les communautés microbiennes et leur rôle dans la santé et la maladie.

L’un des plus grands défis des modèles d’intestin in vitro est de les faire fonctionner à haut débit. Ce dont nous avons besoin, ce sont des systèmes qui permettent l’interrogation fonctionnelle des communautés microbiennes à grande échelle. Le réseau de minibioréacteurs est un système de culture à flux continu qui a été conçu pour remédier au manque de capacité de débit dans d’autres systèmes.

Cela nous permet d’étendre les expériences tout en capturant le comportement complexe et reproductible des communautés microbiennes. Pour commencer, assurez-vous que les bandes de réseau de minibioréacteurs sont imprimées en 3D et contiennent six chambres de bioréacteur indépendantes. Disposez tous les composants nécessaires à l’assemblage.

À l’aide d’un taraud à fraction NF de 1/4 de pouce 28 avec une clé à tarauder à poignée en T. Vissez les trois ports de 1/4 de pouce dans chaque chambre pour insérer les raccords. Après avoir lavé la chambre à l’eau, placez une barre d’agitation magnétique de 10 x 3 millimètres dans chaque chambre et ajoutez un millilitre d’eau distillée.

Placez ensuite une rondelle en caoutchouc sur chaque orifice du bioréacteur. Pour chaque chambre, vissez un leurre mâle fileté en paille de média, un leurre mâle fileté en paille de rebut et un leurre mâle fileté vide dans les ports. Insérez maintenant six septums en caoutchouc sur des barbes de leurre femelle de 3/32 de pouce et repliez le manchon supérieur de chaque septum vers le bas pour couvrir le cou.

Fixez-les aux ports désignés de chaque chambre. Coupez des bandes de tube C-flex de la longueur et du nombre souhaités. Fixez un leurre femelle ardillonnée de 1/8 de pouce à une extrémité et un connecteur de verrouillage de leurre mâle à l’extrémité opposée de chaque longueur de tube.

Insérez ensuite une barbe de leurre femelle de 1/16 de pouce à chaque extrémité du tube rouge à deux arrêts E-lab d’un diamètre intérieur de 1,14 millimètre et du tube orange à deux arrêts E-lab d’un diamètre intérieur de 0,89 millimètre. Connectez le tube E-lab préparé au tube C-flex et assurez-vous que chacune des six longueurs de tube C-flex est reliée à une ligne E-lab rouge et à une ligne E-lab orange via des leurres femelles. Ensuite, coupez le tube C-flex à différentes longueurs selon les besoins.

Fixez une canne de leurre femelle de 1/8 de pouce et un connecteur de verrouillage de leurre mâle aux deux extrémités d’un morceau de 3 pouces et du morceau de 12 pouces de tube C-flex. Fixez les connecteurs de verrouillage du leurre mâle aux deux extrémités des pièces restantes. Assemblez l’arbre de ligne de déchets selon le schéma 3D.

Fixez les extrémités exposées du tube rouge à deux arrêts E-lab aux verrous de leurre mâle terminaux sur l’arbre de la ligne de déchets dans l’ordre croissant en fonction de la longueur du tube C-flex. Connectez ensuite le tube C-flex de 3 pouces avec l’ardillon de leurre femelle de 1/8 de pouce et le connecteur de verrouillage de leurre mâle au sommet de l’arbre de la ligne de déchets. Assemblez l’arbre de la ligne d’alimentation selon le schéma 3D.

Reliez les extrémités exposées du tube orange à deux arrêts E-lab aux verrous de leurre mâle terminaux sur l’arbre de la ligne d’alimentation dans l’ordre croissant en fonction de la longueur du tube C-flex, et fixez le tube C-flex de 12 pouces au sommet de l’arbre de la ligne d’alimentation. Fixez le tube C-flex de longueur variable à l’extrémité de l’arbre de la conduite d’alimentation au bioréacteur, en les disposant par ordre croissant de la ligne la plus courte à gauche à la plus longue à droite. Fixez le tube C-flex de longueur variable à l’extrémité de l’arbre de conduite de déchets à la bande du bioréacteur par ordre décroissant, la ligne la plus longue à gauche et la plus courte à droite pour permettre le placement de la pompe.

Regroupez toutes les lignes d’alimentation C-flex sur le côté gauche de la bande et fixez-les à l’aide d’un lien torsadé. Formez une boucle avec le tube E-lab orange à deux arrêts entre les conduites C-flex et fixez la boucle à l’aide de ruban adhésif autoclave, puis répétez le processus pour le tube E-lab rouge à deux arrêts du côté des déchets de la bande du bioréacteur. Couvrez le leurre femelle à l’extrémité des déchets et nourrissez les arbres avec du papier d’aluminium pour éviter toute contamination.

Desserrez les leurres filetés mâles avec des septa sur chaque chambre du bioréacteur pour permettre à la vapeur de s’échapper pendant l’autoclavage. Après avoir placé l’ensemble dans un bac d’autoclave, étirez les arbres des conduites d’alimentation et de déchets dans des bacs séparés adjacents à celui contenant les bandes MBRA. Pour fixer le système aux pompes, retirez le ruban adhésif de l’autoclave fixant le tube E-lab pour les conduites de déchets et d’alimentation, et détachez les faisceaux de tubes C-flex.

Placez le MBRA entre les deux pompes sur le dessus de la plaque d’agitation. Fixez-le à l’aide des supports imprimés en 3D et alignez-le avec les positions d’agitation marquées sur la plaque. Fixez maintenant la tubulure E-lab de la conduite d’alimentation aux cartouches de la pompe péristaltique et positionnez les butées de tubulure dans les fentes de la cartouche.

Répétez le processus pour le tube E-lab de la conduite de déchets sur la pompe située à droite de la plaque d’agitation. Verrouillez ensuite les cartouches de la pompe péristaltique dans la pompe. Disposez soigneusement le tube C-flex à l’aide des supports de tube imprimés en 3D.

Connectez l’extrémité de l’arbre de conduite de déchets au tube connecté aux bouteilles de déchets. Ensuite, fixez le leurre femelle sur le tube d’entrée de la conduite d’alimentation au connecteur mâle sur le tube de 12 pouces du bouchon de la bouteille de milieu. Allumez les deux pompes pour démarrer l’écoulement du fluide et assurez-vous que les deux pompes sont réglées sur la rotation dans le sens des aiguilles d’une montre lorsque les déchets sont positionnés à droite des pompes.

Observez la taille et la cadence des gouttelettes dans chaque chambre de bioréacteur. Si une variabilité ou une anomalie est remarquée, remplacez la tubulure orange à deux arrêts E-lab connectée à la chambre concernée pour réduire la variation de débit. Une fois que les chambres sont pleines, arrêtez les deux pompes et laissez les bioréacteurs reposer pendant 24 à 48 heures pour vérifier la contamination avant de commencer l’expérience.

Basculez l’entrée du fluide dans un récipient d’un litre d’eau de Javel à 10 % dans de l’eau déminéralisée et augmentez le débit sur les deux pompes au maximum pour déplacer le contenu des chambres du bioréacteur avec de l’eau de Javel. Une fois que les chambres sont débarrassées du média, retournez le MBRA pour désinfecter au-dessus de la ligne de remplissage pendant cinq minutes. Après cinq minutes, redressez le système et attendez cinq minutes supplémentaires pour la stérilisation.

Une fois que les chambres ont été débarrassées des médias et stérilisées pendant 10 minutes, remplacez l’eau de Javel par un litre d’eau déminéralisée et rincez le système jusqu’à ce que l’eau soit passée. Débranchez ensuite le tube E-lab du bioréacteur des pompes et retirez les MBRA. Retirez les septa usagés du bioréacteur et vidangez chaque chambre jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un millilitre d’eau.

Remplacez le septa, la tubulure orange à deux arrêts E-lab et autoclavez la bandelette entièrement assemblée comme démontré précédemment. Après trois cycles de réutilisation, procédez comme suit. Un échantillon de matières fécales humaines a été préparé et cultivé dans le système MBRA.

Après quatre jours d’écoulement continu, la communauté microbienne dans les neuf bioréacteurs était dominée par 18 genres bactériens, chacun représentant au moins 2 % de l’abondance relative dans n’importe quelle répétition. 22 des 65 genres détectés étaient présents dans les neuf répétitions de bioréacteurs, démontrant une grande reproductibilité. L’analyse de la diversité alpha a montré une variation minime entre les répétitions dans les unités taxonomiques opérationnelles observées et l’indice de diversité de Shannon.