Quantification de l’absorption des acides gras endothéliales à l’aide d’analogues d’acides gras fluorescents

Les nutriments transmis dans le sang, comme les acides gras, doivent traverser une barrière endothéliale capillaire pour pénétrer dans le tissu métabolique par un mécanisme mal compris. La clarification de ces processus pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2. Nous avons donc constaté que le scalpel musculaire et le tissu adipeux régulent tous deux l’absorption et le transport des lipides endothéliaux grâce à des métabolites paracrines, partiellement contrôlés par le système endocrinien.

Et nous avons également constaté que l’ATP mitochondrial contribue de manière inattendue à l’absorption de la graisse endothéliale malgré leur dépendance connue à l’ATP glycolytique. En utilisant le test décrit dans ce protocole, nous prévoyons d’approfondir les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’absorption et au transport des acides gras endothéliaux, y compris la manière dont ils pourraient être régulés par d’autres tissus. Pour commencer, préparez une solution de gélatine à 0,1 % en ajoutant 25 millilitres de bouillon de gélatine à 2 % à 475 millilitres de PBS.

Mélangez soigneusement la solution de gélatine et stérilisez-la par filtre à l’aide d’un filtre à vide ou d’autoclave de 0,2 micromètre. À l’aide d’une pipette, ajoutez 100 microlitres de la solution de gélatine à 0,1 % dans chaque puits d’une plaque noire transparente à fond de 96 puits. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes ou toute la nuit.

Après l’incubation, retirez la solution de gélatine supplémentaire de la plaque pré-revêtue à 96 puits. Lavez l’assiette avec du PBS une fois. Ensuite, pipettez 100 microlitres de la cellule en suspension dans chaque puits en utilisant une densité d’ensemencement permettant aux cellules d’atteindre la confluence le lendemain.

Préparez 20 solutions millimolaires de 3-hydroxyisobutyrate et lactate comme témoins positifs. Pour le contrôle négatif, utilisez une micromolaire niclosamide. Ensuite, pipettez les solutions dans une plaque séparée de 96 puits.

Lavez les cellules endothéliales une fois avec du PBS divalent pré-chauffé, en pipettant à un angle prononcé pour éviter de perturber les cellules plaquées. Ajoutez 50 microlitres par puits du réactif de traitement approprié et faites couver la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 ou 60 minutes. Pour préparer le complexe d’acides gras BSA de BOBPY, mélangez une solution d’acides gras BODIPY de 2 micromolaires avec 1 BSA sans acides gras micromolaires dans du PBS.

Faites couver le mélange à température ambiante dans le noir pendant 10 minutes avant utilisation. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du complexe d’acide gras BSA préparé BODIPY à chaque bien traité et faites couver la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Préparez une solution d’un micromolaire de BSA sans acides gras dans du PBS comme tampon de lavage et préchauffez-la à 37 degrés Celsius.

Retirez le complexe d’acide gras BSA BODIPY des puits et lavez toute la plaque deux fois avec 50 microlitres de tampon de lavage préchauffé, en effectuant chaque lavage pendant 1,5 minute. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de bleu de trippan à 0,08 % dans chaque puits pour atténuer la fluorescence extracellulaire. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez immédiatement la fluorescence intracellulaire.

Après avoir retiré la solution bleue de trypan des puits, lavez doucement les cellules avec du PBS. Ajoutez 4 microgrammes par millilitre de colorant Hoechst dilué dans un milieu à 10 % dans chaque puits. Faites couver la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez l’assiette une fois avec du PBS pour enlever l’excès de colorant. Ensuite, ajoutez un PBS neuf à chaque puits et mesurez la fluorescence Hoechst à l’aide d’un lecteur de microplaques. Chez les cellules HUVEC et EA.hy926, le signal intracellulaire de BODIPY-C12 a augmenté significativement avec des concentrations plus élevées d’acides gras BODIPY à une minute, cinq minutes et dix minutes d’incubation.

Le traitement au lactate pendant une heure a augmenté l’absorption de BODIPY-C12 de manière doso-dépendante à 5 millimolaires et 20 millimolaires. Le traitement avec 3-hydroxyisobutyrate a également considérablement augmenté l’absorption de BODIPY-C12 de manière dépendant de la dose, la captation la plus élevée observée étant de 20 millimolaires. Le traitement avec une micromolaire niclosamide pendant 30 minutes a conduit à une réduction significative de l’absorption de BODIPY-C12 par rapport au contrôle non traité par DMSO.

Après une incubation de cinq minutes avec BODIPY-C16 dans HUVEC, le traitement au lactate à 10 millimolaires et 20 millimolaires a significativement augmenté l’absorption de manière dépendant de la dose. Le traitement avec une micromolaire niclosamide a significativement réduit l’absorption de BODIPY-C16 par rapport au groupe témoin non traité de la DMSO.