Purification efficace des polypeptides de type élastine (ELP) à partir d’E. coli en utilisant une méthode d’extraction et de précipitation à base de solvant organique

L’étendue de cette recherche s’interroge sur la capacité de la précipitation par extraction de solvant à purifier rapidement les protéines de fusion ELP tout en conservant la fonction d’activité de fusion. Les développements récents incluent une purification rapide de l’ELP à base de solvant avec un meilleur contrôle des endotoxines, permettant des nanoparticules auto-assemblantes actives pour une livraison ciblée d’acides nucléiques. Pour commencer, pesez un gramme de la granule de cellules d’E. coli.

Ajoutez quatre millilitres de tampon de lyse fraîchement préparé pour resuspendre la granule cellulaire. Vortex doucement jusqu’à ce que la pellete soit complètement dispersée et mélangée au tampon. Ajoutez environ cinq milligrammes de lysozyme aux cellules en suspension pour faciliter la digestion de la paroi cellulaire.

Ensuite, placez le tube sur la glace et faites couver pendant une heure. Après l’incubation, sonicez l’échantillon à l’aide d’un sonateur à micro-pointe à intervalles de cinq secondes. Gardez l’échantillon sur la glace et poursuivez la sonication jusqu’à obtenir un lysat uniforme, sans particules visibles, généralement pendant cinq à huit minutes.

Centrifugez le lysat sonicé à 10 000 G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius pour clarifier. Ensuite, séparez soigneusement le surnageant contenant la fraction soluble du pellet contenant la fraction insoluble. On extrait 10 à 20 microlitres du surnageant et on réinjecte une masse équivalente du pellet dans un tampon de lyse.

Mélangez les deux fractions avec 4x tampon de Laemmli jusqu’à une concentration finale de 1x. Ensuite, chauffez la suspension à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Si l’ELP est principalement soluble, procéder à l’extraction par solvant organique à l’aide du surnageant clarifié.

Pour effectuer l’extraction au solvant, ajoutez quatre millilitres de solvant organique ou mélange de solvant à la granule ou au surnageant séché à l’air. Pour les mélanges de solvants binaires, utilisez des rapports volumétriques exacts, comme deux millilitres de chaque pour une combinaison un-à-un. Faites vibrer vigoureusement la suspension pendant une minute pour assurer une bonne pénétration du solvant dans la pastille.

Maintenant, incubez le mélange à 20 degrés Celsius pendant cinq minutes pour permettre l’agrégation des protéines extracellulaires et la solubilisation de l’ELP en phase organique. Centrifugez l’échantillon à 13 000 G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius pour séparer les protéines solubilisées des débris insolubles. Collectez soigneusement le surnageant sans déranger la pellete car elle contient l’ELP solubilisé.

Mesurez précisément le volume du surnageant collecté pour vous préparer aux précipitations. Ensuite, ajoutez de l’acétone ou de l’acétonitrile au surnageant à 2,33 fois son volume pour la précipitation des protéines. Incubez le mélange à 20 degrés Celsius pendant cinq à sept minutes.

Centrifugez l’échantillon à 10 000 G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et laissez sécher le pellet à l’air libre soit sous un jet doux d’azote pendant 10 à 15 minutes, soit en plaçant des tubes de centrifugeuse non bouchés à l’envers sur des lingettes sans peluches dans une hotte pendant une heure à 20 degrés Celsius. Resuspendez la pellete de protéines séchées dans 50 microlitres de PBS.

Ensuite, on fait doucement pipiser de haut en bas pour assurer une dissolution complète. Conservez la protéine en suspension à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation à court et moyen terme. Pour effectuer la validation à l’aide de SDS-PAGE, mélangez d’abord la protéine purifiée avec un tampon de chargement SDS-PAGE 4x.

Vortex brièvement la solution pour homogénéité. Chargez l’échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 % pour que l’ELP et le TEEN soient fusionnés pour chorismer la mutase. Faites fonctionner le gel à 100 à 120 volts jusqu’à ce que la plongée de suivi atteigne le fond.

Maintenant, colorez le gel avec une teinture InstantBlue Coomassie ou une alternative adaptée pendant deux heures à 20 degrés Celsius. Rincez avec de l’eau déionisée jusqu’à obtenir un fond clair. Une bande ELP et TEEN proéminente fusionnant pour chorismer mutase est apparue à 100 kilodaltons après une étape de lyse avant l’extraction organique.

Différentes combinaisons de solvants organiques ont entraîné des efficacités d’extraction variées et des purités d’ELP et TEEN fusionnés pour chorismer la mutase. Les mélanges un-à-un AG et BG ont permis de récupérer les protéines la plus élevée. L’ELP et le TEEN extraits par solvant AG fusionnés pour chorismer la mutase conservaient environ 80 % de son activité enzymatique comparée à la protéine purifiée par ITC, tandis que la glycémie conservait environ 50 % d’activité, et le témoin V40 n’a montré presque aucune activité.

Parmi les résultats significatifs figurent la démonstration que la précipitation par solvant organique purifie rapidement les fusions ELP avec une faible teneur en endotoxine tout en préservant l’activité des protéines de fusion. Ce protocole répond au manque de méthodes rapides sans détergent pour purifier les fusions ELP d’E.Coli avec ou sans corps d’inclusion sans ITC en plusieurs étapes. Ce protocole offre une purification rapide en une seule étape directement à partir de pellets d’E. coli, permettant des fusions ELP très pures et pauvres en endotoxines tout en préservant la fonction des protéines de fusion.