הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS
2 ביולי 2009
Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.
בפרוטוקול וידאו זה, תוכלו לראות כיצד לנתק רקמת ריאה של עכבר בוגר באמצעות מקסימום עדין לאחר דיסוציאציה של רקמת הריאה. בנוכחות קולגנאז, d ו-DNAS, תרחיפי תא אחד מסוננים באמצעות צנטריפוגת מסננת תאים של 70 מיקרון, ומושעה ליישומים נוספים. היי, אני מלאני מלו מ-Mil Biotech בגרמניה.
היום אראה לכם הליך אוטומטי וניתן לשחזור להכנת תרחיף תא בודד מרקמת ריאה של עכבר באמצעות דיסוציאציה של GenX. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו להכנת תרחיפי תאים בודדים להכנת לויקוציטים או תאי אנדותל. אוקיי, בואו נתחיל.
לפני שנתחיל בפרוטוקול, יש להכין כמה פתרונות סטנדרטיים ולהיות מוכנים. ראשית, נצטרך את מאגר הבס. שנית, תמיסת קולגנאז D המכילה 100 מיליגרם לאנזים מיליליטר ובופר hebes.
שלישית, תמיסה אחת המכילה 20,000 יחידות למיליליטר דאס אחד. לבסוף, שני פתרונות חציצה נפוצים. מאגר PBS טיפוסי ב-pH 7.2 ומאגר PEB שמקורו בתמיסת שטיפה AutoMax ותמיסת מלאי BSA.
אנו מתחילים את הפרוטוקול שלנו עם ריאה מנותחת שמקורה בעכבר ביופסיה נקבה בת שישה עד שבעה שבועות. ודא שהריאה נקייה מאיברים סמוכים כמו הלב והתימוס, כלי דם זורמים ונכנסים, קנה הנשימה ורקמות חיבור. שטפו את הטישו בצלחת פטרי המכילה PBS להסרת אריתרוציטים.
בדרך כלל, ריאה של עכבר בגיל זה שוקלת בין 110 ל-150 מיליגרם. אם אתם מתכננים לשייך ריאות מבעלי חיים מבוגרים או מזני עכברים אחרים, שקלו את הרקמה והחיצוץ. ניתן לנתק רקמה של 450 מיליגרם לכל היותר לכל שפופרת אחת.
העבירו את רקמת הריאה לצינור מקסימום C עדין עמוס ב-4.9 מיליליטר של מאגר הייס. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז D לריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר לרקמת הריאה ולחוצץ. עכשיו 10 מיקרוליטר דאס.
פתרון אחד ליותר מ -150 מיליגרם רקמה. הוסף 20 מיקרוליטר תמיסה אחת. ודא שצינור ה-C סגור היטב והנח אותו הפוך על הדיס המקסימלי העדין.
ודא שהרקמה ממוקמת בין הרוטור לסטטור. בחר את תוכנית הריאות והפעל אותה על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה בסיום התוכנית. הסר את צינור C מהמכשיר ודגר את הדגימה למשך 30 דקות.
בחממה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הדגירה, יש לסובב את הצינור באמצעות מסובב צינור התערובת המקסימלי או לסובב ידנית כל חמש דקות. לאחר הדגירה, החזר את צינור C לאסוציאטור המקסימלי העדין והפעל את תוכנית הריאות השנייה בזמן שהתוכנית פועלת, הכן צינור של 50 מיליליטר לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת המכסה במסננת תאי רשת של 70 מיקרומטר. לאחר סיום התוכנית המנותקת, בהתאם להתפלגות חומר הדגימה בצינור, ייתכן שתרצה לצנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לרכז את חומר הדגימה.
ניתן להסיר את התאים המנותקים מהצינור על ידי פיפטינג דרך המכסה האטום של צינור C. בעזרת קצה פיפטה מתאים של 1000 מיקרוליטר, מורחים את מתלה התאים על מסננת התא כדי להסיר חלקיקים או אגרגטים גדולים יותר. לאחר שהתמיסה התרוקנה, שטפו את מסננת התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר נוספים של טמפרטורת החדר וחצץ היס כדי לגלול את התאים המסוננים.
צנטריפוגה את צינור ה-50 מיליליטר ב-300 GS למשך 10 דקות. כעת שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורית התא בנפח הרצוי של טמפרטורת החדר. מאגר PEB.
אל תשפוך את הסופרנטנט. כעת תוכל להמשיך ליישום שלך במורד הזרם. דיסוציאציה של רקמת ריאה של עכבר באמצעות הליך זה תניב אחוז גבוה של לויקוציטים ותאי אנדותל ברי קיימא.
תרחיפי התאים הבודדים הנגזרים נצבעו ב-CD 45 PE כ-CD 1 46 FITC, או CD 31 FITC, ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. תרשים זה מראה את העשרת התאים הדנדריטים באמצעות מיקרו-חרוזי CD 11 C, מפריד מינימקס ושתי עמודות MS. בסדר. זה עתה הראיתי לך כיצד להכין תרחיפי תאים בודדים מרקמת ריאה של עכבר בצורה סטנדרטית על ידי שימוש בתערובת העדינה של דיסוציאציה וצינורות C.
שיטה זו מאפשרת דיסוציאציה יעילה של רקמות ג'ן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנתח כראוי את הריאה ולעבד את הרקמה מיד לאחר הדיסקציה. לאחר מכן ניתן להשתמש בתרחיפי התא הבודד המוכנים לניסויים נוספים.
לדוגמא, תיוג מגנטי של התאים, ואז הפרדת לויקוציטים או תאי אנדותל. אוקיי, זהו זה. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מדגים את דיסוציאציית רקמת ריאה מעכבר בוגר באמצעות ה-gentleMACS dissociator. הפרוצדורה נועדה להפיק כמות גדולה של תאים חיוניים הניתנים לתרבית עבור יישומים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- טכניקות לפירוק תאים
- הכנת תרחיף של תאים בודדים
- ניתוח רקמת ריאה של עכבר
רקע
- ניתוק תאים מרקמות דורש פרמטרים ספציפיים.
- מנתק התאים gentleMACS מספק פרוטוקול מותאם.
- Collagenase D ו-DNase משמשים בתהליך הניתוק.
- תרחיפי תאים מסוננים מוכנים ליישומים נוספים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה הניתנת לשחזור להכנת תרחיפי תאים בודדים.
- להקל על חקר לויקוציטים ותאי אנדותל.
- לספק פרוטוקול מעשי לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש ב-gentleMACS dissociator לערבוב רקמות.
- החלת collagenase D ו-DNase במהלך הדיסוציאציה.
- סינון של תרחיפי תאים דרך מסננת תאים של 70 micron.
- סנטריפוגציה והשעיה של תאים ליישומים נוספים.
תוצאות עיקריות
- דיסוציאציה מוצלחת של רקמת ריאה מעכבר לתלייה של תאים בודדים.
- השגה של נפח גבוה של תאים חיים הניתנים לתרבית.
- הפרוטוקול הדגים הדירות ויעילות.
- הכנה המתאימה ליישומים המשכיים.
מסקנות
- מכשיר ה-gentleMACS dissociator יעיל לפירוק רקמת ריאה.
- ניתן להחיל שיטה זו על סוגי רקמות שונים.
- מספק כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים רקמת ריאה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פירוק רקמה סטנדרטי הוא שלב מקדימ וקריטי במחקר בתחומי האימונולוגיה והביולוגיה הווסקולרית, המאפשר הכנה הדירה של תרחיפי תאים ראשוניים לצורך ניתוחים המשכיים. ה-gentleMACS Dissociator מספק שיטה אוטומטית, עדינה וניתנת להרחבה ליצירת תרחיפי תאים בודדים עם חיוניות גבוהה מרקמת ריאה של עכבר, ובכך תומך בקבלת קלט עקבי עבור ציטומטריית זרימה, מיון תאים ופרופיל מולקולרי. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי תיקוף של מטרות על ידי הפחתת השונות בתנובת התאים ובחיוניותם בין ניסויים שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של אוכלוסיות לוקוציטים ותאי אנדותל ברקמת ריאה לצורך בדיקת השערות מטרות.
- ערך תפעולי: מפחית שונות ידנית בעיבוד רקמות, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות ונקודות זמן שונות.
- ערך חיזוי: תומך בקלט תאי עקבי עבור ציטומטריית זרימה ומיון תאים, ובכך מגביר את הביטחון בתוצאות סריקת פנוטיפים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תרחיפים מסוננים ללא שאריות, המתאימים לצביעה בנוגדנים ולבדיקות מבוססות זרימה.
- ערך תפעולי: עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית סטנדרטיים מבטיחים עקביות בתשואת התאים בין סדרות שונות.
- מוכנות לבדיקה: מייצר תרחיפים התואמים ליישומים המשכיים כגון סימון מגנטי והפרדת תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר דינמיקה של תאי חיסון ותאי כלי דם ברקמת ריאה.
- תמיכה במודל פרה-קליני: מאפשר בידוד של תאים ראשוניים מריאות עכברים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות.
- קידום מותאם סיכונים: הכנת תאים אמינה תומכת בניתוח עקבי של סמנים ביולוגים ובתיקוף תפקודי בתהליכי עבודה פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מכשיר ה-gentleMACS Dissociator משתלב בזרימת העבודה של הגילוי כשלב סטנדרטי להכנת דגימות בין איסוף הרקמה לניתוח התאי, ומאפשר מעבר אמין מרקמה ex vivo לתאים בודדים המוכנים לבדיקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבידוד מונחה-השערה של תאי מערכת החיסון ותאי סטרומה השוכנים בריאה לצורך ניתוח מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספק תרחיפי תאים הניתנים לשחזור עבור סריקה פנוטיפית של מודולטורים חיסוניים המבוססת על תוכן גבוה או על זרימה.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות כמותיות של ציטומטריית זרימה (למשל, +CD45, +CD31) לצורך השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין מודלים של ריאות עכברים למחקרים של תאי מערכת החיסון ותאים אנדותלייליים רלוונטיים לבני אדם באמצעות הכנה סטנדרטית.
- שימוש חוזר בארגון: הפרוטוקול המתוכנן מראש של המכשיר עבור ריאות מאפשר שימוש חוזר בפרויקטים החוקרים דלקת ריאתית, פיברוזיס או זיהום.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: חיוניות וטוהר גבוהים של לוקוציטים ותאי אנדותל משפרים את איכות הנתונים ביישומים המשכיים.
- ערך תפעולי: אוטומציה מפחיתה את זמן העבודה הידנית ואת השונות התלויה במשתמש בתהליך הדיסוציאציה של הרקמה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על בסיס מדדי חיוניות ותנובה תאית עקביים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומכת בתעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי אספקת תאי מקור ראשוניים אמינים לצורך ולידציה.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בדיסקציה אספטית של רקמות וטיפול אנזימטי.
- תלוי בגישה למכשיר gentleMACS Dissociator עם תוכנית ייעודית לריאה ומבחנות C.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוזי האנזימים (Collagenase D, DNase) ותנאי הבאפר בין המשתמשים השונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים, גילאים או מודלים של מחלות המשפיעים על צפיפות הרקמה.
- מוגבל לרקמות התואמות לדיסוציאציה אנזימטית; ייתכן שיידרשו חלופות מכניות עבור דגימות סיביות או מסוידות.
