הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

בפרוטוקול וידאו זה, תוכלו לראות כיצד לנתק רקמת ריאה של עכבר בוגר באמצעות מקסימום עדין לאחר דיסוציאציה של רקמת הריאה. בנוכחות קולגנאז, d ו-DNAS, תרחיפי תא אחד מסוננים באמצעות צנטריפוגת מסננת תאים של 70 מיקרון, ומושעה ליישומים נוספים. היי, אני מלאני מלו מ-Mil Biotech בגרמניה.

היום אראה לכם הליך אוטומטי וניתן לשחזור להכנת תרחיף תא בודד מרקמת ריאה של עכבר באמצעות דיסוציאציה של GenX. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו להכנת תרחיפי תאים בודדים להכנת לויקוציטים או תאי אנדותל. אוקיי, בואו נתחיל.

לפני שנתחיל בפרוטוקול, יש להכין כמה פתרונות סטנדרטיים ולהיות מוכנים. ראשית, נצטרך את מאגר הבס. שנית, תמיסת קולגנאז D המכילה 100 מיליגרם לאנזים מיליליטר ובופר hebes.

שלישית, תמיסה אחת המכילה 20,000 יחידות למיליליטר דאס אחד. לבסוף, שני פתרונות חציצה נפוצים. מאגר PBS טיפוסי ב-pH 7.2 ומאגר PEB שמקורו בתמיסת שטיפה AutoMax ותמיסת מלאי BSA.

אנו מתחילים את הפרוטוקול שלנו עם ריאה מנותחת שמקורה בעכבר ביופסיה נקבה בת שישה עד שבעה שבועות. ודא שהריאה נקייה מאיברים סמוכים כמו הלב והתימוס, כלי דם זורמים ונכנסים, קנה הנשימה ורקמות חיבור. שטפו את הטישו בצלחת פטרי המכילה PBS להסרת אריתרוציטים.

בדרך כלל, ריאה של עכבר בגיל זה שוקלת בין 110 ל-150 מיליגרם. אם אתם מתכננים לשייך ריאות מבעלי חיים מבוגרים או מזני עכברים אחרים, שקלו את הרקמה והחיצוץ. ניתן לנתק רקמה של 450 מיליגרם לכל היותר לכל שפופרת אחת.

העבירו את רקמת הריאה לצינור מקסימום C עדין עמוס ב-4.9 מיליליטר של מאגר הייס. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז D לריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר לרקמת הריאה ולחוצץ. עכשיו 10 מיקרוליטר דאס.

פתרון אחד ליותר מ -150 מיליגרם רקמה. הוסף 20 מיקרוליטר תמיסה אחת. ודא שצינור ה-C סגור היטב והנח אותו הפוך על הדיס המקסימלי העדין.

ודא שהרקמה ממוקמת בין הרוטור לסטטור. בחר את תוכנית הריאות והפעל אותה על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה בסיום התוכנית. הסר את צינור C מהמכשיר ודגר את הדגימה למשך 30 דקות.

בחממה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הדגירה, יש לסובב את הצינור באמצעות מסובב צינור התערובת המקסימלי או לסובב ידנית כל חמש דקות. לאחר הדגירה, החזר את צינור C לאסוציאטור המקסימלי העדין והפעל את תוכנית הריאות השנייה בזמן שהתוכנית פועלת, הכן צינור של 50 מיליליטר לאיסוף תאים מסוננים על ידי החלפת המכסה במסננת תאי רשת של 70 מיקרומטר. לאחר סיום התוכנית המנותקת, בהתאם להתפלגות חומר הדגימה בצינור, ייתכן שתרצה לצנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לרכז את חומר הדגימה.

ניתן להסיר את התאים המנותקים מהצינור על ידי פיפטינג דרך המכסה האטום של צינור C. בעזרת קצה פיפטה מתאים של 1000 מיקרוליטר, מורחים את מתלה התאים על מסננת התא כדי להסיר חלקיקים או אגרגטים גדולים יותר. לאחר שהתמיסה התרוקנה, שטפו את מסננת התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר נוספים של טמפרטורת החדר וחצץ היס כדי לגלול את התאים המסוננים.

צנטריפוגה את צינור ה-50 מיליליטר ב-300 GS למשך 10 דקות. כעת שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורית התא בנפח הרצוי של טמפרטורת החדר. מאגר PEB.

אל תשפוך את הסופרנטנט. כעת תוכל להמשיך ליישום שלך במורד הזרם. דיסוציאציה של רקמת ריאה של עכבר באמצעות הליך זה תניב אחוז גבוה של לויקוציטים ותאי אנדותל ברי קיימא.

תרחיפי התאים הבודדים הנגזרים נצבעו ב-CD 45 PE כ-CD 1 46 FITC, או CD 31 FITC, ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. תרשים זה מראה את העשרת התאים הדנדריטים באמצעות מיקרו-חרוזי CD 11 C, מפריד מינימקס ושתי עמודות MS. בסדר. זה עתה הראיתי לך כיצד להכין תרחיפי תאים בודדים מרקמת ריאה של עכבר בצורה סטנדרטית על ידי שימוש בתערובת העדינה של דיסוציאציה וצינורות C.

שיטה זו מאפשרת דיסוציאציה יעילה של רקמות ג'ן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנתח כראוי את הריאה ולעבד את הרקמה מיד לאחר הדיסקציה. לאחר מכן ניתן להשתמש בתרחיפי התא הבודד המוכנים לניסויים נוספים.

לדוגמא, תיוג מגנטי של התאים, ואז הפרדת לויקוציטים או תאי אנדותל. אוקיי, זהו זה. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.