הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם
December 11th, 2009
Neurexins ו neuroligins הם קרום תא עצב הידבקות חלבונים אשר מבצעים תפקידים חיוניים בידול הילוכים הסינפטי ו. Neuroligin מוטנטים לקוי של ג elegans פגומים באיתור כוח אוסמוטי, אך כאשר הם גם מכילים מוטציה בגן המקודד neurexin, הם לשחזר את הפנוטיפ סוג בר.
שלום, שמי מנואל רואיז רוביו כאן במחלקה לגנטיקה של אוניברסיטת קורדובה בספרד. אנו משתמשים באלגנטיות ככלי ניסיוני בחקר האוטיזם, ניצול העולם המאפיין את מערכת העצבים של שלוש אלגנטיות. אנו חוקרים מוטציה של הנמטודה, יעילה בגנים המעורבים בסינפסה עצבית ואשר קשורה לאוטיזם.
Rein Regans הן מולקולות הידבקות ממברנה הקיימות בסינפטי. ראש C אלגנטי מכיל את ה-amfi, איבר חישה של הנמטודה עם תגובות מתווכות לגירויים שונים כולל חוזק אוסמוטי. Amfi עשוי מ-12 נוירונים ביפו חושיים עם גובה קשור ופעולה טרמינלית אחת של INAP.
שניים מהנוירונים הללו, שם A SH, ימין ושמאל, חשובים במיוחד בתפקוד החושי האוסמוטי. זיהוי איזון מחדש מסיס במים עם חוזק אוסמוטי גבוה. היי, יין נהר נאן עם שיטת שמיים למדידת הימנעות אוסמוטית במוטציות פגמים בסינפסה של האנס.
כדי להעריך את ההשלכות של הימנעות מחוזק אוסמוטי נוירולוגי ונוירולוגי גבוה, דיווחנו על התגובה השונה של C כנגד מוטציות פגומות בגנים נוירו-עצביים באמצעות שיטה המבוססת על תמיסת פרוקטוז ארבע טוחנות. צלצל ביום האמירה, הכין תמיסת מלאי ארבע טוחנות של פרוקטוז עם 1% קונגו אדום ומתמוסס לחלוטין בטמפרטורת החדר. טבעת טבעתית בקוטר של סנטימטר אחד על צלחת NGM היא תת-קו במרכז המדיום המוצק.
שימוש ב -15 מיקרוליטר מתמיסת הפרוקטוז האדומה ארבע טוחנות. תן לפרוקטוז להיספג בדונם כחמש דקות, הניסוי צריך להתבצע בצורה עיוורת. הצלחת עם כל זן צריכה להיות S 8 צריכה להיות מסומנת על ידי נסיין שני.
ה-SA מבוצע באמצעות סימנים אלה שהם לא נשאלים. כאשר הניסוי הסתיים כ-24 שעות לפני ביצוע המכירה, יש צורך לקטוף L ארבעה זחלים מכל גנוטיפ ולהעביר אותם לצלחת AFL NGM המכילה חיידקי אי קולי ולשמור עליה ב-20 מעלות צלזיוס למחרת. יש להתחיל את הניסוי עם מבוגרים צעירים.
שים תולעת בודדת מכל זן בתוך מעגל המנוחה ועקוב אחר כל בעל חיים לתזמון התגובה שלו למחסום הטיקים. 10 בעלי חיים מכל זן ומינימום שלושה ניסויי העתק צריכים לבצע כדי לקבל תוצאה חד משמעית. אלה שנמנעים מהטבעת האדומה שש פעמים ברציפות מסווגים כנורמליים.
אלה שיוצאים מהטבעת בפחות משישה ניסיונות נחשבים פגומים ברגישות לאוסמוזה יש להשתמש במתח בקרת בכל SA בריסטול ושני בעלי חיים משמשים כבקרות חיוביות מכיוון שהם נמנעים ממחסום הטבעת. זני בקרה מגיבים לאחור כאשר הם מוצאים מחסום אוסמוטי המורכב מארבע פרוקטוז מולארי. לפצצות מוטנטים חסרי עצב יש התנהגות דומה לאלה ביחס לחוזק מסוג אחד.
עם זאת, מוטציות חסרות NEUR לא הצליחו לזהות את המחסום האוסמוטי הזה. עוצמות מוטנטיות כפולות מכונית באללים שונים של עצב ו-nout התאוששו הפנוטיפ מסוג הפראי המגיב לחוזק האוסמוטי להשגת תולעים למטה על ידי הפרעות RNA האכלת מושבות מבודדות של e coli HD 11 חמש זן שעבר טרנספורמציה עם וקטור L 44 40 המכיל שבר המתאים לגן המטרה. חיידקים מבודדים על LBA או צלחת עם פחמן למחרת.
בחר מושבה של חיידקים וחסן מדיום נוזלי LV. המשיכו להתבגר כשבע שעות עם רעידות ב-37 מעלות. ראו את הטיפה של תרבית זו על צלחת NGM עם תקרה פחמנית ו-IPTG ו-wai במהלך הלילה בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר לחיידקים לגדול ולהתחיל את השראת הביטוי של מקטע גן המטרה.
יש צורך להשתמש בבקרה חיובית ולא שלילית להפרעות RNA. ניסויי האכלה. השליטה השלילית שווה.
I HT 11 חמישה זנים שעברו טרנספורמציה עם וקטור TL 44 40. החיובי שולט ב-ELI HT 11 חמישה תאים שעברו טרנספורמציה עם וקטור L 44 40 המכיל רצף גנים של 22. הנעילה של גן זה מקורה בפנוטיפ מטלטל שניתן להבחין בקלות במיקרוסקופ סטרילי.
היום הראשון. L ארבעה שלבים מ- NGM PLA עם חיידקים מועברים בצלחת עם חיידקים וכווית ב -20 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. זוהי תקופת צום.
למחרת העבירו את הצעיר המהיר לצלחת מחוסנת בחיידקים המבטאים את גן המטרה הספציפי של הפרעות RNA. השאירו כ-48 שעות בחום של 20 מעלות צלזיוס להשגת צאצאי F1. לאחר מכן קח כמה פצצות F1 למבוגרים על צלחת אחרת מחוסנת באותם חיידקים במהלך היומיים הבאים.
בחר ובודד מבוגרים צעירים משני צאצאים F ניקוד לפנוטיפים בריסטול N שני שומן זן מסוג בר עם חיידקים המתרחשים אמפתיה. וקטור L 44 40 הלך אחורה כשהיה בסדר. המחסום האוסמוטי.
בריסטול וזן לבן אמיתי המוזן בחיידקים המבטאים שבר של גן העצב מהאלגנטיות לא הצליח לזהות את אצבעות הרגליים לתמיסות טוחנות. עם זאת, מוטציה חסרת עצב שלא הצליחה לזהות את המחסום האוסמוטי החזירה את היכולת הזו כאשר הוזנה בחיידקים המבטאים שבר של הגן נאן מאלגנטיות הים. בסרטון זה, אנו מראים שיטה פשוטה המאפשרת לחקור את השפעת הגנים המשפיעים על תגובת ההימנעות האוסמוטית באלגנטיות הים.
טבעת של פרוקטוז מהודקת פורמלית עם קונגו אדום משמשת לניתוח תגובת הפצצה לחוזק אוסמוטי. נוירולוגיה במוטציה חסרה פגומה בתגובה זו, עם זאת, מוטציות NU אינן נפגעות בזיהוי מתח טומו המראה תגובה דומה לזן מסוג פראי. סרטון זה מראה כי זנים מוטנטיים כפולים הנושאים אללים שונים של נוקאאוט בגנים ומשחררים שיחזרו את הפנוטיפ הפראי המגיב לחוזק אוסמוטי.
תצפיות אלו אושרו באמצעות הפרעות RNA, גישת נעילה מזינה. באופן זה, הזן מסוג הבר נפגע בזיהוי המחסום האוסמוטי כאשר הוא ניזון מחיידקים המבטאים לפי רצף של הגן ING. מצד שני, מוטנטים פגומים בעצבים, שאינם מסוגלים לזהות את ארבעת תמיסות הפרוקטוז הנוספות, התאוששו מהתנהגות זו כאשר הם הוזנו בחיידקים המבטאים לפי רצף הגן NNU.
התוצאות שהוצגו בניסוי הזה מצביעות על כך ש-n ראייה ונוירו-נויר עשויים להיות מעורבים בחיבור הסינפטי של נוירוני החיישן של הנמטודה, וגם שהם מתקשרים זה עם זה באופן שמשפיע על התפקוד הסינפטי. אוקיי, להתראות ובהצלחה בניסויים שלכם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
נוירוקסינים ונוירוליגינים הם חלבוני הדבקה של ממברנה חיוניים המעורבים בדיפרנציאציה והעברה סינפטית. מחקר זה חוקר את התפקיד של חלבונים אלו ב-C. elegans, תוך התמקדות מיוחדת במומטים חסרי נוירוליגין ויכולתם לזהות חוזק אוסמוטי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- גנטיקה
- ביולוגיה של תא
רקע
- נוירוקסינים ונוירוליגינים מאפשרים הדבקה סינפטית.
- C. elegans משמש כאורגניזם מודלי לחקר תפקודים עצביים.
- מוטציות בחלבונים אלו יכולות להשפיע על תגובות חושיות.
- הבנת מנגנונים אלו עשויה לספק תובנות להתנהגויות הקשורות לאוטיזם.
מטרת המחקר
- לחקור את ההשפעות של מוטציות נוירוליגין ונוירוקסין על זיהוי חושי.
- להעריך את התאוששות הפנוטיפ של סוג בר במוטנטים של C. elegans.
- לחקור את התפקיד של חלבונים סינפטיים בתפקוד עצבי.
שיטות ששימשו
- מניפולציה גנטית של C. elegans ליצירת מוטנטים של נוירוליגין ונוירוקסין.
- בדיקות התנהגותיות להערכת זיהוי חוזק אוסמוטי.
- ניתוח של מבנה ותפקוד סינפטי בזנים מוטנטיים.
- מחקרים השוואתיים עם C. elegans מסוג בר.
תוצאות עיקריות
- מוטנטים חסרי נוירוליגין הראו פגיעה בזיהוי חוזק אוסמוטי.
- מוטציה משולבת עם נוירוקסין השיבה את הפנוטיפ של סוג בר.
- הממצאים מצביעים על מנגנון פיצוי בין נוירוקסינים ונוירוליגינים.
- המחקר מדגיש את החשיבות של חלבונים אלו בעיבוד חושי.
מסקנות
- נוירוקסינים ונוירוליגינים חיוניים לתפקוד סינפטי תקין.
- מוטציות בחלבונים אלו יכולות להוביל לשינויים התנהגותיים משמעותיים.
- מחקר נוסף עשוי לבאר את תפקידיהם באוטיזם והפרעות עצביות אחרות.
