קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR
30 ביולי 2011
ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי גנטי ג elegans, בזמן אמת PCR נעשה שימוש כדי לאמת ולכמת נתוני microarray.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור פרופילי ביטוי גנים העומדים בבסיס פנוטיפים או מסלולים מטבוליים רבים. זה מושג על ידי בידוד תחילה של mRNA משני זני נמטודות מנוגדים. השלב השני של ההליך הוא לסנתז CD NA המכיל רצפי לכידת S SI 3 או SFI ולהכליא אותם למיקרו-מערך.
השלב השלישי של ההליך הוא הכלאה של המיקרו-מערך עם רצפים נגד לכידה המכילים S SI שלוש ורביעיות פלואורו SCIFI. השלב האחרון של ההליך הוא סריקת המיקרו-מערך וניתוח נתונים באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון תוכנת כלי הקסם. בסופו של דבר, גנים מועמדים המתווכים את התופעה הביולוגית הנחקרת מזוהים וניתן לאמת ולכמת אותם על ידי טכניקות חלופיות כמו PCR בזמן אמת.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנוקלאוטידים מנומרים אינם נראים למשתמש, ולכן קשה לכסות תערובת הכלאה הומוגנית על 23,000 פלוס. נוקלאוטידים מודפסים באופן ייחודי מתחילים באיסוף RNA מנמטודות מסונכרנות בריאות. ראשית, הם נשטפים מחדש בצינורות של 15 מיליליטר וכדורי תולעת מגולגלים מושעים מחדש בשבעה מיליליטר של 0.1 נתרן כלורי מולארי ושבעה מיליליטר קר כקרח, 60% משקל לנפח סוכרוז.
לאחר דגירה של 15 דקות על קרח, התולעים נזרקות שוב. עכשיו תולעים נטולות חיידקים ישחו למעלה, ייאספו, יישטפו ברנ"א, ישחררו מים ויגלולים. שוב, הגלולה הנקייה והדחוסה באופן רופף מועברת לצינור מיקרו צנטריפוגה המסתובב מטה במהירות מקסימלית למשך 30 שניות.
נשאף ומאוחסן ב-10 נפחים של RNA מאוחר יותר בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להמשיך. כדי להכין דגימות RNA כוללות, צנטריפוגה את הכדורים המוכנים במהירות מרבית, השליכו את הסופרנט והוסיפו קמצוץ של שרף טחינה מולקולרי לגלולה. לאחר מכן הקפיאו את התערובת באמצעות חנקן נוזלי בעזרת עלי.
טוחנים את תרחיף התולעים הקפוא לתוך מודעת אבקה דקה, חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על האבקה קרה לאחר הטחינה. שים את התמצית על קרח למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות מערבבים את התמצית עם 700 מיקרוליטר R-L-T-B-M-E ו-472 מיקרוליטר של 100% אתנול בסך הכל.
כעת ניתן לבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית לנפח סופי של 60 מיקרוליטר RNA מבודד לכל דגימה ביולוגית. לפני שתמשיך, הסר זיהום DNA גנומי פוטנציאלי על ידי טיפול ב-DNAS אחד, ולאחר מכן שימוש בערכת ניקוי RNA זמינה מסחרית. השלם את הערכה על ידי רמיזה לנפח של 60 מיקרוליטר.
לבסוף, קבע את ריכוז ה-RNA והעריך את שלמות ה-RNA על ידי טיפול בהעמסת דגימות גליוקסל, ניתוח צבע וג'ל לפני הכלאת מיקרו-מערך בשיטות קונבנציונליות RNA מטוהר מתועתק ל-DNA משלים, אשר מטוהר מהתבנית המתפוררת עם ערכה זמינה מסחרית ונרמז לנפח של 60 מיקרוליטר. התחל את הכלאת המיקרו-מערך על ידי חסימת אלגנטיות ים. מגלשות מיקרו-מערך עם DNA זרע סלמון סוניקציה לאחר שעה, הטו את המגלשות החסומות במים מזוקקים כפולים וסובבו.
יבש את השקופיות בצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר המרופדים במגבון קים. כעת הכינו מאגר הכלאה מבוסס אמיד בצורת שני x. ראשית, חממו אותו ל-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס את הגבישים שלו במלואם.
ואז צנטריפוגה למשך דקה אחת ב -10, 000 גרם. לאחר מכן, מערבבים 25 מיקרוליטר CD NA עם 25 מיקרוליטר של מאגר הכלאה, ומעבירים את התערובת בעדינות. כעת בצע סיבוב מהיר של התערובת ודגר אותה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר הדגירה, פיפטה בזהירות את כל דגימת ה-CDNA על שקופית המיקרו-מערך מבלי לגעת בשקופית. כדי לפזר את הדגימה באופן אחיד על שקופית המיקרו-מערך. הורד בעדינות את החלקת הכיסוי על המגלשה באמצעות מחט מזרק לפני הורדת החלקת הכיסוי לחלוטין, משוך חזרה למעלה והורד שוב עם המחט ואפשר להחלקת הכיסוי ליפול בעדינות למקומה.
טכניקה זו ממזערת את היווצרות בועות האוויר. כעת הנח את המגלשה אופקית בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מתחת למגלשה ב-50 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ואפשר לה לדגור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת. הכלאה שנייה מתבצעת זמן קצר לאחר שטיפת המגלשה.
מספר פעמים ב-SSC, המאגר השני, המכיל ריאגנטים ללכידה רגישים לאור ומגיב אנטיפה מוחל באותה טכניקה ואחריו דגירה קצרה, יותר שטיפות וייבוש. לאחר מכן ניתן לסרוק את השקופית. ניתן לנתח תמונות באמצעות התוכנה החינמית עם כלי קסם בקוד פתוח.
בקצרה תחת לשונית הפרויקט, צור ושמור פרויקט חדש תחת הכרטיסייה פרופיל ביטוי בנייה, בחר טען זוג תמונות ובחר את קובץ התמונה האדום כאדום ואת קובץ התמונה הירוק כירוק. לאחר מכן בחר את כרטיסיית פרופיל ביטוי הבנייה. בחר טען רשימת גנים כדי להעלות קובץ רשימת גנים אלגנטי C שהתקבל מאתר GCAT כדי לטפל ולרשת את תמונת המיקרו-מערך.
בחר את הכרטיסיה פרופיל ביטוי לבנות וצור רשת עריכה. כעת ערוך את הרשת. הגדר תיבת דו-שיח באמצעות 48 עבור מספר הרשתות, 22 שורות ו-22 עמודות עבור כל רשת ובחר למספר נקודות משמאל לימין ומלמעלה למטה.
הגדל את שינוי הניגודיות באחוזים והגדל את התצוגה של הרשת עד שניתן יהיה להבחין בקלות בין הנקודות הבודדות. צור את הרשתות על ידי בחירת הגדר את הנקודה השמאלית העליונה בחלונית השמאלית ולאחר מכן לחיצה על מרכז הנקודה השמאלית העליונה, ואחריה הנקודה הימנית העליונה והשורה התחתונה ברשת הראשונה. חזור על הליך הגריד הזה עבור כל אחת מ-48 הרשתות הממשיכות משמאל לימין ומלמעלה למטה.
לאחר מכן שמור על ידי בחירת כרטיסיית הקובץ ושמור את הרשת הנוכחית כפי שנשמרה. בחר את הכרטיסייה המוגמרת כדי להסיר נקודות לא קשורות מהניתוח. פתח את כרטיסיית פרופיל ביטוי הבנייה ותחת אפשרות רשת הכתובת, בחר סימון נקודתי.
כעת סמן בדגל כל כתמי פס או פלואורסצנטיות ברקע ושמור על-ידי בחירה באפשרות שמור דגלים נוכחיים. כמו בלשונית הקובץ, יש לפלח את הקבצים המסומנים בדגל. לבסוף, נתח גנים המושרים או מודחקים על ידי גורם מוגדר על ידי בחירת חקר תחת לשונית הביטוי.
בתיבת הדיאלוג החוקרת, הגדר את הקריטריונים המתאימים לגנים העדינים המספר הכפול גדל או יורד בביטוי. עוצמה ידועה כ-x והערך של X הוא הקריטריון לשינוי ביטוי.
X הוא קלט תחת ערך מקסימלי גדול מ-X עבור גנים מושרים וערך מינימלי קטן מ-x עבור גנים מודחקים. בניסוי זה, מבוצעת בקרת החלפת צבע, שני בודדי RNA כוללים עצמאיים משלב 3 ושלב 4 זחלים מוכלאים כמוטציה ירוקה לעומת סוג בר אדום, בעוד שמוטציה אדומה לעומת סוג בר ירוק כדי לאשר שינויים בביטוי גנים מבצעים שלושה בידוד RNA כולל עצמאי באמצעות אותו הליך לסנתז CDNA עם ערכה זמינה מסחרית, ועבור כל דגימת CD NA לבצע PCR בזמן אמת ומשולש באמצעות שלושה גנים של משק בית כבקרות. להדגמה, התוצאות הבאות בוחנות את ביטוי הגנים המושרה ב-VSM אחד.
AK 1468 מוטציות זן נמטודה המאופיין בסינפטי משופר לפני ביצוע ניתוח מיקרו-מערך, איכות ה-RNA המופק נבדקת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. נוכחותן של שתי תת-יחידות ריבוזומליות שלמות לפני ואחרי טיפול אחד מעידה על דגימת RNA טובה במיקרו-מערך מסוג פרא CDNA מסומנת באדום ו-VSM CD NA מוטנטי אחד מסומן בירוק. באחת מ-48 הרשתות שנותחו לכל מיקרו-מערך, כל ריבוע קטן מייצג אוליגונוקלאוטיד מודפס יחיד בכל מערך, כל אוליגונוקלאוטיד ייחודי מיוצג.
ברגע שניתוח מיקרו-מערך של תעתיקים שבודדו מזחלי שלב 4 מראה כי גנים המקודדים לחלבוני הזרע העיקריים או MSP מושרים ב-VSM, ניתוח מיקרו-מערך מוטציות של זחלי שלב 3 חושף גם שינויים בביטוי באותה משפחת גנים במוטנט. בדיקות. תחזיות מהמיקרו-מערך על ידי ניתוח PCR בזמן אמת מגלות כי חבר אחד ממשפחת הגנים M ms P MS 32, מושרה במוטציות VSM one. הנתונים מייצגים את הממוצע של שלושה שכפולים של PCR בזמן אמת מאותו אוסף RNA.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל בכלים ביואינפורמטיים לניתוח רחב של הגנום, במיוחד בהתחשב בכך שישנן תוכנות ביואינפורמטיות רבות בקוד פתוח הזמינות לקהילה המדעית.
סקירה
מחקר זה חוקר פרופילי ביטוי גנים ב-C. elegans באמצעות ניתוח מיקרו-מערך ו-PCR בזמן אמת לצורך אימות. השיטה כוללת בידוד mRNA מזני נמטודות שונים כדי להבין את התופעות הביולוגיות הבסיסיות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- טכנולוגיית מיקרו-מערך
רקע
- C. elegans משמש כאורגניזם מודלי לחקר ביטוי גנים.
- ניתוח מיקרו-מערך מאפשר בחינת אלפי גנים בו זמנית.
- PCR בזמן אמת משמש לאישוש ממצאי המיקרו-מערך.
- הבנת ביטוי גנים יכולה להבהיר מסלולי מטבוליזם ופנוטיפים.
מטרת המחקר
- לזהות גנים מועמדים המעורבים בתהליכים ביולוגיים ספציפיים.
- לאמת נתוני מיקרו-מערך באמצעות PCR בזמן אמת.
- להעמיק את ההבנה של ביטוי גנטי בנמטודות.
שיטות ששימשו
- בידוד mRNA מזני נמטודות מנוגדים.
- סינתזה של cDNA והכלאה למיקרו-מערכים.
- שימוש בכלי ביו-אינפורמטיקה לניתוח נתונים.
- אימות התוצאות באמצעות PCR בזמן אמת.
תוצאות עיקריות
- זיהוי גנים מועמדים המתווכים תופעות ביולוגיות.
- אימות מוצלח של נתוני המיקרו-מערך עם PCR בזמן אמת.
- תובנות לגבי פרופילי ביטוי גנים בין זנים שונים.
- שימוש בכלי ביו-אינפורמטיקה לניתוח נתונים מקיף.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת לניתוח ביטוי גנים ב-C. elegans.
- PCR בזמן אמת משמש כשיטת אימות יעילה לתוצאות מיקרו-מערך.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים הגנטיים בנמטודות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to profile gene expression changes in model organisms, supporting target validation by identifying differentially expressed genes linked to phenotypic outcomes. By combining microarray screening with real-time PCR confirmation, it provides a scalable approach for mechanistic de-risking in early discovery, helping prioritize targets with stronger predictive confidence before lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing gene expression shifts associated with enhanced synaptic connectivity in mutant models.
- Operational Value: Enables pathway clarification through systematic screening of thousands of genes to pinpoint candidates like MSP-32 for further functional study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming gene induction via orthogonal real-time PCR validation.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through dye-swap controls and triplicate measurements, reducing false positives in target identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking synaptic phenotypes to MSP signaling pathways, which have conserved roles in neuromuscular junction regulation across species.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker exploration by identifying secreted signaling molecules like MSPs that may serve as measurable indicators of pathway activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, where expression profiling informs target selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by connecting genetic perturbations to molecular phenotypes through expression profiling.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via microarray intensity measurements and real-time PCR quantification, enabling condition comparisons.
- Analytics: Highlights bioinformatic-driven readouts such as fold-change thresholds and statistical significance, aiding in hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying evolutionarily conserved signaling families (e.g., MSP/Eph) with relevance to human synaptic biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic responses across diverse phenotypes, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by validating microarray hits with real-time PCR, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through standardized RNA isolation, labeling, and hybridization protocols applicable across strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-modal evidence (transcriptomic + qPCR) for target prioritization, lowering late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by distinguishing robust expression changes from noise, supporting data-driven resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques to ensure sample integrity and data quality.
- Dependent on access to microarray scanners, bioinformatic software (e.g., Magic Tool), and real-time PCR instrumentation for end-to-end execution.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for RNA isolation, labeling, and data analysis to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or tissue types due to variability in RNA yield and hybridization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for technical skill in grid alignment and spot flagging during microarray analysis, which can affect data accuracy if not performed correctly.
