Name: קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למדו לנתח פרופילי ביטוי גנים ב-C. elegans באמצעות מיקרואריי ו-PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים מועמדים והבנת מנגנונים גנטיים בנמטודות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו בוצעה על ידי סטודנטים לתואר ראשון ב Southwestern אוקלהומה סטייט, אישור Weatherford. עבודה זו נתמכה על ידי רוי NSF-0963258, NIH-OK INBRE 2P20RR016478, GCAT ו OCAST HR09-137S. (Ok1468) vsm1 מוטציה היתה מבודדת על ידי קונסורציום נוק ג&#39;ין אוקלהומה. המחברים מודים דן Stefanovic וטאנר וילר לעזרה יקר שלהם במהלך ביצוע הפרויקט.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

במחקר זה פיתחנו פרוטוקול קל, ידידותי למשתמש, שניתן להשתמש בהם כדי נקבע ביטוי הגן פרופילים הבסיסית תופעות ביולוגיות שונות. בפרוטוקול זה, הכולל RNA בודד לראשונה וטופלו באמצעות DNase I. השיטה שלנו של בידוד RNA הופשטה באופן דרמטי על ידי השמטת עקירות פנול באמצעות שרפים זיקה לנקות 5,6. בקצרה, C. elegans cuticule הקרומים של התא היו סדוקים פתוח נמטודות על ידי הקפאה עם חנקן נוזלי וטחינה עם שרף מולקולרית. בשלב הבא, RNA חילוץ טופלה DNase אני לפני סינתזה cDNA. בשלב מאוחר יותר נוספה כדי למזער הכלאות נוקבים; דגימות רנ&quot;א מזוהמים הדנ&quot;א הגנומי יכול להציג התערבות לייצר הרבה false-positives. לאחר מכן, הקלד בר VSM-1 (ok1468) cDNAs מוטציה תויגו עם Cy3 ו Cy5 רצפים ללכוד הכלאה על C. microarrays elegans להשיג באמצעות תוכנית GCAT. מערכת זו היא יותר רגישה מוצרים דומים, ועיצוב שני הצבעים שלה מקטין את מספר מערכים הצורך, וכתוצאה מכך זמן רב יותר ויעילות כלכלית 7,8. בנוסף, מערכת זו אינה דורשת ציוד מיוחד של מערכות דומות אחרות, ולכן הליך זה יכול להתבצע בכל סביבה מעבדה סטנדרטיים 7. שלישית, תמונות פלורסנט מערך הכלאה נותחו באמצעות MAGICTool תוכנות קוד פתוח, וביטוי גנים פרופילים שנוצרו. MAGICTool היא תוכנית ידידותי למשתמש כי הוא מנוצל בקלות על ידי אנשים מכל הרמות ניסיון, מן ראשון עד שלישי שלאחר. עם זאת, ביצועים מיטביים דורש זמינות זיכרון גדול. לבסוף, גנים מועמדים שהתקבלו באמצעות ניתוח microarray אומתו עם הזמן PCR אמיתי. למרות גישה גנומית היא שיטה יעילה ללימוד תופעות ביולוגיות, ישנן כמה מגבלות שצריך לקחת בחשבון. ראשית, למרות הספציפיות של פרוטוקול זה microarray, תעתיקים בתוך המשפחה הם נבדלים אחד מהשני אם oligonucleotide מודפס נלקח רצפים שימור. זמן PCR נדל מפצה על הדמיון בתוך המשפחה גן ואף עשויה להבחין בין isoforms ספציפי של אותו גן. עם זאת, עם הזמן PCR אמיתי זה אתגר למצוא שולטת נכון באים לידי ביטוי באופן שווה לאורך כל חיי האורגניזם. בגלל זה, התוצאות יהיו יחסית. גישה proteomic הוא אחד חלופה הטכניקה שלנו. חלבונים בודדים עשויים להיות מבודדים באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה 2D and המזוהה עם ספקטרומטריית מסה. המחקרים שלנו מראים כי באופן ספציפי רבים מבני המשפחה סרן חלבון (MSP) הזרע הם המושרה VSM-1 נמטודות מוטציה עם צפיפות הסינפטי משופרת. MSPS ייחודיים ג elegans ואחראים על התבגרות הביצית ואת הביוץ. חי 1 הוכיחה כי תקנה מספר באוטון גודל presynaptic ו בצומת neuromuscular אצל זבובי פירות נשלטת סביר על ידי מולקולות המכילות חלבון תחומים עיקריים זרע. מחקרים של Tsuda ועמיתיו הוכיחו 2 תחומים עיקריים חלבון הזרע יכול לשמש ligands לרצפטורים Ephrine, מפעילה טירוזין קינאז רצפטור מפלי איתות. יתר על כן, אמיתי ניתוח PCR זמן תוקף הצטמצם תוצאות microarray לאחד מבני המשפחה msp, msp-32. יחדיו, את העבודה המוצגת כאן מהווה ניתוח גנום רחב של דילמה מרכזית במדעי המוח, כמו גם את כוחו של מחקר ראשון העשייה המדעית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> קטלוג # </td><td> חברה </td></tr><tr><td> RNA מאוחר יותר </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> שרף גריסה מולקולרית </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Rnase ללא agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax גלאי הצפת 10X Prep / ריצה ג&#39;ל </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA המילניום מרקר </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal טוען לדוגמה דיי </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase להגדיר </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> האנזים RT הצפת התגובה 5X </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> מערך 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR ערכת טיהור </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> גזוז זרע סלמון DNA </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS פתרון </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript ערכת סינתזה cDNA </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> IQ SYBR גרין Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת pcr

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

סינפסות מורכבים אזור פעיל presynaptic בתא איתות מסוף postsynaptic בתא היעד. במקרה של סינפסות כימיות, המסרים מועברים על ידי העצביים המשוחררים מן מסופי presynaptic וקיבל על ידי רצפטורים על תאים postsynaptic. מחקרים קודמים שלנו Caenorhabditis elegans הראו כי VSM-1 שלילי מסדיר exocytosis. בנוסף, ניתוח של הסינפסות VSM-1 הראו כי מוטנטים בעלי חיים חסרי קישוריות מתפקדת במלואה הסינפטי VSM-1 הגדילו. בהתבסס על הממצאים הראשוניים, שיערנו כי ג elegans VSM-1 עשוי לשחק תפקיד מכריע synaptogenesis. כדי לבחון סברה זו, ניתוח פעמיים שכותרתו microarray בוצעה, וביטוי פרופילים גן נקבעו. ראשית, RNA הכולל היה מבודד, עיבד reversely ל cDNA ו הכלאה של microarrays DNA. ואז, ב-סיליקו ניתוח של הכלאה בדיקה ניאון חשף אינדוקציה משמעותית של גנים רבים קידוד עבור בני המשפחה חלבון מרכזי זרע (MSP) ב מוטנטים עם synaptogenesis משופרת. MSPS הם המרכיב העיקרי של הזרע ג elegans מופיעים כדי לאותת הביצית הבשלה נמטודות ואת הביוץ. אצל זבובי פירות, הפגינו חי ועמיתיו 1 כי MSP כמו מולקולות להסדיר מספר באוטון גודל presynaptic ו בצומת neuromuscular. יתר על כן, הניתוח מבוצע על ידי Tsuda ועמיתים לעבודה 2 הציע MSPS יכול לשמש ligands לרצפטורים יבצע אפרים את גזר ואת ההדק קולטן טירוזין קינאז מפלי איתות. לבסוף, זמן אמת ניתוח PCR אומת כי הגן המקודד MSP-32 הוא המושרה VSM-1 (ok1468) מוטנטים. יחדיו, מחקר שבוצע על ידי המעבדה שלנו הראה כי VSM-1 מוטציות יש עלייה משמעותית בצפיפות הסינפטית, אשר יכול להיות מתווכת על ידי איתות MSP-32.

ניתוח microarray נערך כדי לקבוע פרופילים של ביטוי גנטי<em&gt; ג elegans</em&gt;, בזמן אמת PCR נעשה שימוש כדי לאמת ולכמת נתוני microarray.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

סינפסות מורכבות מאזור פעיל פרה-סינפטי בתא המאותת ומסוף פוסט-סינפטי בתא המטרה. במקרה של סינפסות כימיות, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור פרופילים של ביטוי גנים העומדים בבסיס פנוטיפים רבים או מסלולים מטבוליים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד mRNA משני זני נמטודה מנוגדים. השלב השני של הפרוצדורה הוא סינתזה של cDNA המכיל רצפי לכידה של S SI three או SFI, והיברידיזציה שלהם למערך מיקרו (microarray).השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע היברידיזציה למערך המיקרו (microarray) עם רצפי לכידה אנטי-ספציפיים המכילים S SI three ו-SCIFI fluoro fours. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא סריקת מערך המיקרו וניתוח הנתונים באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון תוכנת magic tool. בסופו של דבר, מזוהים הגנים המועמדים המתווכים את התופעה הביולוגית הנבדקת, וניתן לתקף ולכמת אותם בטכניקות חלופיות כגון real-time PCR.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה כיוון שהנוקלאוטידים המודפסים אינם נראים למשתמש, ולכן קשה להניח תערובת היברידיזציה הומוגנית מעל למעל 23,000 הנוקלאוטידים המודפסים באופן ייחודי. התחילו באיסוף RNA מנמטודות בריאות ומסונכרנות. ראשית, שוטפים אותן, מרחיפים אותן באנבונות של 15 milliliter ומצמידים אותן לצנטריפוגה; את כדוריות התולעים המצמידות מרחיפים ב-7 milliliters של 0.1 molar sodium chloride וב-7 milliliters של sucrose בריכוז 60% weight per volume קר במקרר.לאחר דגירה של 15 דקות על קרח, התולעים מרוכזות שוב למשקע. כעת, תולעים נקיות מחיידקים ישחו כלפי מעלה; אלו נאספות, נשטפות במים נקיים מ-RNA ומרוכזות למשקע. שוב, המשקע הנקי והדחוס באופן רופף מועבר למבחנה למיקרו-צנטריפוגה וסובב במהירות מקסימלית למשך 30 שניות.יש לשאוב ולאחסן ב-10 נפחים של RNA later בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד המשך התהליך. להכנת דגימות RNA כולל, יש לסבב במרכזפוגה את המשקעים שהוכנו במהירות מקסימלית, להסיר את הנוזל העליון ולהוסיף קמצוץ של שרף טחינה מולקולרי למשקע. לאחר מכן, יש להקפיא את התערובת באמצעות חנקן נוזלי תוך שימוש בעלי. טחנו את תרחיף התולעים הקפוא לאבקה דקה, והוסיפו חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על קור האבקה לאחר הטחינה. הניחו את התמצית על קרח למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, ערבבו את התמצית עם 700 µL של R-L-T-B-M-E ו-472 µL של ethanol 100% בסך הכל.כעת ניתן לבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית לנפח סופי של 60 microliters של RNA מבודד לכל דגימה ביולוגית. לפני ההמשך, יש להסיר זיהום פוטנציאלי של DNA גנומי על ידי טיפול ב-DNase I, ולאחריו שימוש בערכה זמינה מסחרית לניקוי RNA. השלם את תהליך השימוש בערכה תוך התייחסות לנפח של 60 microliter.לבסוף, קבעו את ריכוז ה-RNA והעריכו את שלמות ה-RNA באמצעות טיפול ב-glyoxal, טעינה של דגימה, צבע ואנליזת ג'ל לפני ההכלה (hybridization) של המיקרו-מערך (microarray). באמצעות שיטות קונבנציונליות, ה-RNA המטוהר עובר תעתוק הפוך ל-DNA משלים (complementary DNA), אשר מטוהר מהתבנית המוכלת באמצעות ערכה זמינה מסחרית ומובא לנפח של 60 µL. התחילו את ההכלה של המיקרו-מערך על ידי חסימה של שקופיות מיקרו-מערך בעזרת DNA של זרע סלמון שעבר סוניקציה. לאחר שעה, טבלו את השקופיות החסומות במים מזוקקים פעמיים וסובבו אותן.ייבשו את השקופיות במבחנות קוניות של 50 milliliter המרופדות ב-kim wipe. כעת הכינו תמיפת היברידיזציה מבוססת פורממיד בריכוז two x. ראשית, חממו אותה ל-55 degrees Celsius למשך 10 דקות כדי להמיס לחלוטין את הגבישים.לאחר מכן, סבבו במסנטרטגה למשך דקה אחת במהירות של 10,000 gs. בשלב הבא, ערבבו 25 µL של CD NA עם 25 µL של תמיסת היברידיזציה (hybridization buffer), ונערה את התערובת בעדינות. כעת, בצעו סבב קצר (quick spin) לתערובת והדגירו אותה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות.לאחר הדגירה, העבירו בזהירות בעזרת פיפט את כל דגימת ה-CDNA למשטח המיקרו-מערך (microarray slide) ללא מגע עם המשטח, כדי לפרוס את הדגימה באופן אחיד על פניו. הניחו בעדינות זכוכית כיסוי על המשטח באמצעות מחט של מזרק; לפני שהזכוכית יורדת לחלוטין, הרימו אותה חזרה והורידו אותה שוב בעזרת המחט, כדי לאפשר לזכוכית הכיסוי לנחות בעדינות במקומה.טכניקה זו ממזערת את היווצרותן של בועות אוויר. כעת הניחו את הזכוכית באופן אופקי בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter, הוסיפו מתחת לזכוכית 50 microliters של מים מזוקקים פעמיים והניחו לה להדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, תבוצע היברידיזציה שנייה זמן קצר לאחר שטיפת הזכוכית.במספר שלבים בתהליך ה-SSC, מיושם הבאפר השני, המכיל ריאגנטים ללכידה הרגישים לאור וריאגנט Antifa, תוך שימוש באותה טכניקה, ולאחריו דגירה קצרה, שטיפות נוספות וייבוש. לאחר מכן ניתן לסרוק את השקופית. ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנה חינמית בעלת כלי קסם בקוד פתוח.בתוך לשונית הפרויקט (project), צרו ושמרו פרויקט חדש תחת לשונית בניית פרופיל ביטוי (build expression profile), בחרו בטעינת זוג תמונות (load image pair) ובחרו את קובץ התמונה האדומה כצבע אדום ואת קובץ התמונה הירוקה כצבע ירוק. לאחר מכן, בחרו בלשונית בניית פרופיל ביטוי (build expression profile). בחרו בטעינת רשימת גנים (load gene list) כדי להעלות קובץ רשימת גנים של C elegance שהושג מאתר GCAT, לצורך מיפוי וסידור תמונת המערך המיקרוסקופי (microarray image).בחר בלשונית build expression profile ובאפשרות create edit grid. כעת ערוך את הגריד. הגדר את תיבת הדיאלוג באמצעות 48 עבור מספר הגרידים, 22 שורות ו-22 עמודות עבור כל גריד, ובחר במספור נקודות משמאל לימין ומלמעלה למטה.הגבירו את אחוז שינוי הניגודיות (contrast change) ובצעו זום-אין על הגריד עד שהנקודות הבודדות יהיו ניתנות להבחנה בקלות. צרו את הגרידים על ידי בחירה בנקודה השמאלית-עליונה (set top left spot) בפאנל השמאלי, ואז לחיצה על מרכז הנקודה השמאלית-עליונה, לאחר מכן על הנקודה הימנית-עליונה ועל השורה התחתונה בגריד הראשון. חזרו על הליך הגריד עבור כל אחד מ-48 הגרידים, תוך התקדמות משמאל לימין ומלמעלה למטה.לאחר מכן, שמרו את התוצאות על ידי בחירה בלשונית הקובץ (file) ובחירה ב-"save current grid as" לאחר השמירה. בחרו בלשונית ה-finished כדי להסיר נקודות שאינן רלוונטיות מהניתוח. פתחו את לשונית "build expression profile" ותחת אפשרות ה-addressing gridding, בחרו ב-spot flagging.כעת סמנו כל כתמי מריחה או פלואורסצנציית רקע ושמרו על ידי בחירה ב-save current flags. תחת לשונית file, יש לבצע סגמנטציה לקבצים שסומנו. לבסוף, נתחו גנים שהודעו או דוכאו על ידי גורם מסוים על ידי בחירה ב-explore תחת לשונית expression.בתיבת הדיאלוג של החיפוש (exploring), הגדירו את קריטריוני ההתאמה לגנים המעודנים. מספר העליות או הירידות הפי שתיים בביטוי. העוצמה נקראת x וערכו של X הוא הקריטריון לשינוי בביטוי.X מוזן תחת ערך מקסימלי הגבוה מ-X עבור גנים מושרים וערך מינימלי הנמוך מ-x עבור גנים מדכאים. בניסוי זה, מבוצע בקרת החלפת צבע (dye swap control); שני בידודים עצמאיים של RNA כולל מזחלי שלב שלוש ושלב ארבע עוברים היברידיזציה כמעטנט ירוק לעומת פראי אדום, בעוד שמעטנט אדום לעומת פראי ירוק משמשים לאישור שינויים בביטוי הגנים. בצעו שלושה בידודים עצמאיים של RNA כולל באמצעות אותו הליך, סנתזו cDNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית, ועבור כל דגימת cDNA בצעו real-time PCR בשלישייה תוך שימוש בשלושה גני בית (housekeeping genes) כביקורות. להדגמה, התוצאות הבאות בוחנות ביטוי גנים שהושר ב-VSM one.מוטנטים AK 1468 הם זן של נמטודה המאופיין בסינפסה מוגברת; לפני ביצוע ניתוח מיקרו-מערך (microarray), נבדקת איכות ה-RNA שהופק באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. נוכחותן של שתי תתי-יחידות ריבוזומליות שלמות לפני ואחרי טיפול ב-dase one מעידה על דגימת RNA תקינה במיקרו-מערך; ה-CDNA של סוג הבר (wild type) מסומן באדום וה-CDNA של מוטנט VSM one מסומן בירוק. באחד מ-48 הרשתות המנותחות לכל מיקרו-מערך, כל ריבוע קטן מייצג אוליגו-נוקלאוטיד בודד שהודפס; בכל מערך מיוצג כל אוליגו-נוקלאוטיד ייחודי.לאחר שניתוח מיקרו-מערך (microarray) של תמלילים שבודדו מזחלים בשלב ארבע הראה כי גנים המקודדים לחלבוני זרע עיקריים, או MSP, מונחים במוטנטים של VSM one, ניתוח מיקרו-מערך של זחלים בשלב שלוש חשף גם הוא שינויים בביטוי בתוך אותה משפחת גנים במוטנט. בדיקת התחזיות מהמיקרו-מערך באמצעות ניתוח realtime PCR גילתה כי חבר אחד ממשפחת הגנים M ms P, שמו MS P 32, מונחה במוטנטים של VSM one. הנתונים מייצגים ממוצע של שלושה חזרות של real-time PCR מאותו אוסף RNA.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בכלים ביואינפורמטיים לניתוח גנומי רחב, במיוחד לאור העובדה שתוכנות ביואינפורמטיקה רבות ובקוד פתוח זמינות עבור הקהילה המדעית.

determining-genetic-expression-profiles-c-elegans-using-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) היא כלי יעיל לאבחון רמות ה-mRNA ברקמות חרקים שונים, שלבי התפתחות. בדוח זה אנו מציגים את השימוש qRT-PCR כדי לברר רמות ה-mRNA ברקמות הזחל שונים שלבי ההתפתחות של מינים פולשניים חרקים, דקור ברקת אפר.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

סרטון זה מתאר טכניקה לסינון מהיר של נמטודה בודדת לאיתור סמן גנטי על ידי בדיקת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו בודקים עריכת גנום מבוססת קריספר.

PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

במאמר זה פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור קביעה מהירה ואמינה של רמות ביטוי גנים בדגימות C. elegans יחיד או בתפזורת מתואר. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד RNA ומייצר cDNA ישירות מדגימות. ניתן להשתמש בו יחד עם פלטפורמות qPCR ננופלואידיות מרובות תפוקה גבוהה בזמן אמת.

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

פרוטוקול זה מספק שיטה למדידת תדרי הצלבה והתפלגות במהלך מיוזה ב- Caenorhabditis elegans. גנוטיפ פולימורפיזם חד-נוקלאוטידי עם PCR בזמן אמת שימש לקביעת מקור הכרומוזומים. מיפוי 4 הנקודות איפשר לקבוע את התפלגות ההצלבה של אזורי הזרוע השמאלית, המרכז והימנית של כל כרומוזום. ...

תדירות והתפלגות של הצלבות במיוזה Caenorhabditis elegans על ידי גנוטיפ SNP באמצעות PCR בזמן אמת

למדו לנתח פרופילי ביטוי גנים ב-C. elegans באמצעות מיקרואריי ו-PCR בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים מועמדים והבנת מנגנונים גנטיים בנמטודות.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

גלה סרטונים נוספים