הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic
October 27th, 2009
מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.
מערכת השטף הביולוגי היא מכשיר אוטומטי ומכשיר מיקרופלואידי להפעלת בדיקות תאים חיים בזרימה מבוקרת. מערכת זו משתמשת בטכנולוגיית מיקרופלואידית של צלחת באר כדי לשלב התקני תאי זרימה בקנה מידה מיקרוני בלוחות באר סטנדרטיים של SBS. ניתן להשתמש ב-BioFlex לביצוע מחקרי הידבקות וצבירה של טסיות דם עם תפוקה גבוהה ונפחי דם מופחתים.
דם מלא המסומן בצבע פלואורסצנטי מתווסף לבארות ולאחר מכן זורם דרך התעלות. תחת זרימה מבוקרת, מיוצרים נתוני מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, המכמתים הידבקות וצבירה של טסיות דם בנוכחות תרכובות תרופות ופרמטרים משתנים אחרים. היי, אני מייק שוורץ ממעבדת ה-RD ב-Flexion Biosciences.
היום נראה לכם נוהל לשימוש בתאי זרימה מיקרופלואידיים במבחני הידבקות טסיות דם. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו למגוון בדיקות ביולוגיה של כלי הדם. אז בואו נתחיל.
בקר, לפני הפעלת ניסוי תאי הזרימה, יש להכין את התעלות המיקרופלואידיות של צלחת השטף הביולוגי עם ציפוי חלבון מעניין קולגן אחד ישמש בניסוי זה. כל אחד מ -24 תעלות הניסוי של צלחת השטף הביולוגי מתחבר לבאר כניסה ולבאר יציאה לצלחת זו. באר הכניסה היא הבאר השמאלית המזינה את התעלה ובאר היציאה נמצאת בצד ימין, יש לדלל את מלאי הקולגן לריכוז של 200 מיקרוגרם למיליליטר.
בחומצה אצטית מולרית של 0.02 יהיה צורך ב -20 מיקרוליטר לכל תעלה המשמשת. מכיוון שניסוי זה דורש 11 ערוצים, הכינו 200 מיקרוליטר ציפוי קולגן. תעלה אחת נותרה לא מצופה מעורבבת באיטרציה עדינה עם קצה מיקרו פיפטה.
הוסף 20 מיקרוליטר ציפוי לכל תעלה מתאימה באמצעות מיקרו פיפטה כדי להוציא את הנוזל לאגרוף הפנימי של הבאר. הזנת התעלה המיקרופלואידית המעניינת כפי שמוצג כאן עם הצבע הצהוב כוללת תעלה אחת ללא קולגן כבקרה שלילית על הידבקות טסיות הדם והצבירה. לאחר הוספת ציפוי הקולגן לכל הערוצים המתאימים, חבר את הממשק לצלחת.
אם אתה משתמש בממשק bio flux 1000, אתה יכול להדק את שני התפסים על הבמה. אם אתה משתמש באצבע הראשונה של ממשק Bio flux 200, הדק את ארבעת הברגים. ולאחר מכן, לאחר שהכל מוכן, השתמש בנהג המומנט כדי להדק לחלוטין.
נהג המומנט ילחץ כשיגיע למקסימום. באמצעות המצב הידני בתוכנת השטף הביולוגי, החל זלוף על ערוצי העניין בסנטימטר דו-ממדי בריבוע מהשקע. ובכן, השתמש במטרה בהספק נמוך במיקרוסקופ כדי למצוא את הכניסה היטב ולראות את האגרוף הפנימי הנגדי מתמלא בנוזל.
תחילה אתה אמור לראות נוזל זעיר, הממלא לאט את האגרוף הפנימי לאחר מספר דקות וכאשר האגרוף הפנימי של הכניסה מתמלא, הפסק את השפע בכל הערוצים על ידי לחיצה על עצירה בתוכנה. דוגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. במהלך תקופת הדגירה הזו, אתה יכול להתחיל להכין את כל הדם בתום הדגירה של שעה.
לאחר הכנת הדם, הסר את הממשק והוסף לשקע מיליליטר אחד של PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום. ובכן, התחל שפע מהשקע היטב בשני סועדים לסנטימטר רבוע והמשיך בשפע למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, עצור את השפע לאחר הסרת הממשק, הסר עודף PBS מבארות הכניסה והיציאה.
לעולם אל תסיר נוזל שממלא את האגרוף הפנימי. כדי לחסום את הערוצים, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לכל שקע. ובכן, לשימוש מהשקע היטב בשני סנטימטר בריבוע והמשיכו בזילוף למשך 10 דקות.
הפסק את השפע לאחר 10 דקות והסר את הממשק. התעלות מוכנות כעת וניתן להשתמש בהן לאורך כל היום בזמן שהצלחת מצופה בקולגן. במהלך דגירה של שעה, יש להכין דם אנושי טרי מאדם בצום להדמיה ולרוץ לצלחת.
יש לשאוב דם לנתרן ציטראט, נוגד קרישה ולהשתמש בו תוך שלוש שעות מרגע האיסוף. ראשית, הוסף מלאי של ארבעה מילי-מולרים של סידן M ב-DMSO לדם בדילול של 1 עד 1000 נפח לנפח. כדי להשיג ארבעה מיקרו-מולרי סידן אני מעורבב בהיפוך עדין.
לאחר מכן, חלק מיליליטר אחד של הסידן המסומן בדם לעשר צינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר. הוסף נוגדן מעכב GP שני B שלוש A לכל צינור בדילול הרצוי. הקפד לכלול בקרה שלילית ללא נוגדנים ובקרה חיובית של נוגדנים לא קשורים מעורבבים על ידי היפוך עדין.
דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת של ערבוב על ידי היפוך עדין כל 10 דקות לפני הפעלת ניסוי תאי הזרימה. יש להגדיר פרוטוקול אוטומטי במודול בקרת השטף הביולוגי לקולגן. אחד. הגדר פרוטוקול להזרמת הדם בעשרה תשעה סנטימטרים בריבוע למשך 10 דקות מהשקע.
ובכן, באמצעות BioFlex 1000 יש להגדיר פרמטרים לרכישת נתונים של תחנת עבודה, הכוללים את רכישת מיקומי השלב הרצויים בהגדרת אורך הגל של fitz והגדרת זמן-lapse. תוכנית רכישת תמונה טיפוסית לפרוטוקול זה תכלול שדה ראייה אחד לכל ערוץ שיצולם באמצעות מטרה של פי 10 כל 30 שניות במשך זמן כולל של 10 דקות. שדות ראייה נוספים והגדרות TimeLapse חלופיות אפשריים גם כן.
לאחר הגדרת הפרוטוקול האוטומטי ופרמטרי רכישת הנתונים, חזור לצלחת BioFlex והסר את הנוזל משני צידי התעלה למעט האגרופים הפנימיים. הקפידו לעבוד במהירות, הכניסו 500 מיקרוליטר דם מכל מצב לבארות הפלט של כל ערוץ. שימו לב שבארות הפלט משמשות להעברת הדם מכיוון שזו הדרך הקצרה ביותר לאזור הצפייה ותספק תגובה מיידית יותר של הדם לציפוי הקולגן.
בנוסף, הכניסו את דם הביקורת ללא נוגדן לתעלה המצופה בקולגן וכזו שפשוט חסומה. הנח את הצלחת על מיקרוסקופ תחנת העבודה BioFlex 1000 והדק את הממשק. בצע את רשימת השלבים כיול על ידי איתור נקודת הכיול הראשונה המוגדרת כמקור.
לאחר מכן אתר וסמן את נקודת הכיול השנייה. החל כיול זה על רשימת השלבים המתאימה. זה מבטיח שניתן למצוא את כל ה-viewמיקומים על הצלחת באופן אוטומטי.
העבר את הבמה לאחד הערוצים המכילים סט דם מתאים e פרמטרים ללכידת תמונה כגון זמן חשיפה ורווח בתוכנת המונטאז' BioFlex. הפעל את זרימת העבודה המתאימה על ידי לחיצה על הכפתור הרצוי. זה יתחיל את פרוטוקול הזרימה ורכישת התמונה בו זמנית.
בסיום הניסוי יש להוציא את הצלחת מתחנת העבודה BIOFLU 1000 ולהשליך אותה בהתאם להנחיות המוסדיות. שימוש בתעלות מיקרופלואידיות מצופות קולגן של מערכת השטף הביולוגי. היווצרות פקקת אגרסיבית נצפית לאורך זמן עם דגימת הדם הלא מטופלת.
לעומת זאת, לא נצפתה היווצרות פקקת עם התעלה הלא מצופה. בניסוי אחד שבוצע לאחרונה, הגודל הממוצע של אגרגטים בתנאי ביקורת היה 2000 מיקרומטר בריבוע. GP שתיים B שלוש A הוא מתווך רב עוצמה של אינטראקציות טסיות וייצוב צבירה כאשר הוא מופעל על ידי הידבקות לקולגן כפי שמוצג כאן לאחר הדגירה עם נוגדן אנטי GB שתיים B שלוש A במשך שעה אחת לפני החשיפה המוחלטת, נצפתה ירידה בגודל הפקקת כמו גם ירידה בתדירות היווצרות הפקקת.
בדרך כלל ניתן לראות תגובה תלוית מינון בעשרה תשעה סנטימטרים בריבוע וערך ה-IC 50 עבור מעכב מסוים זה היה 17 ננו-מולארי. העיכוב המקסימלי עבור תורם זה בהשוואה לביקורת ללא נוגדנים היה 11% ב-10 סנטימטר בריבוע. לוחית גזירה גבוהה של 48 באר זמינה גם לביצוע ניסויים בדם מלא עד 200 D לסנטימטר בריבוע או 5,000 שניות הפוכות.
זה עתה הראינו לך כיצד להשתמש בתעלות זרימה מיקרופלואידיות כדי לבצע ניסויים בביולוגיה של כלי הדם הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. כאשר עושים את הפרוטוקול הזה, חשוב לזכור לדלל את הקולגן במאגר הנכון. השתמש תמיד בטכניקת פיפטינג נכונה כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר ופעל תמיד לפי תקנות הבטיחות הביולוגית של המעבדה שלך.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פורמט של צלחת באר מיקרופלואידית לבדיקות צבירת טסיות המשחזרות תנאי זרימה גזירתיים פיזיולוגיים. השיטה מאפשרת מחקרים בעלי תפוקה גבוהה של הידבקות טסיות וצבירתן.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה כלילית
- מיקרופלואידיקה
רקע
- הידבקות טסיות חיונית להמוסטזיס ותרומבוזיס.
- בדיקות קונבנציונליות אינן משחזרות תנאי זרימה גזירתיים.
- טכנולוגיית המיקרופלואידיקה מאפשרת שליטה מדויקת בדינמיקת הזרימה.
- מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לכמת אינטראקציות טסיות.
מטרת המחקר
- לפתח בדיקה מיקרופלואידית המחקה תנאים פיזיולוגיים.
- להעריך את ההשפעות של תרכובות תרופתיות על התנהגות הטסיות.
- לשפר את יעילות מחקרי צבירת טסיות.
שיטות ששימשו
- הכנת ערוצים מיקרופלואידיים עם ציפוי קולגן.
- שימוש במערכת BioFlux לניסויים של זרימה גזירתית מבוקרת.
- צילום ברזולוציה גבוהה של הידבקות טסיות וצבירתן.
- כימות תוצאות באמצעות רכישת נתונים אוטומטית.
תוצאות עיקריות
- חיקוי מוצלח של תנאי זרימה גזירתיים בבדיקות טסיות.
- יכולת תפוקה גבוהה עם דרישות נפח דם מופחתות.
- נתונים כמותיים על אינטראקציות טסיות עם פרמטרים משתנים.
- הוכחת יישומיות הבדיקה לבדיקת תרופות.
מסקנות
- פורמט הצלחת הבאר המיקרופלואידית משפר את מחקרי צבירת הטסיות.
- שיטה זו מספקת תובנות על התנהגות הטסיות בתנאים פיזיולוגיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול פיתוח תרופות ומחקר כלילי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microfluidic flow cell assays for platelet adhesion and aggregation provide physiologically relevant, quantitative data critical for early-stage vascular biology and thrombosis research. By replicating shear flow conditions, these assays enable predictive evaluation of antiplatelet compounds and mechanistic de-risking at the target validation stage. This approach supports portfolio decisions by delivering high-throughput, reproducible insights into platelet function under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of platelet activation pathways under controlled shear flow.
- Supports functional validation of antiplatelet targets using quantitative aggregation metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing compound effects on adhesion versus aggregation.
- Provides predictive confidence for advancing vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assay formats compatible with SBS well-plate workflows.
- Generates reproducible, quantitative outputs for compound screening and IC50 determination.
- Prepares validated biological systems for downstream pharmacological evaluation.
- Enables reliable comparison of inhibitor efficacy across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro platelet function assays with physiological shear conditions relevant to human disease.
- Supports translational biomarker development by quantifying aggregation endpoints under flow.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of antithrombotic agents.
- Reduces biological risk by modeling disease-relevant vascular responses.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic assay bridges early discovery, lead identification, and preclinical evaluation for antiplatelet and vascular biology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for platelet activation and aggregation.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for quantitative inhibitor profiling.
- Analytics: Provides high-resolution imaging and quantitative aggregation measurements for robust data analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant vascular models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for vascular biology and drug screening pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in platelet-targeted programs.
- Operational Value: Standardizes assay conditions and enables high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and antithrombotic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, vascular biology, and quantitative imaging analysis.
- Needs access to automated microfluidic platforms and high-resolution microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup, data acquisition, and analysis protocols.
- May require adaptation for different matrix proteins or flow conditions depending on disease context.
- Limited by blood sample stability and donor variability, necessitating careful experimental planning.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:16
Preparation of the Microfluidic Channels of a BioFlux Plate
4:34
Preparing the Blood with GPIIb/IIIa Inhibitory Antibody
5:41
Running the Flow Cell Experiment on the BF1000 Workstation
8:19
Platelet Adhesion and Aggregation Results
8:58
Conclusion
