Name: הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-27T07:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו שיטת מיקרו-זרימה לבחינת צבירת טסיות דם בתנאי גזירה פיזיולוגיים באמצעות מערכת BioFlux. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי טסיות ופיתוח תרופות ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חלק 1: הכנת הערוצים microfluidic צלחת BioFlux. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הפעלת הניסוי התא זרימה, צריך להכין את ערוצי microfluidic עם ציפוי חלבון של עניין. במקרה זה, קולגן אני ישמשו. כל ערוץ יש מפרצון ולשקע היטב. עבור צלחת זו, כניסת גם הוא עזב גם להאכיל את ערוץ ולשקע גם הוא בצד ימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הקולגן אני (5mg/ml המלאי) ציפוי ריכוז 200μg/ml של חומצה אצטית 0.02M. אחת תצטרך 20μl לכל ערוץ בשימוש. מערבבים על ידי triteration עדין עם טיפ micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של ציפוי על כל ערוץ בהתאמה לשמש. צריך לוותר הנוזל לתוך להקיש הפנימי של משקע גם להאכיל את ערוץ microfluidic עניין באמצעות micropipette. הימנע מציגה בועות, לא לדחוף את האוויר מתוך פיפטה. כלול ערוץ אחד ללא קולגן שליטה לא קולגן (שליטה שלילי הידבקות וצבירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ממשק הצלחת על ידי האצבע הראשונה הידוק 4 ברגים ואז כל פעם הם קבוצה, השתמש הנהג מומנט לחלוטין להדק. הנהג מומנט ילחצו כאשר הוא מגיע אטימות מירבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצב ידני בתוכנה BioFlux, להחיל זלוף לערוצים של ריבית 2dyn/cm 2-משקע היטב. כאן צריך להיזהר אגרוף הפנימי מול להתמלא בנוזל. זה ייקח כמה דקות. אפשר גם לראות את זה להתרחש באמצעות המטרה צריכת חשמל נמוכה על מיקרוסקופ (4X) ולמצוא את כניסת היטב או על ידי מחזיק את הצלחת להסתכל לתוך הבארות כניסת מלמטה. אחת צריך קודם לראות בטיפת נוזל לאט ממלא את האגרוף הפנימית. לאחר אגרוף הפנימי כניסת מלא, זלוף להפסיק בבת אחת על ידי לחיצה להפסיק בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הממשק ולהוסיף 1 מ"ל של PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +) לשקע היטב. התחל זלוף משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS עודף כניסת והן בארות לשקע - אף פעם לא להסיר את נוזל הממלא את האגרוף הפנימית. חסום את הערוצים באמצעות פתרון חסימה (0.5% v / v BSA ב PBS (בתוספת Ca 2 + / Mg 2 +)). הוסף 1 מ"ל של תמיסת חסימת לשקע כל טוב כדי לשמש perfuse משקע היטב 2dyn/cm 2. המשך זלוף במשך 10 דקות. עצור זלוף ולהסיר את הממשק. ערוצי מוכן עד שלב זה יכול לשמש לאורך כל היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הוספת דם, להסיר את נוזל משני צדי הערוץ למעט אגרופים הפנימית. </li></ol> חלק 2. הכנת דם עם נוגדנים GPIIb / IIIa מעכבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הקולגן הוא דוגרים בערוצים, חייבים להכין את כל הדם. אחד צריך לעקוב אחר תקנות biosafety מוכתב על ידי המכון שלו / שלה בעת הטיפול דם אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם אדם טרי (מאדם בצום) להיגרר קרישה ציטרט הנתרן יש להשתמש בתוך 3 שעות של האוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דם על ידי הוספת calcein 4μM PM. הכינו מלאי של 4 מ"מ calcein AM ב DMSO ולהוסיף דם דילול של 1 / 1000 v / נ מערבבים על ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מ"ל של calcein AM שכותרתו דם לתוך 10 - 1.5mL microtubes. הוסף GPIIb / IIIa הנוגדן מעכב זה בדילול הרצוי (המשקל המולקולרי של IgG הוא ~ 150kDa). דוגמה לכך היא סדרת דילול מ 1200nM כדי 9nM וכולל בקרת אין נוגדנים ואת פקד הנוגדן קשור. לשלוט חיובי מצוין עיכוב יהיה ReoPro (abciximab, Eli Lilly) בריכוז של 20ug/ml. Mix ידי היפוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. מערבבים על ידי היפוך עדין כל 10 דקות. </li></ol> חלק 3: הפעלת התא זרימה ניסוי בתחנת העבודה BF1000. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, יש להגדיר את פרוטוקול אוטומטי במודול הבקרה BioFlux. עבור קולגן אני, יש להגדיר פרוטוקול לרוץ 10dyn/cm 2 במשך 10 דקות משקע היטב. בשלב זה, צריך גם להגדיר פרמטרים נתונים הרכישה באמצעות תחנת BF1000, כולל עמדות הערוץ, לתפוס גל FITC ואת זמן לשגות מידע. מומלץ לתפוס 3 בתחומי להציג באמצעות מטרה 10x לערוץ כל 30 שניות על פני משך זמן של 10 דקות בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, 500ul של דם מוכן של כל תנאי לאפיקים מוכן להפריד מקום. אין מקום דם מלאה נוגדנים לתוך ערוץ זה מצופה קולגן זו חסומה עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ממשק על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עבודה BF1000. קלאמפ על הממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע התאמה עומס הצלחת. כמו כן, מהלך הבמה באר אחת המכילה דם. הגדר FTIC ללכוד תמונה הפרמטרים (זמן חשיפה וכו 'לזכות ...). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה BioFlux מונטאז', להתחיל רכישת להתחיל לזרום ורכישת בו זמנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת מתחנת עבודה BF1000, להיפטר צלחת בהתאם להנחיות מוסדיים. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג. הנה פרוטוקול של הידבקות אגרגציה של טסיות דם בערוצים microfluidic הוצג. טיפול מעכב אגרגציה של טסיות דם, anti-GPIIb/IIIa נכלל גם בפרוטוקול. באמצעות ערוצי קולגן מצופה microfluidic של מערכת BioFlux, יש לצפות היווצרות פקיק אגרסיבי לאורך זמן עם דגימת דם לא מטופל מלאה ללא היווצרות פקיק בערוץ ללא ציפוי. באחד הניסויים שבוצעו לאחרונה, הגודל הממוצע של אגרגטים בתנאים השליטה 2000μm 2. באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> הופעל GPIIb / IIIa הוא מתווך חזק של טסיות-טסיות אינטראקציות צבירה ייצוב 1. הדבקה על קולגן מפעיל את מורכבות GPIIb / IIIa לעורר את התגובה הזאת 2. לאחר הדגרה עם anti-GPIIb/IIIa שעה 1 לפני החשיפה גזירה, יש לצפות לצפות לירידה בגודל של thrombi כמו גם ירידה בשכיחות של היווצרות פקיק. התגובה תלויה במינון ניתן לבצע בדרך כלל שנצפה 10dyn/cm 2. איור 2. <img src="/files/ftp_upload/1644/1644fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> הערך 50 IC עבור מעכב המסוים הזה היה 17nM ב 10 dyn / 2 ס"מ. עיכוב מרבית (עבור התורם הזה) לעומת שליטה אין את הנוגדן היה 11% ב 10 dyn / 2 ס"מ. בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+complexity+of+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The growing complexity of platelet aggregation.</a> Blood. 109, 5087-5095 (2007).</li>
<li>Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+GP+IIb-IIIa+complex+induced+by+platelet+adhesion+to+collagen+is+mediated+by+both+alpha2beta1+integrin+and+GP%5BTitle%5D)+AND+%22VI.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP.</a> VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).</li>
</ol>

הכותבים הם עובדי תורם של Fluxion Biosciences.

בעוד שיטות כאן הוצגו באמצעות חלבון מסוים תאי מטריקס ו מעכב ספציפי של אגרגציה של טסיות דם, הפרוטוקול הוא להרחבה ציפויים אחרים, סוגי תאים אחרים מעכבי אחרים עבור מבחני הידבקות התא. המרכיבים המפתח להצלחה של ניסויים כאלה הימנעות בועות ערוצי microfluidic, דילול נכון של כל ריאגנטים ב diluents נכונה, תנאי הדגירה מתאים ריאגנטים בכלל.

<table><tbody><tr><td>collagen I, Bovine</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים של collagen I</td></tr><tr><td>PBS בתוספת Ca/Mg</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-2930 Bottom of Form</td><td>מ-VWR</td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td>ניתן להשתמש גם ב-Calcein AM מ-BD</td></tr><tr><td>מערכת BioFlux 1000</td><td>ריאגנט</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>ליצור קשר עם החברה</td><td></td></tr><tr><td>פלטת BioFlux</td><td>ריאגנט</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>900013</td><td></td></tr><tr><td>antiGPIIb/IIIa</td><td>ריאגנט</td><td>Abcam</td><td>ab33407</td><td>מספר חלופי הוא ab15021</td></tr><tr><td>ReoPro</td><td>ריאגנט</td><td>Eli Lilly</td><td></td><td>במרשם בלבד</td></tr></tbody></table>

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים microfluidic

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

צבירת טסיות דם מתרחשת בתגובה לפגיעה בכלי הדם שבו תאי מטריקס להלן האנדותל נחשף. מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה. חלבונים תאיים, קולגן אני או גורם פון Willebrand מופקדים בתוך הערוץ microfluidic באמצעות זלוף פעיל עם משאבה פנאומטי. חלבונים מטריצה ​​נשטפים אז עם חיץ וחסמו להכין את הערוץ microfluidic עבור אינטראקציות הטסיות. דם שלם שכותרתו עם צבע פלואורסצנטי הוא perfused דרך ערוץ ברמות ספיקה שונים על מנת להשיג ההפעלה אגרגציה של טסיות דם. צבירה של מעכבי טסיות ניתן להוסיף לפני הניסוי תזרים התא לייצר IC50 בתגובה לנתונים מנה.

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

אגרגציה של טסיות דם מתרחשת כמענה לפגיעה כלי דם, שבה נחשפה המטריצה החוץ-תאית שמתחת לאנדותל. ההיצמדות של הטסיות...

מערכת ה-bio flux היא מכשיר אוטומטי והתקן מיקרופלואידי להרצת בדיקות תאים חיים תחת זרימה גזירה (sheer flow) מבוקרת. מערכת זו משתמשת בטכנולוגיית מיקרופלואידיקה של פלטות בארות כדי לשלב התקני תאי זרימה בקנה מידה מיקרוני בתוך פלטות בארות בתקן SBS. ניתן להשתמש ב-BioFlex לביצוע מחקרי היצמדות ואגרגציה של טסיות דם בתפוקה גבוהה ובנפחי דם מופחתים.דם מלא המסומן בצבע פלורסצנטי מתווסף לבארים ולאחר מכן זורם דרך התעלות. תחת זרימה עם מאמץ גזירה מבוקר, מופקים נתוני מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, המכמתים היצמדות ואגרגציה של טסיות דם בנוכחות תרכובות תרופתיות ופרמטרים משתנים אחרים. שלום, אני מייק שוורץ ממעבדת ה-RD ב-Flexion Biosciences.היום נדגים לכם פרוצדורה לשימוש בתאי זרימה מיקרופלואידיים במבדקי היצמדות טסיות דם. אנו משתמשים בפרוטוקול זה במעבדה שלנו למגוון של מבדקים בביולוגיה של כלי הדם. אז בואו נתחיל.לפני ביצוע ניסוי תא הזרימה, יש להכין את הערוצים המיקרופלואידיים של פלטת ה-bio flux באמצעות ציפוי חלבון רלוונטי; בניסוי זה יעשה שימוש ב-collagen one. כל אחד מ-24 הערוצים הניסויים של פלטת ה-bio flux מחובר לבאר כניסה ולבאר יציאה של הפלטה. באר הכניסה היא הבאר השמאלית המזינה את הערוץ, ובאר היציאה נמצאת מימין; יש לדלל את תמיסת ה-collagen one לריכוז של 200 µg/mL.בחומצה אצטית 0.02 מולרית, יידרשו 20 µL עבור כל תעלה בשימוש. מכיוון שניסוי זה דורש 11 תעלות, הכין 200 µL של ציפוי קולגן. תעלה אחת נותרת ללא ציפוי ומעורבבת על ידי חזרות עדינות עם קצה של מיקרופיפטה.הוסף 20 µL של ציפוי לכל תעלה בהתאמה, באמצעות מיקרו-פיפט, על ידי הזרקה של הנוזל לחור הפנימי של הבאר. הזן את התעלה המיקרופלואידית הרלוונטית כפי שמוצג כאן עם הצבע הצהוב; כלול תעלה אחת ללא קולגן כביקורת שלילית להיצמדות ולסכיריות של טסיות דם. לאחר הוספת ציפוי הקולגן לכל התעלות הרלוונטיות, חבר את הממשק לצלחת.אם אתם משתמשים בממשק bio flux 1000, ניתן לסגור את שני התפסים על הבמה. אם אתם משתמשים בממשק Bio flux 200, הדקו תחילה את ארבעת הברגים. לאחר שכולם מקובעים, השתמשו במפתח מומנט כדי להדק אותם באופן מלא.מפתח המומנט ישמיע נקישה כאשר יגיע למקסימום. באמצעות מצב העבודה הידני בתוכנת ה-bio flux, יש להחיל פרפוזיה לערוצים הרלוונטיים ב-2D לסמ"ר מהיציאה. נשתמש בעדשה בעוצמה נמוכה במיקרוסקופ כדי למצוא את באר הכניסה ולצפות במילוי הנוזל בנקב הפנימי הנגדי.ראשית, עליך להבחין בכמות קטנה של נוזל הממלאת באיטיות את הpunch הפנימי לאחר מספר דקות; כאשר הpunch הפנימי של פתח הכניסה מלא, הפסק את הזרימה בכל הערוצים על ידי לחיצה על stop בתוכנה. דגרי את הפלטה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. במהלך תקופת דגירה זו, ניתן להתחיל בהכנת הדם השלם לקראת סיום שעת הדגירה.לאחר הכנת הדם, הסר את הממשק והוסף מיליליטר אחד של PBS בתוספת יוני סידן ומגנזיום לבאר היציאה. התחל פרפוזיה מבאר היציאה בקצב של 2 dyn/cm² והמשך בפרפוזיה במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הפסק את הפרפוזיה. לאחר הסרת הממשק, הסר את עודפי ה-PBS הן מבאר הכניסה והן מבאר היציאה.אין להסיר לעולם את הנוזל הממלא את הpunch הפנימי. כדי לחסום את התעלות, יש להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה לכל פתח יציאה. יש לבצע פרפוזיה מהבאר של פתח היציאה בקצב של two dine per centimeter squared ולהמשיך בפרפוזיה למשך 10 דקות.הפסיקו את הזרימה לאחר 10 דקות והסירו את הממשק. התעלות מוכנות כעת וניתן להשתמש בהן לאורך היום בזמן שהפלטה מצופה בקולגן. במהלך דגירה של שעה אחת, יש להכין דם אנושי טרי מאדם בצום לצורך דימוי והזרמה לתוך הפלטה.יש לדמות דם לתוך נתרן ציטראט, נוגד קרישה, ולהשתמש בו תוך שלוש שעות מרגע האיסוף. ראשית, הוסף תמיסת סטוק של calcium M בריכוז 4 mM ב-DMSO לדם בדילול של 1:1000 נפח לנפח. כדי להגיע לריכוז של 4 µM של calcium am, ערבב באמצעות הפיכה עדינה של המבחנה.בשלב הבא, העבירו 1 mL של דם המסומן בסידן אל עשרה מיקרו-מבחנות בנפח 1.5 mL. הוסיפו לכל מבחנה נוגדן מעכב GP2B3 בדילול הרצוי. הקפידו לכלול ביקורת שלילית ללא נוגדן וביקורת חיובית עם נוגדן לא קשור, וערבבו באמצעות היפוך עדין.דגרו את המבחנות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך ערבוב על ידי היפוך עדין מדי 10 דקות לפני ביצוע ניסוי תא הזרימה. יש להגדיר פרוטוקול אוטומטי במודול הבקרה של bio flux עבור קולגן.שלב אחד. הגדירו פרוטוקול להזרמת הדם בקצב של עשרה תשעה סנטימטרים רבוע למשך 10 דקות מהפתח.כעת יש להגדיר את פרמטרי רכישת הנתונים בתחנת העבודה BioFlex 1000, הכוללים את מיקומי הבמה הרצויים, רכישה באורך גל מתאים והגדרות Time-lapse. תוכנית רכישת תמונות טיפוסית עבור פרוטוקול זה תכלול שדה ראייה אחד לכל ערוץ שיילכד באמצעות עדשה של 10x כל 30 שניות, לאורך משך זמן כולל של 10 דקות. ניתן להגדיר גם שדות ראייה נוספים והגדרות TimeLapse חלופיות.לאחר שהגדרת את הפרוטוקול האוטומטי ואת פרמטרי רכישת הנתונים, חזור לפלטת ה-BioFlex והסר את הנוזל משני צדי התעלה, למעט מהחורים הפנימיים. תוך הקפדה על עבודה מהירה, הזרק 500 µL דם מכל תנאי ניסוי לבארי המוצא של כל תעלה. שים לב כי בארי המוצא משמשים להגשת הדם מכיוון שזהו המסלול הקצר ביותר לאזור הצפייה, דבר שיאפשר תגובה מיידית יותר של הדם לציפוי הקולגן.בנוסף, העבירו את דם הביקורת ללא הנוגדן לתעל אחת המצופה בקולגן ולתעל אחת שעברה חסימה בלבד. הניחו את הפלטה על מיקרוסקופ תחנת העבודה BioFlex 1000 והדקו אותה לממשק. בצעו את כיול רשימת הבמה על ידי איתור נקודת הכיול הראשונה, המוגדרת כנקודת הראשית.לאחר מכן, אתר וסמן את נקודת הכיול השנייה. החל את הכיול הזה על רשימת השלבים המתאימה. פעולה זו מבטיחה שניתן יהיה למצוא באופן אוטומטי את כל מיקומי הצפייה על הפלטה.הזז את הבמה לאחד הערוצים המכילים דגימות דם, והגדר את פרמטרי לכידת התמונה, כגון זמן חשיפה והגבר (gain), בתוכנת ה-BioFlex montage. הפעל את תזרים העבודה המתאים על ידי לחיצה על הכפתור הרצוי. פעולה זו תפעיל את פרוטוקול הזרימה ואת רכישת התמונות בו-זמנית.בסיום הניסוי, הוצא את הפלטה מתחנת העבודה BIOFLU 1000 והשלך אותה בהתאם להנחיות המוסדיות. השתמש בתעלות מיקרופלואידיות מצופות קולגן של מערכת ה-bio flux. ניתן להבחין ביצירה נמרצת של קריש דם עם הזמן בדגימת דם של ביקורת לא מטופלת.לעומת זאת, לא נצפתה התגבשות של קריש בתעלה שאינה מצופה. בניסוי שבוצע לאחרונה, הגודל הממוצע של הצברים בתנאי בקרה היה 2000 micrometer squared. GP IIbIIIa הוא מתווך עוצמתי של אינטראקציות בין טסיות דם ובייצוב אגרגציה כאשר הוא מופעל על ידי היצמדות לקולגן; כפי שמוצג כאן, לאחר אינקובציה עם נוגדן anti-GP IIbIIIa למשך שעה אחת לפני החשיפה למסחור (shear), נצפתה ירידה בגודל הקרישים וכן ירידה בתדירות היווצרותם.בדרך כלל ניתן להבחין בתגובה תלוית מינון ב-10 dine cm², וערך ה-IC 50 עבור מעכב זה היה 17 nM. העכבה המקסימלית לתורם זה בהשוואה לבקרת ללא נוגדנים הייתה 11% ב-10 dine cm². פלטת 48 בארות למסhear גבוה זמינה גם היא להרצת ניסויי דם מלא עד 200 D per cm² או 5,000 s⁻¹.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשתמש בערוצי זרימה מיקרופלואידיים לביצוע ניסויי ביולוגיה וסקולרית רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור לדלל את הקולגן בבופר הנכון. השתמשו תמיד בטכניקת פיפטינג נכונה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר, ופעלו תמיד בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית של המעבדה שלכם.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

platelet-adhesion-aggregation-under-flow-using-microfluidic-flow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת זרימה למינרית כדי לאפיין את האינטראקציה של לויקוציטים ושותפים תאיים כגון תאי אנדותל. שיטה זו מספקת תובנות דינמיות על הידבקות, deadhesion, ו transmigration של לויקוציטים כאשר מחוררים על שכבה שלמה ו confluent של תאים וסקולריים.

בדיקה מבוססת זרימה למינרית לחקר האינטראקציות בין לויקוציטים ותאי אנדותל

תאי זרימה המשמשים בניסויי הידבקות מורכבים בדרך כלל ממסלולי זרימה ליניאריים ודורשים ניסויים מרובים בקצבי זרימה שונים כדי ליצור מפת הידבקות גזירה.  SynVivo-SMN מאפשר יצירת מפת הידבקות גזירה באמצעות ניסוי יחיד תוך שימוש בנפחי מיקרוליטר וכתוצאה מכך חיסכון משמעותי בזמן ובחומרים מתכלים.

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

שיטה של ​​quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

עירוי טסיות דם והמוסטזיס עוצבו באמצעות בנייה מחדש של דם ותאי זרימה מיקרופלואידיים כדי לחקור את תפקוד טסיות הדם. הנתונים מדגימים את ההשלכות של נגע אגירת טסיות דם על המוסטזיס, במבחנה.

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

מסופק פרוטוקול מפורט להדמיית טסיות נודדות בודדות באמצעות קשירה של אבידין-ביוטין מתפקדת RGD עם צפיפות ניתנת לכוונון, וחושף כי טסיות הדם מייצרות מספיק כוח כדי לקרוע את הקשר אבידין-ביוטין.

מבחן במבחנה לחקר נדידת טסיות הדם באמצעות קשירה של אבידין-ביוטין מתפקדת RGD

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

למדו שיטת מיקרו-זרימה לבחינת צבירת טסיות דם בתנאי גזירה פיזיולוגיים באמצעות מערכת BioFlux. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי טסיות ופיתוח תרופות ביעילות גבוהה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

גלה סרטונים נוספים