Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את רמת הקולוקליזציה של חיידקים מופנמים, RIA Meningitidis עם חלבון השלד הציטו-שלד אלפא אקטינין. זה מושג על ידי הדבקת תאים מיקרו-וסקולריים במוח אנושי בתרבית לילה של חיידקים למשך שלוש עד שמונה שעות כדי לאפשר לחיידקים להיכנס לתאי המטרה. כשלב שני תאים עם חיידקים תוך-תאיים נשטפים, מקובעים ואז חודרים, מה שמכין את התרבית הנגועה לצביעה חיסונית של חיידקים מופנמים ואלפא אקטינין תוך תאי.

בעקבות הדמיה קונפוקלית ויישום של תוכנת קולוקליזציה, ניתן לצפות בתמונות של הקולוקליזציה התוך-תאית ולקבל תוצאות כמויות המראות כי קרוצ'י מנינגה מבטא OPC וגם חלבון ממברנה יכול לקיים אינטראקציה ספציפית עם אלפא אקטינין תוך תאי בהתבסס על הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית ועל ידי ניתוח קולוקליזציה כמותית. היי, אני איסל מריה ממעבדת TI של פרופסור מאטה במחלקה לרפואה מולקולרית תאית באוניברסיטת ברי. היום נראה לכם נוהל להערכת רמת הקול, היחס בין חיידקים תוך-תאיים לחלבוני שלד תאים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציה של דלקת קרום המוח בתפטיר המבטא חלבון ממברנה אוטומטית OPC עם חלבון השלד הציטו-שלד אלפא אקטין. אז בואו נתחיל. עבודה זו צריכה להיעשות במעבדת בטיחות נאותה.

יומיים לפני הליך הצביעה החיסונית, יש לחסן את הכתם החיידקי המעניין בעירוי לב המוח. צלחות אגר בתוספת 10% דם סוס מחומם גדלות בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ביום שלפני הצביעה החיסונית. השתמש בלולאת תרבית של 10 מיקרוליטר כדי ליצור השעיה של תרבית החיידקים הלילה.

בשני מיליליטר PBSB, השאירו את המתלה לעמוד חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לאגרגטים חיידקיים גדולים להתיישב. לאחר מכן, העבירו את המיליליטר העליון של התרחיף לתוך צינור סטרילי מבלי להפריע לגלולה להמיס חיידקים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 1%SDS 0.1 נתרן הידרוקסיד מולארי לשני בקבוקונים המכילים 20 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים ולהפוך את הצינור לערבוב. להעריך את מספר החיידקים.

מדוד את תכולת חומצת הגרעין על ידי קביעת ספיגת התמיסה. ב-216 קרנים מכוונים את תרחיף החיידקים לצפיפות הנדרשת במדיום הזיהום כדי להדביק את תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים במוח האנושי. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח אנושי או H-B-M-E-C-A שנזרעו יומיים לפני הצביעה החיסונית הניחו כיסוי זכוכית של 16 מילימטר לתוך הבארות של צלחת 12 בארות וזרעים ים HBME ב-50% מפגש על החלקות הכיסוי דגרו לילה ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ביום שלמחרת.

הדביקו תאים בתרחיף החיידקים הטרי שהוכן במעבדה שלנו. יחס זיהום של 200 עד 300 יחידות יוצרות מושבה לכל תא מטרה משמש באופן שגרתי. דגירה במשך שלוש עד שמונה שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני בסוף תקופת ההדבקה.

שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS וקיבעו 500 מיקרוליטר של 2% פרה פורמלדהיד למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר לאחר שטיפת הפרא פורמלדהיד, חלחל את התאים הקבועים של הפרלדהיד על ידי דגירה ב-0.1% טריטון X 100 מדולל ב-PBS למשך 10 דקות. לבסוף שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS והמשיכו לצביעה החיסונית כפי שמוצג. לאחר מכן ניתן לבצע צביעה של חיידקים תוך-תאיים ו-dfor actinin בו זמנית.

ב -12 לוחות באר חוסמים את החלקות הכיסוי המכילות את התאים החדירים עם 500 מיקרוליטר של 3% B-S-A-P-B-S-T למשך 30 עד 60 דקות. בטמפרטורת החדר לאחר שטיפה עם העברת PBS, כל כיסוי מחליק לבאר יבשה חדשה בצלחת 12 הבארות בנוגדנים העיקריים נגד חיידקים ואלפא אקטינין בו זמנית מספיקים 80 עד 100 מיקרוליטר נוגדנים לכל החלקת כיסוי אם מוסיפים בזהירות כדי לכסות את פני השטח של החלקת הכיסוי, לדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר בסוף הדגירה, הוסף 200 מיקרוליטר PBS לבאר, הרם היטב את תלוש הכיסוי והנח אותו בבאר חדשה המכילה 500 מיקרוליטר PBS לאחר חמש דקות, הסר את ה-PBS על ידי פיפטינג ולאחר מכן הוסף PBS טרי. חזור על הפעולה פעמיים והעביר את החלקות הכיסוי לבאר יבשה חדשה.

לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים המשניים המתאימים המצומדים לפלואורוכרומים שונים המדוללים ב-1% B-S-A-P-B-S-T דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך בסוף הדגירה הכביסה מוצגת קודם לכן ואז הכתמת DNA עם DPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך בסוף הדגירה הזו שטיפה את הכיסוי מחליק ב-PBS פעם אחת ולאחר מכן הרכבה עם טיפת הרכבה. יש לאחסן פתקי כיסוי בינוניים בחושך עד שהם מוכנים לתצפית. תחת המיקרוסקופ, אנו צופים ומצלמים תמונות של הדגימות המסומנות במערכת החיסון שלנו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי הפוך.

כדי להתחיל את הליך ה-CLSM בטיפת טבילה למטרה ולהניח את מכסה שקופית הדגימה, להחליק למטה על במת המיקרוסקופ, לכוון את המיקרוסקופ למצב חזותי ולמצוא את אזור העניין באמצעות חלקי העיניים של המיקרוסקופ, אנו מוכנים כעת להשתמש בתוכנת Leica. בחר את מצב רכישת XY zed. בחר בפורמט חמש 12 על חמש 12 למחקרי לוקליזציה.

ככל שהרזולוציה גבוהה יותר, כך התמונה מדויקת יותר. לאחר מכן בחר במצב X דו-כיווני, שיגביר את מהירות הסריקה ויעזור להפחית את הלבנת התמונה. הגדר הגדרות סריקה רציפה.

לחץ על הפונקציה SEC ולאחר מכן בחר בין השורות. בחר קרני לייזר בהתאם לפלואורוכרומים המצומדים לנוגדנים המשניים. 4 0 5 ננומטר עבור DPI 4 88 ננומטר עבור Alexa, פלואור 4 88 ו-5 61 ננומטר.

עבור trixy הפעל את שפופרת מכפיל הפוטו אחת, שתיים ושלוש בהתאמה. הגדר את החלק העליון והתחתון של ערימת Z או סדרה. הסט הבא, גודל צעד Zed ל-0.2 מיקרומטר.

RIA Mencius הוא דיפלו אוקוס ומכיוון שלכל שדולה יש קוטר משוער של 0.5 מיקרומטר, גודל מדרגת Z של 0.2 מיקרומטר מגדיל את ההסתברות לסרוק כל שדולה לפחות פעמיים. הגדר את פרמטרי הסריקה הסופיים על ידי בחירת ממוצע קו של שלושה כדי לשפר את יחס האות לרעש על ידי לחיצה על התחל. תמונות מוכתמות כפולות או משולשות מתקבלות על ידי סריקה רציפה באורכי גל שונים ועל ידי שימוש במצב בין קווים עבור כל ערוץ כדי למנוע דיבור צולב בין הכרומופורים השונים.

לקבלת אינדיקציה לקולוקליזציה של שני פלואורוכרומים, בחר את פונקציית הכיסוי כדי למזג ערוצים נבחרים לתמונה אחת. לדוגמה, כאשר גם Alexa 4 88 וגם trissy Fluor Chromes ממקמים צבע צהוב יופיעו בתמונה השכבת-על עבור שחזור דו-ממדי הנדרש להמחשת קומפיליזציה אפשרית של מחסנית או סדרה של Zed באמצעות פונקציית ההקרנה המקסימלית. לאחר רכישת מחסנית ה-Z או הסדרה, עבד את הנתונים שלך כדי לקבל תמונה אורתוגונלית להדמיה של לוקליזציה תוך-תאית של אלמנטים שונים.

כימות הקולוקליזציה מתבצע באמצעות תוכנת Vol City מאספקת IMP. כדי להתחיל ליצור ספרייה עם תמונות CLSM, בחר מיקוד מורחב מהתמונה בסרגל העליון. כלי זה ישלב את Zacks בתמונה דו-ממדית לניתוח.

כעת בחר את כלי הלוקליזציה. שני הערוצים שיש לנתח צריכים להיות בעלי עומק צבע זהה. בחר את האזור שעומד להיות מכומת.

הגדר את הסף להסרת כל רקע. צור פלט לוקליזציה משותפת על-ידי בחירה באפשרות צור לוקליזציה משותפת. סטטיסטיקת לוקליזציה תיווצר עבור אזורי העניין שנבחרו קודם לכן.

לאחר מכן, בחר את מקדמי המנדר R ו-ny. לבסוף, ייצוא או סטטיסטיקה של ערכים למסמך אקסל להצגת נתונים המוצגים כאן תוצאות הדמיה קונפוקליות מייצגות של תאי אנדותל במוח אנושי הנגועים במנינגה קוקאיי במשך שמונה שעות. מיקום החיידקים מוצג באדום.

בעוד שהמיקום של אלפא אקטינין מוצג בירוק, חיצים מציינים אזורים שבהם נראה כי התרחשה רמה גבוהה של הצטברות אלפא אקטינין סביב חיידקים. בתמונת שכבת-על זו, ישנם מספר אזורים שבהם מופיע צבע כתום צהוב המרמז על קו-לוקליזציה בין מנינגה אוצ'י לאלפא אקטינין. בתמונה הבאה, דיסקציה אופטית של חד-שכבת H-B-M-E-C נגועה מצביעה על קולוקליזציה סביב חיידקים תוך-תאיים הממוקמים בבסיס התא.

כאשר עובדו תמונות תלת מימדיות של חד-שכבות H-B-M-E-C נגועות, מבט אלכסוני של המשטח האפיקלי מראה חיידק דוראנט צבוע באדום המסומן על ידי החץ האדום שבו מספר חיידקים ממוקמים לעבר משטחי הבסיס של תאי אנדותל המסומנים על ידי החץ הצהוב. ניתן לראות בבירור מיקום בסיסי בצבע כתום וצהוב בחתך אנדון XZ זה. בניגוד לרחוק, ניסויי אקטינין שבהם בוצע תיוג של חיידקים מופנמים ומנטון או אקטין מגלים מדי פעם קולוקליזציה עם אקטין אך קולוקליזציה נדירה עם תסיסה בתאי H-B-M-E-C.

כפי שנצפה בניסויים הקודמים, רטין היה מרוכז סביב מספר חיידקים מופנמים שצוינו על ידי החיצים הלבנים. הנתונים נותחו גם כדי להשיג חפיפה יחסית. מקדם R, שלפי מנדה, מייצג את המידה האמיתית של קולוקליזציה IE, מספר הפיקסלים שמתמקמים יחד בהשוואה למספר הכולל של פיקסלים וערכי NY עבור אלפא אקטינין, מנטינג ואקטין בסך הכל ב-H-B-M-E-C נגוע ב-OPC המבטא מנינגוקוקים, הושגה חפיפה של יותר מ-25% של רסן במנינגוקוקים.

המקדם ו-Y הוא מדד לתדירות של מטבע של אות הרסן הנפוץ יותר בכל פעם שמתרחש אות קקאו מנינגה פחות שופע. מדד זה מראה רמה מרשימה של התרחשות אלפא אקטינין בקרבת קוקאיי מנינגה מופנם. אנו רק מראים לכם כיצד לדמיין ולכמת החדרה של חיידקים מופנמים עם אלמנטים של שלד תא בתוך הניסוי הזה.

חשוב לזכור לעקוב אחר פרוטוקולי הקיבוע והגבעול החיסוני בקפדנות כדי לשמור על שלמות המבנים ולהימנע מרקע גבוה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.